賈珊珊++李沛軍++陳從貴

摘 要：產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于自然界，且可以形成芽孢，是導(dǎo)致肉類(lèi)食物中毒和氣性壞疽等的主要病原菌。本文綜述了肉類(lèi)食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染情況、生長(zhǎng)影響因素以及控制其生長(zhǎng)的方法；指明了利用食用安全的天然物質(zhì)，研發(fā)高效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的技術(shù)與方法，對(duì)保障肉制品安全和促進(jìn)肉類(lèi)工業(yè)健康發(fā)展的現(xiàn)實(shí)意義，旨在為人們選擇適合肉類(lèi)食品中抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的途徑提供參考。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；肉類(lèi)食品；污染情況；控制研究

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，

C. perfringens）是一種屬于梭菌屬的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有莢膜，可產(chǎn)生芽孢，不具有運(yùn)動(dòng)性。C. perfringens是引起人畜共患病的主要病原菌之一，該菌的致病因子是其所產(chǎn)生的外毒素[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)C. perfringens產(chǎn)生的外毒素多達(dá)17 種[2]，并以α型（CPA）、β型（CPB）、ε型（ETX）和ι型（ITX）4 種毒素最為常見(jiàn)；C. perfringens還會(huì)產(chǎn)生其他多種毒素或者潛在的致毒因子，如腸毒素（CPE）[3]。根據(jù)所產(chǎn)毒素的不同，C. perfringens可分為5 種類(lèi)型，它們與5 種主要毒素的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表1。5種C. perfringens均會(huì)導(dǎo)致特定的動(dòng)物患病，其中A型和C型C. perfringens可引起人患病，例如，腸毒素引起的食物中毒、水樣腹瀉以及嬰兒的突發(fā)性死亡，α型毒素引起的氣性壞疽及β型毒素引起的人壞死性腸炎[4]。

在美國(guó)和一些發(fā)展中國(guó)家，由A型C. perfringens菌引起的食物中毒是最常見(jiàn)報(bào)道的食物中毒之一，目前在美國(guó)排名第2位，每年可導(dǎo)致食物中毒約100 萬(wàn)例[5-6]。

C. perfringens引起眾多食物中毒事例的原因主要有：1）它廣泛存在于自然界，包括土壤、人以及動(dòng)物的腸道中[7]；

2）它能在適宜的環(huán)境下快速生長(zhǎng)，代時(shí)甚至小于

10 min[4，8]；3）它可以產(chǎn)生多種毒素，導(dǎo)致人或動(dòng)物患病，尤其是A型C. perfringens[9]。

不僅如此，C. perfringens對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較低，也是容易在食品中爆發(fā)的重要原因。其最適生長(zhǎng)pH值為6～7[10]，但在pH 5～9范圍仍可生長(zhǎng)；它可在15～50 ℃快速生長(zhǎng)[11]，在15 ℃以下亦可緩慢生長(zhǎng)，甚至可在6 ℃條件下生長(zhǎng)[12]；其生長(zhǎng)的最低水分活度值為0.95。

C. perfringens芽孢能夠耐高溫，在煮沸15 min或更長(zhǎng)的時(shí)間仍可存活[13]，并可在10～54 ℃溫度內(nèi)快速萌發(fā)和二次生長(zhǎng)[14]。此外，C. perfringens還對(duì)肉類(lèi)食品中各種防腐方法具有較高的抵抗能力[13-15]。

1 肉類(lèi)食品中C. perfringens的污染情況

由C. perfringens導(dǎo)致的食物中毒多與肉和禽肉制品相關(guān)[17-18]。調(diào)查美國(guó)1998—2010年由C. perfringens引起食物中毒的結(jié)果顯示，肉類(lèi)食品占食物總量的92%，其中牛肉制品占46%，禽肉制品占30%，豬肉制品占16%[19]。不僅肉制品容易被C. perfringens污染，原料肉由于富含蛋白質(zhì)也容易成為C. perfringens滋生的土壤[18，20]。富含蛋白質(zhì)的動(dòng)物在屠宰過(guò)程中會(huì)被來(lái)自其腸道或糞便中的C. perfringens污染[21]；而原料食品和加工食品中

C. perfringens的污染率也分別高達(dá)30%和80%[22]。表2列出了近年來(lái)C. perfringens在部分國(guó)家肉樣品中的檢出率。

由表2可知，生鮮牛肉、豬肉、火雞肉和雞肉及各種肉制品中C. perfringens檢出率均超過(guò)10%，部分日本雞肉中檢出率甚至高達(dá)84%。

2 肉類(lèi)食品中C. perfringens生長(zhǎng)的影響因素

Bennett等[28]對(duì)1998—2008年在美國(guó)由

C. perfringens、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒事件的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，無(wú)論是哪種致病菌，最常見(jiàn)引起食物中毒的錯(cuò)誤操作發(fā)生于食物加工和準(zhǔn)備的過(guò)程中，占所有因素的93%。比如，肉制品煮制后經(jīng)過(guò)不適當(dāng)冷卻工藝（44%）；將肉制品放置于不合適貯藏溫度下（22%）。Li[22]和Mcclure[29]等也指出，肉制品煮制后不適當(dāng)冷卻工藝和不合適的貯藏溫度是C. perfringens暴發(fā)的最常見(jiàn)原因。

2.1 不適當(dāng)冷卻工藝

科學(xué)合理的冷卻工藝，應(yīng)能最大程度地抑制致病菌芽孢的萌發(fā)及二次生長(zhǎng)。熱加工可能無(wú)法完全致死

C. perfringens的芽孢，還可能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，使其在較高溫度下快速萌發(fā)并生長(zhǎng)。C. perfringens是肉制品降溫過(guò)程是否安全的指示菌。有研究表明，向煮熟牛肉糜中接種3 種可形成芽孢的致病菌（枯草芽孢桿菌、C. perfringens和肉毒梭狀芽孢桿菌）時(shí)，經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)18 h的降溫過(guò)程后，C. perfringens數(shù)量增加了4～5（lg（CFU/g）），而其他2 種致病菌均無(wú)顯著生長(zhǎng)[30]。美國(guó)對(duì)煮制肉制品的冷卻工藝進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。對(duì)于非熏制的煮制肉及禽肉制品的冷卻過(guò)程，美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全及檢驗(yàn)局明確規(guī)定：從54.4 ℃降至26.7 ℃不得超過(guò)1.5 h，從26.7 ℃降至4.4 ℃不超過(guò)5 h[31]。

肉和禽肉制品的不合適降溫是導(dǎo)致C. perfringens生長(zhǎng)進(jìn)而引起食物中毒事件的重要因素。Valenzuela-Martinez等[32]將數(shù)量約為2～2.5 （lg（CFU/g））的C. perfringens芽孢接種到真空包裝豬肉樣品中，75 ℃水浴加熱20 min誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，隨后將樣品分別于12、15、18、21 h內(nèi)從54.4 ℃降至7.2 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C. perfringens的數(shù)量分別增至6.08、7.25、8.21、8.45 （lg（CFU/g））。Xiao等[33]的研究中也得到了相似的結(jié)果，在9、12、15、18、21 h內(nèi)使樣品從54.4 ℃降至4 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中

C. perfringens芽孢的量從初始接種的2.0～2.5（lg（CFU/g））分別增加了4.50、5.78、7.05、7.88、8.19（lg（CFU/g））。

2.2 不合適的貯藏溫度

除了不適當(dāng)?shù)睦鋮s工藝，肉制品在貯藏過(guò)程中發(fā)生溫度波動(dòng)或貯藏溫度不合適亦會(huì)引起C. perfringens生長(zhǎng)繁殖，對(duì)食品安全造成威脅。Juneja等[34]將15 株C. perfringens接種到真空包裝牛肉中，放置于12 ℃溫度下貯藏，分別測(cè)定0、1、4、7 d樣品中C. perfringens的數(shù)量。結(jié)果顯示，無(wú)論哪一種C. perfringens，樣品中C. perfringens的數(shù)量均隨貯藏天數(shù)的增加而急劇增長(zhǎng)。Nieto-Lozano等[35]發(fā)現(xiàn)，真空包裝的煮制火雞樣品在貯藏過(guò)程中，從4 ℃移至28 ℃的環(huán)境溫度中，貯藏12 h后，樣品中C. perfringens的量從2.0～2.5（lg（CFU/g））增至6.0（lg（CFU/g））。Mikelsaar等[36]發(fā)現(xiàn)將接種

C. perfringens的法蘭克福香腸分別貯藏于10 ℃溫度下60 d和15 ℃溫度下30 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C. perfringens的量從約為4.0 （lg（CFU/g））分別增加至5.7 （lg（CFU/g））和6.3（lg（CFU/g））左右。

3 肉類(lèi)食品中C. perfringens的控制

3.1 原料肉源頭控制C. perfringens的方法

3.1.1 益生菌

益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物的總稱(chēng)，通過(guò)口服等方式定植于宿主腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能夠抑制對(duì)人體有害微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)宿主發(fā)揮有益作用[36]。乳桿菌、雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌均可作為益生菌，用于增強(qiáng)人體胃腸道中有益微生物的生長(zhǎng)[37-38]。但到目前為止，人們對(duì)益生菌作用機(jī)制的研究還不充分，主要認(rèn)為：益生菌通過(guò)與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、降低胃腸道pH值以及產(chǎn)生某些特定的抑菌物質(zhì)等方式，來(lái)抑制有害微生物的生長(zhǎng)[39]。

有研究證實(shí)，乳桿菌和雙歧桿菌能夠減少

C. perfringens的數(shù)量。Kim等[40]從健康豬胃腸道中分離出5 株乳桿菌和2 株雙歧桿菌，它們均可在體外模擬胃腸道環(huán)境下生長(zhǎng)，其中，噬淀粉乳桿菌S6對(duì)C. perfringens的抑制作用要比金霉素和土霉素等抗生素更有效。Rinkinen等[41]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳桿菌可通過(guò)降低黏附能力來(lái)抑制C. perfringens的生長(zhǎng)。

陽(yáng)艷林等[42]從健康雞的胃腸道中分離得到的一株枯草芽孢桿菌，可體外抑制C. perfringens ATCC 13124，并通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，抑菌物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為960～980，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。有公司以枯草芽孢桿菌PB6作為主要成分，生產(chǎn)出微生物制劑克洛生，并通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明了它對(duì)抑制C. perfringens生長(zhǎng)的有效性[43-44]。

表3列出了可以抑制動(dòng)物體內(nèi)C. perfringens的益生菌。

3.1.2 益生元

益生元（prebiotics）作為一類(lèi)不易被人體消化吸收的食品成分，可選擇性地刺激一種或幾種腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)和活性，而對(duì)寄主產(chǎn)生有益的影響[48]。許多體外實(shí)驗(yàn)以及哺乳動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，益生元對(duì)C. perfringens具有抑制作用。例如，與未添加的對(duì)照組相比，添加于動(dòng)物飲食中的果寡糖，可以顯著降低腸道中C. perfringens的數(shù)量[49]；喂食添加有天然益生元糖類(lèi)物質(zhì)的動(dòng)物，其體內(nèi)C. perfringens的數(shù)量顯著少于對(duì)照組[50-53]。也有研究證實(shí)，乳糖可用來(lái)抑制非哺乳動(dòng)物雞腸道內(nèi)C. perfringens的數(shù)量，顯示乳糖可能是一種適用于禽類(lèi)的益生元物質(zhì)[54]。

3.2 肉類(lèi)食品中抑制C. perfringens生長(zhǎng)的方法

3.2.1 有機(jī)酸及有機(jī)酸鹽

在新型的食品抑菌劑中，有機(jī)酸以及有機(jī)酸鹽被認(rèn)為是較好的選擇，因其具有較寬的抑菌譜，無(wú)毒、穩(wěn)定，并具有對(duì)食品的顏色和風(fēng)味無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)[55]。乳酸鈉、乳酸鉀、二乙酸鈉等有機(jī)酸鹽，已被廣泛用于肉制品和禽肉制品，以抑制單核李斯特菌和其他腐敗菌，增強(qiáng)食品的微生物安全[56-57]。有機(jī)酸的抑菌機(jī)理可能是：有機(jī)酸能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的pH值降低，導(dǎo)致帶電離子的釋放，并使質(zhì)子不能穿過(guò)細(xì)胞膜，阻礙了代謝活動(dòng)從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[58]。目前被研究用來(lái)抑制

C. perfringens的有機(jī)酸鹽主要有：乳酸鈣、乳酸鉀、乳酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸和苯甲酸、磷酸酸鹽等[9， 31， 59-60]。

Saeed等[59]利用檸檬酸鈉緩沖溶液及其與二乙酸鈉的混合液，分別添加于烤牛肉中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接種了

2.5（lg（CFU/g））C. perfringens的樣品，在18 h內(nèi)從54.4℃降至7.2 ℃時(shí)，烤牛肉對(duì)照組中C. perfringens的數(shù)量增加了3.70（lg（CFU/g））；而添加了檸檬酸鈉緩沖液及其混合液的樣品中，C. perfringens的數(shù)量卻減少了2.47（lg（CFU/g））?？梢?jiàn)，檸檬酸鈉緩沖液及其與二乙酸鈉的混合物能夠顯著降低C. perfringens萌發(fā)和二次生長(zhǎng)的潛在危險(xiǎn)。

Valenzuela-Martinez等[32]觀察了乳酸鈣、乳酸鉀和乳酸鈉對(duì)豬肉降溫過(guò)程中C. perfringens芽孢萌發(fā)和二次生長(zhǎng)的影響情況，結(jié)果顯示，豬肉制品中添加2.0%的乳酸鈣或者3.0%的乳酸鉀或乳酸鈉，在54.4 ℃至7.2 ℃、長(zhǎng)達(dá)21 h的降溫過(guò)程中，可使產(chǎn)品中C. perfringens的增長(zhǎng)量保持在可接受范圍內(nèi)；而對(duì)照組中C. perfringens卻增長(zhǎng)了6.30（lg（CFU/g））。

3.2.2 細(xì)菌素

細(xì)菌素通常被認(rèn)為是由細(xì)菌生成的多肽類(lèi)物質(zhì)，能夠抑制或殺死近源性和其他微生物[61]。有研究證實(shí)，羅伊氏菌素[62]、乳酸鏈球菌素[62-64]、乳酸片球菌素[35]、戊糖片球菌素[65]、乳酸乳球菌素[66]、糞腸球菌素[67]和芽孢桿菌素[68-69]等細(xì)菌素，均可體外抑制C. perfringens。片球菌素也能有效抑制單核李斯特菌、金黃色葡萄球菌、

C. perfringens等腐敗菌和致病菌[70-71]。

但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌素對(duì)C. perfringens的抑制作用非常有限[72]。細(xì)菌素可能被食品中內(nèi)源性蛋白酶降解，或者被肉和脂肪顆粒吸收[73]，由此影響了細(xì)菌素對(duì)體內(nèi)C. perfringens的抑制效果。細(xì)菌素對(duì)體內(nèi)

C. perfringens的抑制作用值得進(jìn)一步研究。

3.2.3 殼聚糖

殼聚糖是由自然界幾丁質(zhì)脫乙酰作用得到的聚合物，食用安全，已廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。殼聚糖類(lèi)似于米糠、麥麩等膳食纖維，不能被人體吸收，可增加腸道中有益微生物的數(shù)量，并減少C. perfringens等致病菌的數(shù)量。Juneja等[74]將殼聚糖添加到培養(yǎng)基以及倉(cāng)鼠的食物中，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，觀察殼聚糖對(duì)C. perfringens生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以顯著抑制C. perfringens的體外生長(zhǎng)，但對(duì)其體內(nèi)生長(zhǎng)量卻無(wú)顯著影響。

Aziz等[75]研究發(fā)現(xiàn)，即使牛肉和雞肉經(jīng)歷了不合適的降溫過(guò)程，殼聚糖也能有效抑制產(chǎn)品中C. perfringens芽孢的萌發(fā)和二次生長(zhǎng)。Santos等[76]在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能有效抑制C. perfringens、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌等革蘭氏陽(yáng)性致病菌。

3.2.4 植物提取物和香精油

有體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物提取物和植物香精油可以抑制C. perfringens的生長(zhǎng)[77-78]，其中包括綠茶提取物[79]。植物提取物和香精油的抑菌效果與很多因素有關(guān)，除了與植物類(lèi)型、生長(zhǎng)地理位置以及生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)外[21]，還與提取方式、培養(yǎng)基種類(lèi)、pH值以及培養(yǎng)溫度有關(guān)[80]。

綠茶提取物具有抑制C. perfringens芽孢萌發(fā)及二次生長(zhǎng)的作用。有學(xué)者將不同濃度的綠茶提取物，添加于C. perfringens芽孢接種量約3（lg（CFU/g））的牛肉、雞肉和豬肉中，在煮制樣品經(jīng)歷12、15、18、21 h從54.4℃降至7.2 ℃后，實(shí)驗(yàn)觀察樣品中C. perfringens的變化情況，結(jié)果顯示：添加2%的綠茶提取物，3 種肉制品中

C. perfringens的數(shù)量均顯著低于對(duì)照組；且提取物濃度不同，抑菌效果也不同[81]。

Demirci等[81]利用土耳其唇形科糙蘇屬植物中提取的香精油，通過(guò)體外抑制食源性致病菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所提精油可以有效抑制C. perfringens、單核李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7等致病菌的生長(zhǎng)。Sebranek等[82]將冬季香薄荷精油添加到接種了C. perfringens A型菌株的意大利香腸中，在25 ℃貯藏30 d，觀察香腸中

C. perfringens在貯藏過(guò)程的數(shù)量變化，結(jié)果表明，該精油可以顯著抑制C. perfringens的生長(zhǎng)，且在貯藏結(jié)束后，樣品中C. perfringens的數(shù)量?jī)H為2.80 （lg（CFU/g））。

4 結(jié) 語(yǔ)

C. perfringens在環(huán)境中分布廣泛，很容易污染富含蛋白的肉類(lèi)食品，對(duì)肉食品安全造成較大潛在威脅。現(xiàn)已研究證實(shí)，有機(jī)酸及有機(jī)酸鹽、細(xì)菌素、殼聚糖和植物提取物等天然物質(zhì)，可以有效抑制C. perfringens的生長(zhǎng)，但其實(shí)際應(yīng)用還很有限。隨著人們對(duì)綠色食品和食品安全的日益重視，利用食用安全的天然成分，開(kāi)展其對(duì)

C. perfringens的抑制作用研究，將會(huì)成為熱點(diǎn)。而對(duì)于易受C. perfringens污染的肉及肉制品，研究與開(kāi)發(fā)高效的抑制方法，并應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，對(duì)保障肉制品安全和促進(jìn)肉類(lèi)工業(yè)健康發(fā)展，更具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳小云， 關(guān)孚時(shí)， 張存帥， 等. 產(chǎn)氣莢膜梭菌主要外毒素最新研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸藥雜志， 2005， 39（6）： 29-33. DOI： 10.3969/j.issn.1002-1280.2005.06.009.

[2] MCCLANE B A， UZAL F A， MIYAKAWA M E F， et al. The enterotoxic Clostridia[J]. Prokaryotes， 2006， 4： 698-752. DOI： 10.1007/springerreference_3743.

[3] UZAL F A， FREEDMAN J C， SHRESTHA A， et al. Towards an understanding of the role of Clostridium perfringens toxins in human and animal disease[J]. Future Microbiology， 2014， 9（3）： 361-377. DOI： 10.2217/fmb.13.168.

[4] LINDSTR M M， HEIKINHEIMO A， LAHTI P， et al. Novel insights into the epidemiology of Clostridium perfringens type A food poisoning[J]. Food Microbiology， 2011， 28（2）： 192-198. DOI： 10.1016/j.fm.2010.03.020.

[5] SCALLAN E， HOEKSTRA R M， ANGULO F J， et al. Foodborne illness acquired in the United States： major pathogens[J]. Emerging Infectious Diseases， 2011， 17（1）： 7-15. DOI： 10.3201/eid1701.p11101.

[6] HOFFMANN S， BATZ M B， MORRJS J J G. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens[J]. Journal of Food Protection， 2012， 75（7）： 1292-1302. DOI： 10.4315/0362-028x.jfp-11-417.

[7] STEELE F， WRIGHT K. Cooling rate effect on outgrowth of Clostridium perfringens in cooked， ready-to-eat turkey breast roasts[J]. Poultry Science， 2001， 80（6）： 813-816. DOI： 10.1093/ps/80.6.813.

[8] LABBE R G， HUANG T H. Generation times and modeling of enterotoxin-positive and enterotoxin-negative strains of Clostridium perfringens in laboratory media and ground beef[J]. Journal of Food Protection， 1995， 58（12）： 1303-1306. DOI： 10.1093/ps/80.6.813.

[9] ALNOMAN M， UDOMPIJITKUL P， PAREDES-SABJA D， et al. The inhibitory effects of sorbate and benzoate against Clostridium perfringens type A isolates[J]. Food Microbiology， 2015， 48： 89-98. DOI： 10.1016/j.fm.2014.12.007.

[10] SAKURAI J， DUNCAN C L. Effect of carbohydrates and control of culture pH on beta toxin production by Clostridium perfringens type C[J]. Microbiology and Immunology， 1979， 23（5）： 313-318. DOI： 10.1111/j.1348-0421.1979.tb00468.x.

[11] JUNEJA V K， MARKS H， THIPPAREDDI H. Predictive model for growth of Clostridium perfringens during cooling of cooked uncured beef[J]. Food Microbiology， 2008， 25（1）： 42-55. DOI： 10.1016/j.fm.2007.08.004.

[12] HUANG L. Estimation of growth of Clostridium perfringens in cooked beef under fluctuating temperature conditions[J]. Food Microbiology， 2003， 20（5）： 549-559. DOI： 10.1016/s0740-0020（02）00155-7.

[13] SARKER M R， SHIVERS R P， SPARKS S G， et al. Comparative experiments to examine the effects of heating on vegetative cells and spores of Clostridium perfringens isolates carrying plasmid genes versus chromosomal enterotoxin genes[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2000， 66（8）： 3234-3240. DOI： 10.1128/aem.66.12.5549-5549.2000.

[14] LI J， MCCLANE B A. Comparative effects of osmotic， sodium nitrite-induced， and pH-induced stress on growth and survival of Clostridium perfringens type A isolates carrying chromosomal or plasmid-borne enterotoxin genes[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006， 72（12）： 7620-7625. DOI： 10.1128/aem.01911-06.

[15] PAREDES-SABJA D， GONZALEZ M， SARKER M R， et al. Combined effects of hydrostatic pressure， temperature， and pH on the inactivation of spores of Clostridium perfringenstype A and Clostridium sporogenes in buffer solutions[J]. Journal of Food Science， 2007， 72（6）： M202-M206. DOI： 10.1111/j.1750-3841.2007.00423.x.

[16] SONGER J G， UZAL F A. Clostridial enteric infections in pigs[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation， 2005， 17（6）： 528-536. DOI： 10.1177/104063870501700602.

[17] McCLANE B A. Clostridium perfringens[M]. Food Science and Technology New York Marcel Dekker， 2003： 91-104. DOI： 10.1128/9781555815912.ch19.

[18] MIWA N， NISHINA T， KUBO S， et al. Most probable numbers of enterotoxigenic Clostridium perfringens in intestinal contents of domestic livestock detected by nested PCR[J]. Journal of Veterinary Medical Science， 1997， 59（7）： 557-560. DOI： 10.1292/jvms.59.557.

[19] GRASS J E， GOULD L H， MAHON B E. Epidemiology of foodborne disease outbreaks caused by Clostridium perfringens， United States， 1998—2010[J]. Foodborne Pathogens and Disease， 2013， 10（2）： 131-136. DOI： 10.1089/fpd.2012.1316.

[20] MIKI Y， MIYAMOTO K， KANEKO-HIRANO I， et al. Prevalence and characterization of enterotoxin gene-carrying Clostridium perfringens isolates from retail meat products in Japan[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2008， 74（17）： 5366-5372. DOI： 10.1128/aem.00783-08.

[21] ALLAART J G， van ASTEN A J A M， GR?NE A. Predisposing factors and prevention of Clostridium perfringens： associated enteritis[J]. Comparative Immunology， Microbiology and Infectious Diseases， 2013， 36（5）： 449-464. DOI： 10.1016/j.cimid.2013.05.001.

[22] LI L， VALENZUELA-MARTINEZ C， REDONDO M， et al. Inhibition of Clostridium perfringens spore germination and outgrowth by lemon juice and vinegar product in reduced NaCl roast beef[J]. Journal of Food Science， 2012， 77（11）： M598-M603. DOI： 10.1111/j.1750-3841.2012.02922.x.

[23] ARAS Z， HADIMLI H H. Detection and molecular typing of Clostridium perfringens isolates from beef， chicken and turkey meats[J]. Anaerobe， 2015， 32： 15-17. DOI： 10.1016/j.anaerobe.2014.11.004.

[24] MORERA J， RODR-GUEZ E， GAMBOA M M. Determination of Clostridium perfringens in pork sausages from the Metropolitan area of Costa Rica[J]. Archivos Latinoamericanos De Nutrición， 1999， 49（3）： 279-282.

[25] STAGNITTA P V， MICALIZZI B， GUZMáN A M S D. Prevalence of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meats in San Luis， Argentina[J]. Anaerobe， 2002， 8（5）： 253-258. DOI： 10.1006/anae.2002.0433.

[26] WEN Q， Mc CLANE B A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringenstype A isolates in American retail foods[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（5）： 2685-2691. DOI： 10.1128/aem.70.5.2685-2691.2004.

[27] YUAN-TONG L， RONALD L. Enterotoxigenicity and genetic relatedness of Clostridium perfringens isolates from retail foods in the United States[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（3）： 1642-1646. DOI： 10.1128/aem.69.3.1642-1646.2003.

[28] BENNETT S D， WALSH K A， L HANNAH G. Foodborne disease outbreaks caused by Bacillus cereus， Clostridium perfringens， and Staphylococcus aureus-United States， 1998—2008[J]. Clinical Infectious Diseases An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America， 2013， 57（3）： 425-433. DOI： 10.1093/cid/cit244.

[29] MCCLURE P J， KERRY J， KERRY J， et al. Microbiological hazard identification in the meat industry[C]//Meat Processing： Improving Quality， 2002： 217-236. DOI： 10.1533/9781855736665.2.217.

[30] DOYLE E. Survival and growth of Clostridium perfringens during the cooling step of thermal processing of meat products： a review of the scientific literature[R]. University of Wisconsin， Madison， WI 53706： Food Research Institute. 2002.

[31] VELUGOTI PR， RAJAGOPAL L， JUNEJA V， et al. Use of calcium， potassium， and sodium lactates to control germination and outgrowth of Clostridium perfringens spores during chilling of injected pork[J]. Food Microbiology， 2007， 24（7）： 687-694. DOI： 10.1016/j.fm.2007.04.004.

[32] VALENZUELA-MARTINEZ C， PENA-RAMOS A， JUNEJA V K， et al. Inhibition of Clostridium perfringensspore germination and outgrowth by buffered vinegar and lemon juice concentrate during chilling of ground turkey roast containing minimal ingredients[J]. Journal of Food Protection， 2010， 73（3）： 470-476.

[33] XIAO Y， WAGENDORP A， ABEE T， et al. Differential outgrowth potential of Clostridium perfringens food-borne isolates with various cpe-genotypes in vacuum-packed ground beef during storage at

12 ℃[J]. International Journal of Food Microbiology， 2015， 194C： 40-45.

DOI： 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.11.008.

[34] JUNEJA V K， MAJKA W M. Outgrowth of Clostridium perfringens spores in cook-in-bag beef products[J]. Journal of Food Safety， 1995， 15（1）： 21-34. DOI： 10.1111/j.1745-4565.1995.tb00118.x.

[35] NIETO-LOZANO J C， REGUERA-USEROS J I. The effect of the pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens in Spanish dry-fermented sausages and frankfurters[J]. Food Control， 2010， 21（5）： 679-685.

[36] MIKELSAAR M， ZILMER M. Lactobacillus fermentum ME-3： an antimicrobial and antioxidative probiotic[J]. Microbial Ecology in Health and Disease， 2009， 21（1）： 1-27. DOI： 10.3402/mehd.v21i1.7573.

[37] HOA N T， BACCIGALUPI L， HUXHAM A， et al. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2000， 66（12）： 5241-5247. DOI： 10.1128/aem.66.12.5241-5247.2000.

[38] SAARELA M， MOGENSEN G， FOND N R， et al. Probiotic bacteria： safety， functional and technological properties[J]. Journal of Biotechnology， 2000， 84（3）： 197-215. DOI： 10.1016/s0168-1656（00）00375-8.

[39] CROST E， PUJOL A， LADIR M， et al. Production of an antibacterial substance in the digestive tract involved in colonization-resistance against Clostridium perfringens[J]. Anaerobe， 2010， 16（6）： 597-603. DOI： 10.1016/j.anaerobe.2010.06.009.

[40] KIM P I， MIN Y J， CHANG Y H， et al. Probiotic properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 74（5）： 1103-1111. DOI： 10.1007/s00253-006-0741-7.

[41] RINKINEN M， WESTERMARCK E， SALMINEN S， et al. Absence of host specificity for in vitro adhesion of probiotic lactic acid bacteria to intestinal mucus[J]. Veterinary Microbiology， 2004， 97（1）： 55-61. DOI： 10.1016/s0378-1135（03）00183-4.

[42] 陽(yáng)艷林， 肖建根. 不同枯草芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用[J]. 中國(guó)畜牧雜志， 2011， 47（12）： 55-56.

[43] 黃廣明， 張媛媛， 鄢紅國(guó)， 等. 3省份豬場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染狀況的調(diào)查分析[J]. 養(yǎng)豬， 2014， 1（1）： 103-104. DOI： 10.13257/j.cnki.21-1104/s.2014.01.001.

[44] SATHISHKUMAR J， GOKILA T， HANNAH K， et al. Bacillus subtilis PB6 improves intestinal health of broiler chickens challenged with Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis[J]. Poultry Science， 2013， 92（2）： 370-374. DOI： 10.3382/ps.2012-02528.

[45] KLOSE V， BAYER K， BRUCKBECK R， et al. In vitro antagonistic activities of animal intestinal strains against swine-associated pathogens[J]. Veterinary Microbiology， 2010， 144（3）： 515-521. DOI： 10.1016/j.vetmic.2010.02.025.

[46] BIAGI G， PIVA A， MOSCHINI M， et al. Performance， intestinal microflora， and wall morphology of weanling pigs fed sodium butyrate[J]. Journal of Animal Science， 2007， 85（5）： 1184-1191. DOI： 10.2527/jas.2006-378.

[47] GIBSON G R， BEATTY E R， WANG X， et al. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin[J]. Gastroenterology， 1995， 108（4）： 975-982. DOI： 10.1016/0016-5085（95）90192-2.

[48] SWANSON K S， GRIESHOP C M， BAUER L L， et al. Supplemental fructooligosaccharides and mannano-ligosaccharides influence immune function， ileal and total tract nutrient digestibilities， microbial populations and concentrations of protein catabolites in the large bowel of dogs[J]. Journal of Nutrition， 2002， 132（5）： 980-989.

[49] BIGGS P， PARSONS C， FAHEY G. The effects of several oligosaccharides on growth performance， nutrient digestibilities， and cecal microbial populations in young chicks[J]. Poultry Science， 2007， 86（11）： 2327-2336. DOI： 10.3382/ps.2007-00427.

[50] FLICKINGER E A， JAN V L， FAHEY G C. Nutritional responses to the presence of inulin and oligofructose in the diets of domesticated animals： a review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2003， 43（1）： 19-60. DOI： 10.1080/10408690390826446.

[51] GóMEZ-CONDE M S， GARCíA J， CHAMORRO S， et al. Neutral detergent-soluble fiber improves gut barrier function in twenty-five-day-old weaned rabbits[J]. Journal of Animal Science， 2007， 85（12）： 3313-3321. DOI： 10.2527/jas.2006-777.

[52] SHINOHARA K， OHASHI Y， KAWASUMI K， et al. Effect of apple intake on fecal microbiota and metabolites in humans[J]. Anaerobe， 2010， 16（5）： 510-515. DOI： 10.1016/j.anaerobe.2010.03.005.

[53] MCREYNOLDS J L， BYRD J A， GENOVESE K J， et al. Dietary lactose and its effect on the disease condition of necroticenteritis[J]. Poultry Science， 2007， 86（8）： 1656-1661. DOI： 10.1093/ps/86.8.1656.

[54] NORHANA M N W， POOLE S E， DEETH H C， et al. Effects of nisin， EDTA and salts of organic acids on Listeria monocytogenes， Salmonella and native microflora on fresh vacuum packaged shrimps stored at 4 ℃[J]. Food Microbiology， 2012， 31（1）： 43-50. DOI： 10.1016/j.fm.2012.01.007.

[55] HARMAYANI E， SOFOS J N， SCHMIDT G R. Fate of Listeria monocytogenes in raw and cooked ground beef with meat processing additives[J]. International Journal of Food Microbiology， 1993， 18（3）： 223-232. DOI： 10.1016/0168-1605（93）90047-k.

[56] SCHLYTER J H， GLASS K A， LOEFFELHOLZ J， et al. The effects of diacetate with nitrite， lactate， or pediocin on the viability of Listeria monocytegenes in turkey slurries[J]. International Journal of Food Microbiology， 1993， 19（4）： 271-281. DOI： 10.1016/0168-1605（93）90019-d.

[57] BIGGS P， PARSONS C. The effects of several organic acids on growth performance， nutrient digestibilities， and cecal microbial populations in young chicks[J]. Poultry Science， 2008， 87（12）： 2581-2589. DOI： 10.3382/ps.2008-00080.

[58] THIPPAREDDI H， JUNEJA V， PHEBUS R K， et al. Control of Clostridium perfringens germination and outgrowth by buffered sodium citrate during chilling of roast beef and injected pork[J]. Journal of Food Protection， 2003， 66（3）： 376-381.

[59] SAEED A， DANIEL P S， SARKER M R. Inhibitory effects of polyphosphates on Clostridium perfringens growth， sporulation and spore outgrowth[J]. Food Microbiology， 2008， 25（6）： 802-808. DOI： 10.1016/j.fm.2008.04.006.

[60] BALCIUNAS E M， MARTINEZ F A C， TODOROV S D， et al. Novel biotechnological applications of bacteriocins： a review[J]. Food Control， 2013， 32（1）： 134-142. DOI： 10.1016/j.foodcont.2012.11.025.

[61] GARDE S， GóMEZ-TORRES N， HERNáNDEZ M， et al. Susceptibility of Clostridium perfringens to antimicrobials produced by lactic acid bacteria： reuterin and nisin[J]. Food Control， 2014， 44： 22-25. DOI： 10.1016/j.foodcont.2014.03.034.

[62] MARTA A， NATALIA G T， MARTA H， et al. Inhibitory activity of reuterin， nisin， lysozyme and nitrite against vegetative cells and spores of dairy-related Clostridium species[J]. International Journal of Food Microbiology， 2014， 172（7）： 70-75. DOI： 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.002.

[63] UDOMPIJITKUL P， PAREDES-SABJA D， SARKER M R. Inhibitory effects of nisin against Clostridium perfringensfood poisoning and nonfood-borne isolates[J]. Journal of Food Science， 2012， 77（1）： M51-M56. DOI： 10.1111/j.1750-3841.2011.02475.x.

[64] GRILLI E， MESSINA MR， CATELLI E， et al. Pediocin A improves growth performance of broilers challenged with Clostridium perfringens[J]. Poultry Science， 2009， 88（10）： 2152-2158. DOI： 10.3382/ps.2009-00160.

[65] SPELHAUGS R， HARLANDERS K. Inhibition of foodborne bacterial pathogens by bacteriocins from Lactococcus lactis and Pediococcus pentosaceous[J]. Journal of Food Protection， 1989， 52（12）： 856-862.

[66] CINTAS L M， CASAUS P， HAVARSTEIN L S， et al. Biochemical and genetic characterization of enterocin P， a novel sec-dependent bacteriocin from Enterococcus faecium P13 with a broad antimicrobial spectrum[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1997， 63（11）： 4321-4330.

[67] BIZANI D， BRANDELLI A. Characterization of a bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus sp. strain 8 A[J]. Journal of Applied Microbiology， 2002， 93（3）： 512-519. DOI： 10.1046/j.1365-2672.2002.01720.x.

[68] XIE J， ZHANG R， SHANG C， et al. Isolation and characterization of a bacteriocin produced by an isolated Bacillus subtilis LFB112 that exhibits antimicrobial activity against domestic animal pathogens[J]. African Journal of Biotechnology， 2009， 8（20）： 5611-5619.

[69] JUNEJA V K， DWIVEDI H P， YAN X. Novel natural food antimicrobials[J]. Annual review of Food Science and Technology， 2012， 3： 381-403. DOI： 10.1146/annurev-food-022811-101241.

[70] TIWARI B K， VALDRAMIDIS V P， ODONNELL C P， et al. Application of natural antimicrobials for food preservation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（14）： 5987-6000. DOI： 10.1079/9781845937690.0204.

[71] NIETO-LOZANO J C， REGUERA-USEROS J I， PELAEZ-MARTINEZ M D C， et al. Effect of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens on Spanish raw meat[J]. Meat Science， 2006， 72（1）： 57-61. DOI： 10.1016/j.meatsci.2005.06.004.

[72] ZHANG J， LIU G， SHANG N， et al. Purification and partial amino acid sequence of pentocin 31-1， an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1[J]. Journal of Food Protection， 2009， 72（12）： 2524-2529.

[73] GUO-JANE T， SAN-PIN H. In vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some intestinal bacteria[J]. Fisheries Science， 2004， 70（4）： 675-681. DOI： 10.1111/j.1444-2906.2004.00856.x.

[74] JUNEJA V K， HARSHAVARDHAN T， LATIFUL B， et al. Chitosan protects cooked ground beef and turkey against Clostridium perfringens spores during chilling[J]. Journal of Food Science， 2006， 71（6）： M236-M240. DOI： 10.1111/j.1750-3841.2006.00109.x.

[75] AZIZ M A， CABRAL J D， BROOKS H J L， et al. Antimicrobial properties of a chitosan dextran-based hydrogel for surgical use[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2012， 56（1）： 280-287. DOI： 10.1128/aac.05463-11.

[76] SANTOS G， MIRNA A， MARIVEL G， et al. Inhibition of growth， enterotoxin production， and spore formation of Clostridium perfringens by extracts of medicinal plants[J]. Journal of Food Protection， 2002， 65（10）：1667-1669.

[77] SI W， NI X， GONG J， et al. Antimicrobial activity of essential oils and structurally related synthetic food additives towards Clostridium perfringens[J]. Journal of Applied Microbiology， 2009， 106（1）： 213-220. DOI： 10.1111/j.1365-2672.2008.03994.x.

[78] AH Y J， SAKANAK S， KIM M J， et al. Effect of green tea extract on growth of intestinal bacteria[J]. Microbial Ecology in Health and Disease， 2009， 3（6）： 335-338. DOI： 10.3402/mehd.v3i6.7559.

[79] BURT S. Essential oils： their antibacterial properties and potential applications in foods： a review[J]. International Journal of Food Microbiology， 2004， 94（3）： 223-253. DOI： 10.1016/j.ijfoodmicro.2004.03.022.

[80] JUNEJA V K， BARI M L， INATSU Y， et al. Control of Clostridium perfringens spores by green tea leaf extracts during cooling of cooked ground beef， chicken， and pork[J]. Journal of Food Protection， 2007， 70（6）： 1429-1433.

[81] DEMIRCI F， GUVEN K， DEMIRCI B， et al. Antibacterial activity of two Phlomis essential oils against food pathogens[J]. Food Control， 2008， 19（12）： 1159-1164. DOI： 10.1016/j.foodcont.2008.01.001.

[82] SEBRANEK J G， BACUS J N. Cured meat products without direct addition of nitrate or nitrite： what are the issues？[J]. Meat Science， 2007， 77（1）： 136-147. DOI： 10.1016/j.meatsci.2007.03.025.