王佳穎，花文婷，余　丹

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心，江蘇 南京210023)

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云南紅豆杉中紫杉烷類二萜成分化合物的遺傳毒性研究

王佳穎，花文婷，余丹

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心，江蘇 南京210023)

摘要目的：研究云南紅豆杉中四種紫杉烷類二萜成分化合物(2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸)的安全性。方法：采用Alarmblue檢測(cè)采用四種紫杉烷類二萜成分化合物在CHL細(xì)胞上的細(xì)胞毒性，采用CHL細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)和Ames試驗(yàn)，觀察云南紅豆杉中四種紫杉烷類二萜成分化合物遺傳毒性作用。結(jié)果：四種紫杉烷類二萜成分化合物在CHL細(xì)胞株上IC50>0.5 mg/mL；未對(duì)鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸缺陷型菌株回復(fù)突變數(shù)產(chǎn)生影響；未使得CHL染色體畸變率增加。結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，未觀察到2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に釋?duì)CHL細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性以及未觀察到體外遺傳毒性。

關(guān)鍵詞遺傳毒性；云南紅豆杉；紫杉烷類二萜成分

紫杉醇是現(xiàn)有的抗癌天然藥物中療效最好、最具潛力的藥物之一。由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制而倍受世人關(guān)注[1]，由此引發(fā)了人們對(duì)紅豆杉屬(Taxus)植物的研究熱潮。到目前為止化學(xué)家們已從紅豆杉屬植物中分離出紫杉烷類二萜化合物300多個(gè)。云南紅豆杉是我國(guó)特有樹種，自1990年張宗平等[2]報(bào)道其化學(xué)成分以來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究，到目前為止已從云南紅豆杉的各個(gè)部位分離得到紫杉烷類二萜100多個(gè)，由于云南紅豆杉中紫杉醇含量較高，已成為提取紫杉醇的主要原料，同時(shí)也被加工成為中藥飲片。然而對(duì)于云南紅豆杉的研究現(xiàn)多集中于其化學(xué)成分的研究[3-4]，對(duì)于其中除紫杉醇外的其他紫杉烷類二萜化合物的藥理毒理學(xué)研究相對(duì)較少，隨著紫杉烷類抗腫瘤藥物研究的深入，對(duì)于其他紫杉烷類二萜化合物的毒理學(xué)研究顯得尤為迫切和必要。

遺傳毒理學(xué)是研究化學(xué)物質(zhì)和物理因子對(duì)機(jī)體遺傳物質(zhì)的作用，闡明遺傳毒物對(duì)機(jī)體健康造成的后果以及作用機(jī)制，為保護(hù)人體健康安全提供科學(xué)依據(jù)的一門毒理學(xué)分支學(xué)科。

而目前，許多國(guó)家和國(guó)際機(jī)構(gòu)都高度重視化學(xué)物(藥物)的致突變性，并充分認(rèn)識(shí)到其在遺傳性疾病和癌癥發(fā)生中的重要性。國(guó)家的有關(guān)政策法規(guī)也高度重視化學(xué)物(藥物)致突變性，并且陸續(xù)頒布的有關(guān)食品、藥物、農(nóng)藥以及醫(yī)療用品安全性藥理學(xué)評(píng)價(jià)程序中都將致突變性研究作為一項(xiàng)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[5- 6]。因而研究與探討云南紅豆杉中紫杉烷類二萜成分的遺傳毒性在紫杉烷類抗腫瘤藥物研究開發(fā)、云南紅豆杉飲片質(zhì)量及安全性控制中具有極其重要的意義。

按照ICH指導(dǎo)原則的要求，并根據(jù)大量的文獻(xiàn)調(diào)研[7-9]，本研究通過(guò)體外細(xì)菌突變實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)試圖在體外水平對(duì)已得到的云南紅豆杉中紫杉烷類化合物2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧、巴寧亭酸進(jìn)行遺傳毒性的研究和評(píng)價(jià)，為云南紅豆杉飲片質(zhì)量與安全性控制提供理論基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1受試藥物

2-deacetoxytaxinineE(2-去乙酰氧基紫杉寧E); 7-deacetoxytaxinineJ( 7-去乙酰氧基紫杉寧J); 2-deacetoxydecinnamoyltaxinineJ(2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝嶫);baccatin3 (巴寧亭酸)均由江蘇省食品藥品檢驗(yàn)監(jiān)督研究院制備提取。分別用DMSO溶解，制備成1mmol/L儲(chǔ)存液，臨用前用生理鹽水稀釋成所需濃度。

1.2試劑和藥品

二甲基亞砜，DMSO，Amresco0231 - 100mL；疊氮鈉，LotNo.404C057，CAS：26628-22-8，含量≥98%，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；敵克松，LotNo.4030165-A，CAS：140-56-7含量≥98%，AccuStandard；2-氨基芴，LotNo.10139040，CAS：153-78-6，含量≥98%，AlfaAesar；1,8-二羥基蒽醌，LotNo.LC60P31，CAS：117-10-2，含量≥98%，北京百靈威科技有限公司；絲鏈霉素，LotNo. 130438-200502，CAS：57-92-1，含量99.6%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；環(huán)磷酰胺，LotNo. 100234-200502，CAS：50-18-0，含量99.6%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；β-萘黃酮，LotNo.10159729，CAS：6051-87-2，含量≥98%，AlfaAesar；秋水仙堿，LotNo.C22H25NO6，CAS：64-86-8，含量≥98%，BioSharp；NADP，LotNo.B0014K061100，BioSharp；G6PC，LotNo.SLBL0293V,Sigma; 改良型1640培養(yǎng)基(RPMI-1640)，LotNo. 1590348，Gibco；0.25% 胰酶(Trypsin-EDTA)，LotNo. 25200056，Gibco；雙抗(PenStrep)，LotNo. 1568586，Gibco；四季青胎牛血清，LotNo. 150211，浙江天杭生物科技有限公司。Alarmblue，Lot：156450SA，InvitrogenUSA；Hepes，LotNo. 513C0412，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；瓊脂粉，LotNo.402H0324，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；L-組氨酸，LotNo.1018A0518，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；檸檬酸，LotNo. 225A046，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；牛肉膏，LotNo. 20150615，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；結(jié)晶紫，LotNo. 125C044，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；蛋白胨，LotNo. 603B054，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；NaNH4HPO4·4H2O，LotNo. 20150812，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；Na2HPO4·12H2O，LotNo. 20150721，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；K2HPO4·3H2O，LotNo. 20150721，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；C6H12O6，LotNo. 405A0920，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；氨芐青霉素，LotNo. 104D0319，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；D-生物素，LotNo. 911A0420，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；四環(huán)素，LotNo. 1104B0416，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；NaCl，LotNo. 10019318，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸，LotNo. 20150326，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙三醇，LotNo. 20130913，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，LotNo. 14081911787，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.3儀器

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，IC1000，上海睿鈺生物科技有限公司；自動(dòng)菌落分析儀，Protocol3，SYNBIOSIS；二氧化碳培養(yǎng)箱，HERAcell150i，德國(guó)Thermo；微生物培養(yǎng)箱，IMH180，德國(guó)Thermo；搖床，MaxQ4450，德國(guó)Thermo；高速冷凍離心機(jī)，ALLEGRAX-15R，美國(guó)BACDMAN；TS100倒置顯微鏡，ITS100，日本Nikon；酶標(biāo)儀，瑞士帝肯，M1000PRO。

1.4細(xì)胞及培養(yǎng)

CHL細(xì)胞株，由江蘇省食品藥品檢驗(yàn)監(jiān)督研究院提供。培養(yǎng)基為含有10%的四季青胎牛血清的RPMI-1640，置于5%二氧化碳，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5菌株

實(shí)驗(yàn)選用TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株進(jìn)行試驗(yàn)，菌株由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心提供。正式實(shí)驗(yàn)之前，需對(duì)試驗(yàn)擬用的五種鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株進(jìn)行了組氨酸需求試驗(yàn)、抗氨芐青霉素試驗(yàn)、結(jié)晶紫敏感試驗(yàn)、紫外線敏感試驗(yàn)、抗四環(huán)素試驗(yàn)和自發(fā)回變?cè)囼?yàn)。 結(jié)果顯示: 各種菌株的特性正常，自發(fā)回復(fù)突變數(shù)均在正常范圍內(nèi)。因此，各菌株基因型均符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.6動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠5只，雄性，體重200～220g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2013-0006。動(dòng)物合格證編號(hào)：2010002604205。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2014-0003。飼養(yǎng)溫度：20～26 °C；濕度：40%～70%；換氣次數(shù)8～10次/小時(shí)；工作照明：100～200lx，動(dòng)物照明：15～20lx，明暗交替12小時(shí)；噪音：≤60dB；氨濃度<20mg/kg；落下菌數(shù)：≤3CFU/0.5h·90mm平皿。飼養(yǎng)條件符合飼養(yǎng)條件符合國(guó)標(biāo)GBl4922. 2—2001。

2統(tǒng)計(jì)方法

各組計(jì)量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。采用GraphPadPrism5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組間采用Student’sTest。多組間比較采用單因素方差分析法(One-wayANOVA)及Dunnett法。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1S9制備

采用苯巴比妥和β-萘黃酮作為誘導(dǎo)劑制備S9[10-12]，苯巴比妥和β-萘黃酮經(jīng)灌胃給藥，劑量均為80mg/kg，連續(xù)3天。處死前16小時(shí)停止飲食，自由飲水。動(dòng)物斷頭處死后動(dòng)物斷頭處死后，令血液流盡，剝?nèi)テっ?，在無(wú)菌及4℃條件下進(jìn)行下列步驟操作：用冰凍的0.15mol/LKCl溶液從門靜脈處注入肝臟，以沖洗肝臟。摘取肝臟，按每克肝重加3mL冰冷的0.15mol.L-1KCl液勻漿，0～4℃條件下，9 000×g，10min，過(guò)濾取上清液。分裝并于-80℃保存?zhèn)溆茫颗鶶9勻漿應(yīng)在完全培養(yǎng)基上做無(wú)菌試驗(yàn)。

3.2IC50測(cè)定

CHL以1 000個(gè)細(xì)胞每孔種于386孔板黑色底透的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1000個(gè)細(xì)胞，每孔45μL。孵育24h后，加入不同濃度2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸，再孵育24h后，每孔加入5μL的Alarmblue，6小時(shí)后測(cè)定熒光強(qiáng)度，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，激發(fā)波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射波長(zhǎng) 590nm。

3.3染色體畸變實(shí)驗(yàn)

將指數(shù)生長(zhǎng)的CHL細(xì)胞接種在75mL的培養(yǎng)瓶中, 細(xì)胞濃度為3×104/mL，每瓶接種5mL，共接種32瓶，培養(yǎng)24 小時(shí)后給藥。試驗(yàn)組共分兩部分，不給S9組和給予S9組，均包括2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸高中低三個(gè)劑量組，劑量分別為0.5mg/mL、0. 25mg/mL和0.125mg/mL，陰性對(duì)照組(生理鹽水)和陽(yáng)性對(duì)照組。其中不給予S9組陽(yáng)性藥為絲裂霉素，藥物劑量為0.4μg/mL；給予S9組陽(yáng)性藥為環(huán)磷酰胺，藥物濃度為20μg/mL。不給予S組加入藥物后培養(yǎng)24小時(shí)。給予S9組，給藥后培養(yǎng)4小時(shí)后用PBS洗滌細(xì)胞3次，重新加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24小時(shí)。終止培養(yǎng)前4小時(shí)，于5mL全培養(yǎng)液中加0.1mL秋水仙堿稀釋液，秋水仙堿終濃度為0.2μg/mL。隨后終止培養(yǎng)，每瓶分別取細(xì)胞培養(yǎng)液制作染色體玻片標(biāo)本，各組觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞，計(jì)數(shù)其染色體畸變率。試驗(yàn)重復(fù)1次。

3.4Ames實(shí)驗(yàn)

采用平板摻入法進(jìn)行試驗(yàn)，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸分別設(shè)5個(gè)劑量組，劑量分別為0.05、0.015 8、0.005、0.001 58、0.000 5mg/皿，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，平行做加S9和不加S9試驗(yàn)。37 ℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)各平扳菌落數(shù)并算出均值，試驗(yàn)重復(fù)1次。陽(yáng)性對(duì)照組藥物及給藥劑量見(jiàn)表1。

表1　Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物及給藥劑量

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1IC50結(jié)果

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸在藥物可溶解的最高劑量0.5mg/mL均未對(duì)CHL細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此，我們認(rèn)為此四種物質(zhì)均無(wú)細(xì)胞毒性。因此，后續(xù)染色體畸變?cè)囼?yàn)以及Ames試驗(yàn)均已藥物可溶解的最高濃度作為給藥的高濃度劑量。

4.2染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果

染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果如經(jīng)檢測(cè)，未給予S9組，溶劑對(duì)照組染色體畸變率為1%，絲裂霉素組(0.4μg/mL)染色體畸變率為39%；而給予S9組，溶劑對(duì)照組染色體畸變率為1%，環(huán)磷酰胺組(20μg/mL)染色體畸變率為32%；結(jié)果表明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。而各試驗(yàn)組染色體畸變率均小于5%，呈陰性結(jié)果。表明，在該試驗(yàn)條件下，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸對(duì)CHL細(xì)胞染色體無(wú)致畸作用。

表2　染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

注：P(Polyflod)多倍體、G(Gap)裂隙、B(BREAK)斷裂、R(環(huán))RING、E(EXCHANGE)交換、O(Otheraberrations)；畸變率<5，陰性(-)；畸變率>5，陽(yáng)性(+)；畸變率>20，陽(yáng)性(++)。

4.3Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3～6所示。陽(yáng)性藥的菌落數(shù)均高于陰性對(duì)照組自發(fā)回復(fù)突變數(shù)2倍以上，表明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠。2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に峤o藥組的菌落數(shù)與陰性對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異。表明在試驗(yàn)條件下，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸均未對(duì)鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株的回復(fù)突變數(shù)產(chǎn)生影響。

5結(jié)論和討論

紫杉醇抗腫瘤作用靶點(diǎn)為微管蛋白，幫助微管蛋白二聚體裝配成微管，并阻止其解聚而穩(wěn)定微管，從而抑制細(xì)胞有絲分裂[13-14]。微管是細(xì)胞骨架重要的組成部分，起到維持細(xì)胞形態(tài)，固定和支持細(xì)胞器位置的重要作用。同時(shí)它參與構(gòu)成纖毛、鞭毛、中心粒以及基體，因而參與細(xì)胞收縮、偽足運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸。在有絲分裂期間，微管參與構(gòu)成紡錘體，在分裂細(xì)胞中牽引染色體到達(dá)分裂極過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究采用的四個(gè)化合物均為云南紅豆杉中紫杉烷類結(jié)構(gòu)，推測(cè)可能與紫杉醇作用靶點(diǎn)相似。同時(shí)程?hào)|等[15]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可誘導(dǎo)CHL細(xì)胞染色體畸變率增加。因而，本研究采用Ames實(shí)驗(yàn)和CHL細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に岬捏w外遺傳毒性。

Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在加S9和未加S9實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)下2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に岵⑽丛黾邮髠抽T氏桿菌組氨酸缺陷型的回復(fù)突變數(shù)，表明該四種化合物既沒(méi)有間接誘變活性，也沒(méi)有直接誘變活性。主要可能由于該類物質(zhì)主要作用于微管，對(duì)DNA無(wú)直接損傷作用，因?yàn)槲磳?duì)鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸缺陷型菌株產(chǎn)生致突變作用，回變菌落數(shù)沒(méi)有增加。

本研究檢測(cè)了2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に嵩贑HL細(xì)胞上的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)在可溶解的最高濃度下，四種化合物均未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，因此我們初步認(rèn)為四種化合物在CHL細(xì)胞上均為無(wú)細(xì)胞毒性物質(zhì)。染色體畸變實(shí)驗(yàn)可以反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體的作用能力，以檢測(cè)致突變物對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷情況[16-17]。結(jié)果顯示，該四種化合物未導(dǎo)致CHL細(xì)胞的染色體畸變率增加，因此該四種物質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞沒(méi)有致突變型。

綜上所述，本研究表明在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸未發(fā)現(xiàn)有體外遺傳毒性。

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收稿日期：2015-08-15

基金項(xiàng)目：南京中醫(yī)藥大學(xué)青年自然科學(xué)基金資助。

作者簡(jiǎn)介：王佳穎，女，助理研究員。研究方向：藥物毒理學(xué)。E-mail：lisa850913@hotmail.com

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.02.009

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-9690(2016)-02-0027-07

GeneticToxicityofTaxaneDiterpenoidsofTaxus yunnanensis

WangJiaying,HuaWenting,YuDan

(CenterforDrugSafetyEvaluationandResearch,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China)

AbstractObjective：To evaluate the safety of 2-deacetoxytaxinine E, 7-deacetoxytaxinine J, 2-deacetoxydecinnamoyl taxinine J and baccatin 3. Methods: Alarmblue Assay was performed to research the IC50of these four compounds in CHL cell. Then, chromosome aberration test in CHL cell and Ames test were conducted to investigated the genetic toxicity of four compounds in vitro.Results: In CHL cell, the IC50was>0.5 mg/mL. No genetic toxicity was observed. Conclusion: Under the conditions of this experiment, four compounds have neither cell toxicity nor genetic toxicity.

Key wordsgenetic toxicity; Taxus yunnanensis; taxane diterpenoids