郭倩瑜,張建民,李蓉蓉

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

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含油廢水處理中石油降解菌的篩選及其降解條件優(yōu)化

郭倩瑜,張建民,李蓉蓉

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

摘要:為篩選出高效含油廢水降油菌,更好地利用生化法治理含油廢水,從咸陽市中國石油長慶石化公司污水處理站采取水樣,經(jīng)過菌種的馴化、分離純化得到17株石油降解菌,其中細(xì)菌13株,其余為放線菌或霉菌. 經(jīng)過30℃、180±2r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)7d后篩選出2株優(yōu)勢石油降解菌:GA-4菌為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、GA-6菌為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.).在油濃度為2g/L時(shí)降油效果最好,GA-4菌與GA-6菌的降油率分別為41.18%，34.82%.GA-4菌與GA-6菌的最優(yōu)降解條件分別為:30℃,pH為8.0,接種量為5%;28℃,pH為7.5,接種量為5%.

關(guān)鍵詞:石油化工廢水;降油菌;降油率;生化處理

0引言

眾所周知,石油是當(dāng)今現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)中最重要的自然資源之一,且在未來幾十年內(nèi)依然是最主要的能源以及化工原料[1].近些年,石油的大量開采及其化工產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用,給人類帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞.目前，石化廢水的處理方法主要有物理法(吸附法、氣浮法、膜濾法)、化學(xué)法(電絮凝、濕式氧化法、電解氧化法、臭氧催化氧化法)及生物法(好氧法、厭氧法)[2].而生物法具有降解效果好、人力物力投入小、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，且處理費(fèi)用明顯低于物化法，目前普遍應(yīng)用于石化廢水處理[3].

早在1978年,中國科學(xué)院對石油污染區(qū)域的降油微生物就進(jìn)行了研究,并分離得到126株細(xì)菌和71株真菌,其中60%的細(xì)菌菌株和89%的真菌菌株具有脂酶活性[4].目前已發(fā)現(xiàn)約有100余屬200多種微生物可以降解石油烴類,包括細(xì)菌、真菌、放線菌及藻類,其中細(xì)菌、真菌對石油的降解效果較好.由于降油細(xì)菌的數(shù)量龐大,在實(shí)際應(yīng)用中主要以細(xì)菌類為主[5-7].如何提高菌株的降油率已成為生化法治理石油廢水的研究熱點(diǎn).黃敏剛等[8]分別從新疆油田、大慶油田含油污水中分離得到2株高效石油降解菌,并對混合菌的降解效果及影響因素進(jìn)行了探討.梁生康等[9]分析了單菌株和混合菌株的降油率情況以及不同含油量對其降油率的影響，并通過模擬實(shí)驗(yàn)考察混合降油菌對勝利油田孤島采油廢水處理效果.史利榮等[10]對石油化工廢水處理中活性污泥的微生物菌群及其降解效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不動桿菌屬為活性污泥中的最優(yōu)勢菌屬，芽孢桿菌屬次之，且均具有較好的降解效果.本文從中國石油長慶石化公司污水處理站采集水樣，對菌種進(jìn)行馴化、分離純化，篩選出優(yōu)勢菌種并對菌種鑒定到屬.通過研究培養(yǎng)時(shí)間、含油量、pH、接種量及溫度對降油率的影響，得出優(yōu)勢菌種的最優(yōu)降解條件.

1實(shí)驗(yàn)

咸陽市中國石油長慶石化公司污水處理站的處理能力為370m3/h,廢水來源為工業(yè)廢水和廠區(qū)內(nèi)生活污水.根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)中水樣的采集與保存方法采集水樣，原油由該站提供，菌種取自該站曝氣池及隔油池,用500mL的清潔無菌玻璃瓶采集活性污泥泥水混合液及污水水樣[11].

1.1培養(yǎng)基

(1) 無機(jī)鹽培養(yǎng)基(原油為唯一碳源)原油,K2HPO42.0g,KH2PO41.5g,NH4NO32.0g,無水Na2SO40.5g,微量元素液10mL,蒸餾水1 000mL,pH值7.0～7.4,121℃高壓蒸汽滅菌20min備用;固體培養(yǎng)基再加入15～18g瓊脂.其中，微量元素液組分為MgSO4·7H2O 2g,無水CaCl21g,FeSO4·7H2O 1g,ZnSO4·7H2O 0.5g,CuSO4·5H2O 0.1g,蒸餾水1 000mL．

(2) 富集、純化培養(yǎng)基NaCl 5g,牛肉膏3g,蛋白胨10g,蒸餾水1 000mL, pH值7.0～7.4,121℃高壓蒸汽滅菌20min備用;固體培養(yǎng)基再加入15～18g瓊脂.

1.2菌種的馴化、分離純化和鑒定

取2mL泥水混合液/污水水樣于100mL滅菌原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基(原油質(zhì)量濃度為1g/L)中,30℃，180±2r/min搖床振蕩培養(yǎng)8d后取2mL上述培養(yǎng)液于新鮮的原油培養(yǎng)基(原油質(zhì)量濃度逐次增加為:2，3，4g/L)中再次培養(yǎng)8d,如此馴化4次.通過不斷提高初始含油量來強(qiáng)化菌株的降解性能.

取每次馴化后的菌懸液1mL在無基鹽固體培養(yǎng)基上做稀釋平板,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d后從上述培養(yǎng)皿中挑取生長良好的不同的單菌落,在純化培養(yǎng)基上反復(fù)劃線,直到得到單一菌種為止.最終分離得到2株優(yōu)勢石油降解細(xì)菌.

通過查閱《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]并利用16S rDNA基因序列法鑒定菌種，得到GA-4為芽孢桿菌屬(Bacillussp.),GA-6為不動桿菌屬(Acinetobactersp.).

2石油降解率的測定

2.1確定石油醚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

將原油配制成70mg/L的石油醚溶液,以溶劑石油醚為空白樣進(jìn)行光譜掃描,繪制掃描光譜曲線如圖1.由圖1可知原油溶液有兩個(gè)吸收峰:224nm和242nm.由于在波長224nm處溶劑對吸光度有一定的干擾,吸光值無法趨于穩(wěn)定,而在波長242nm處吸光值保持穩(wěn)定,所以最適測定波長選為242nm.采用紫外分光光度法測定降油率[13],以石油醚為溶劑將原油配成質(zhì)量濃度分別為0，10，20，30，40，50，60，70mg/L的溶液，以石油醚為空白對照，在波長242nm處測定各溶液的吸光度值分別為0，0.179,0.344,0.52,0.681,0.853,1.022,1.227.得出油含量-吸光度值曲線方程:y=0.017 3x-0.000 6,R2=0.999 4.

2.2制備菌懸液

將純化好的各菌種挑取一環(huán)分別接種到35mL滅菌富集培養(yǎng)基中,30℃，180±2r/min搖床振蕩培養(yǎng),根據(jù)菌種的生長曲線來確定菌劑的培養(yǎng)時(shí)間,一般選用對數(shù)期末期作為菌劑培養(yǎng)時(shí)間,此時(shí)細(xì)菌的菌體量趨于最大且代謝活力較強(qiáng)[14]. 將菌懸液離心分離后得到菌體,在無菌條件下用無機(jī)鹽培養(yǎng)液將菌體調(diào)為同一吸光度值的種子菌液.

2.3菌種降油率的測定

取種子菌液1.5mL加入到50mL原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,以不加菌的搖瓶做為空白對照,30℃，180±2r/min搖床振蕩培養(yǎng)7d.之后加入石油醚對殘余石油進(jìn)行萃取，每次加入量為10mL,共萃取3次，隨后將萃取液混合.采用高速離心法將萃取液在5 000r/min條件下將石油醚溶液和水分離,以去除萃取液中殘余水分.用石油醚將各組萃取液調(diào)為同一容量體積,取1mL萃取液加入到50mL比色管中,加石油醚到刻度線并充分搖勻.以石油醚作為對照,在波長242nm下測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各菌株的石油降解率.計(jì)算公式為

η(%)=(c0-cx)/c0×100%.

(1)

式中，η為降油率(%),c0為空白搖瓶中剩余石油含量(g/L),cx為各搖瓶中剩余石油含量(g/L).

3優(yōu)化降解條件

3.1菌株的生長曲線

在富集培養(yǎng)基中分別接種一環(huán)GA-4菌、GA-6菌,30℃、180±2r/min搖床振蕩培養(yǎng),每隔一段時(shí)間測定菌劑的OD600值(溶液在600nm波長處的吸光值),利用菌體的吸光度來反應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度,見圖2.由圖2可知GA-4菌、GA-6菌分別在45h,15h達(dá)到對數(shù)期末期,所以分別選取此時(shí)作為種子菌液的培養(yǎng)時(shí)間.

3.2培養(yǎng)時(shí)間和含油量對降油率的影響

經(jīng)過7d搖床振蕩培養(yǎng)后，測定不同培養(yǎng)時(shí)間和不同含油量條件下的降油率.由圖3可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長菌體對原油的降油率也在不斷增加,同時(shí)GA-4菌、GA-6菌的降油速度隨時(shí)間延長而逐漸減慢.當(dāng)初始含油量為2g/L時(shí),GA-4菌、GA-6菌的降油效果最好,7d的降油率分別為41.18%,34.82%;而當(dāng)初始含油量≥2g/L時(shí)，GA-4菌、GA-6菌的降油率則隨著油濃度的增加而降低:說明當(dāng)初始含油率濃度大于2g/L時(shí)，隨初始含油率濃度的增加，菌體的降油率不斷減小.可見高濃度的石油烴對微生物的代謝生長有抑制作用,而少量的石油污染物反而會刺激降油微生物的生長[15].

3.3降解液pH對降油率的影響

微生物對石油廢水處理的最適pH值通常為中性7.0左右,也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很多石油烴降解菌的最適pH值偏弱堿性,略大于7.0[16].調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含油量為2g/L)的pH值分別為6.0,7.0,8.0,9.0,搖床振蕩培養(yǎng)7d后測定不同pH值下的降油率.由圖4可知,GA-4菌、GA-6菌的最適pH值分別為8.0，7.5.此時(shí)的降油效果最好,降油率分別為44.3%，36.8%.當(dāng)pH值過高或過低時(shí),溶液中H+或OH-濃度過高,引起微生物原生質(zhì)膜的電荷變化,從而降低了微生物酶的催化反應(yīng)和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,最終抑制了菌體的生長繁殖,使降解率變低[17].

3.4菌體接種量對降油率的影響

將體積濃度分別為1%,2%,3%,4%,5%,6%的GA-4菌與GA-6菌加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含油量為2g/L)中,搖床振蕩培養(yǎng)后測定不同接種量條件下的降油率.由圖5可知當(dāng)接種量小于5%時(shí),隨著菌體接種量的增加降油率也在不斷增加;當(dāng)GA-4菌、GA-6菌的接種量大于5%時(shí),菌體的降油率隨著接種量的增加開始降低,所以GA-4菌、GA-6菌的最優(yōu)接種量為5%.

3.5降解溫度對降油率的影響

一般情況下,微生物的合適降解溫度在20℃～30℃之間,在此范圍內(nèi)對石油烴的降解效果隨著溫度的提高而增大.溫度過高或過低均會降低降解效果.合適的環(huán)境溫度可以促進(jìn)微生物體內(nèi)酶促反應(yīng)的快速運(yùn)行,同時(shí),溫度決定了石油的物理狀態(tài),從而影響到微生物與石油碳氧化合物分子之間的相互作用,進(jìn)而影響了生物降解速率.

將GA-4菌、GA-6菌加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含油量為2g/L)中.搖床振蕩培養(yǎng)7d,溫度條件為15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,測定其降油率.從圖6可知GA-4菌、GA-6菌的最適降解溫度分別為30℃，28℃.當(dāng)溫度小于30℃時(shí),降油率隨溫度的升高增大;當(dāng)溫度大于30℃時(shí),降油率隨溫度的升高有所減小.可能是因?yàn)殡S著溫度的升高,水中溶解氧濃度降低,從而抑制了菌體的新陳代謝,使降油率變低.

3.6降解前后對照

以不加菌的原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基搖瓶為對照樣.對比可以看出，GA-4菌、GA-6菌搖瓶中菌液由原來的無色透明液體變?yōu)槿辄S色,說明搖瓶中的菌體濃度增大;搖瓶中的原油量減少,已無油顆粒存在,乳化效果很好,原油降解效果明顯.

4結(jié)論

(1) 通過菌種的初篩、復(fù)篩分離得到2株優(yōu)勢降油菌,經(jīng)初步鑒定GA-4菌為芽孢桿菌屬(Bacillussp.),GA-6菌為不動桿菌屬(Acinetobactersp.).

(2) 對GA-4菌、GA-6菌進(jìn)行降解條件優(yōu)化,GA-4菌、GA-6菌的最優(yōu)化降解條件分別為:30℃,pH為8.0,接種量為5%;28℃,pH為7.5,接種量為5%.

(3) 與不加菌的搖瓶對照比較,GA-4菌、GA-6菌搖瓶中菌液由無色透明液體變?yōu)榱巳辄S色,搖瓶中的原油量明顯減少,已無油顆粒存在,原油降解效果明顯.

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編輯:武暉；校對：師瑯

文章編號:1006-8341(2016)02-0269-06

DOI：10.13338/j.issn.1006-8341.2016.02.023

收稿日期：2015-12-16

基金項(xiàng)目:陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(15JK1327)

通訊作者:張建民(1963—),男，陜西省西安市人，西安工程大學(xué)副教授，研究方向?yàn)樗幚?E-mail:jm0865@sina.com

中圖分類號：X 172

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

The screening of oil reduction bacteria and its optimal degradation conditions in oil wastewater

GUOQianyu,ZHANGJianmin,LIRongrong

(School of Environmental and Chemical Engineering,Xi′an Polytechnic University,Xi′an 710048,China)

Abstract:In order to screen the efficient oil reduction bacteria, improve the oil degradation rates, and treat the petrochemical wastewater more efficiently, the water samples were collected from the wastewater treatment station of China Changqing Petrochemical Company in Xianyang city. After the domestication and purification,seventeen kinds of oil degradation strains were isolated from the samples,in which 13 strains were bacteria, the rest were actinomycetes or molds. Under the conditions of 30℃, 180 r/min of bed shaking, and 7 days cultivation, 2 strains with the best oil degradation rates were screened,which were named GA-4 and GA-6.GA-4 belongs to Bacillus sp.and GA-6 belongs to Acinetobacter sp.. When the oil concentration is 2g/L, the treatment effect is better, the degradation rates of GA-4,GA-6 are 41.18% and 34.82% respectively.And the optimal degradation condition of GA-4 is 30 ℃, pH 8.0, bacteria inoculation amount 5%; while the GA-6 is 28 ℃, pH 7.5, bacteria inoculation amount 5%.

Key words:petrochemical wastewater;oil degradation bacteria;the oil degradation rates;biochemical treatment

引文格式：郭倩瑜,張建民,李蓉蓉.含油廢水處理中石油降解菌的篩選及其降解條件優(yōu)化[J].紡織高?；A(chǔ)科學(xué)學(xué)報(bào),2016,29(2)：269-274.

GUO Qianyu,ZHANG Jianmin,LI Rongrong.The screening of oil reduction bacteria and its optimal degradation conditions in oil wastewater[J].Basic Sciences Journal of Textile Universities,2016,29(2):269-274.