文 / 山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝 沈志強山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 王金良 莫 玲

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豬細小病毒、豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

文 / 山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝 沈志強
山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 王金良 莫 玲

摘 要根椐GenBank中等錄的豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒核苷酸序列，分別設(shè)計3對引物，在建立各病毒單項PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件，建立了3種病毒的多重PCR檢測方法，用這3對引物對同一樣品中的PPV、PRV、PCV2核酸模板進行多重PCR擴增，結(jié)果可同時擴增PPV的475bp，PRV的689bp，PCV2的245bp的特異性片段，而對其他4種病原的PCR擴增結(jié)果均為陰性。敏感性測定結(jié)果表明，該多重PCR技術(shù)能檢出10pg的PPV、10pg的PRV和1pg的PCV2模板。用65份臨床病料對本研究多重PCR技術(shù)和單項PCR技術(shù)進行對比驗證，結(jié)果顯示：兩者的總符合率為100%。表明建立的多重PCR檢測方法，具有特異、快速、準確的特點，可用于對這三種病毒的同時檢測、鑒別和診斷。

關(guān)鍵詞多重聚合酶鏈式反應(yīng)；豬細小病毒；豬偽狂犬病毒；豬圓環(huán)病毒2型

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)會導致感染母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及產(chǎn)出的仔豬病弱[1]。豬偽狂犬病毒(Porcine Pseudorabies Virus，PRV)可導致妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎，初生仔豬具有明顯的神經(jīng)癥狀，死亡率幾乎100%[2]。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus 2，PCV2)與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫等癥狀密切相關(guān)[3]。因此，這三種病毒均是豬繁殖障礙類疾病的病原體，單純根據(jù)臨床癥狀不能鑒別診斷，且三者在臨床上常呈混合感染。當同時感染兩種或三種病原時，臨床癥狀加重，將給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[4,5]。建立高效、快速、敏感的診斷方法對該3種豬病的防控非常關(guān)鍵。針對這3種病原傳統(tǒng)檢測方法耗時長、檢測敏感性較低及準確性差等。PCR檢測方法以檢測快度、靈敏度高、特異性好等特點已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病的檢測，多重PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，在一個PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的PCR診斷技術(shù)，具有簡便、快速、敏感、特異、易于操作和鑒別多種病原的等優(yōu)點，即可以節(jié)約時間，又可以節(jié)省人力和物力[6]，適合大量臨床樣品(特別是混合感染樣品)中病原體的快速診斷。本文選擇PPV VP2、PRVgD和PCV2、ORF2保守基因序列設(shè)計引物，優(yōu)化了反應(yīng)條件，建立一種可用于上述3種病毒的多重PCR診斷方法，并對臨床病料進行檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍耳病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、流行性乙型腦炎病毒(JEV)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學與動物生物技術(shù)重點開放實驗室提供。

1.2 工具酶及試劑盒

Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs、DL2000 Marker等試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司產(chǎn)品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司，其他化學試劑如氯仿、異丙醇、乙醇等，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計與合成

參考GenBank中登錄的PPV(JQ710901)、PRV(KF017337)和PCV2(DQ104423)基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計3對特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用滅菌水溶解并配成15pmol/mL溶液備用。

1.4 病毒基因組的提取

取感染PPV、PRV、PCV2的細胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，經(jīng)12,000 rpm離心20 min，取上清作為待測樣品。按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書分別提取提取PPV、PRV、PCV2的DNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化

最適退火溫度的確定：分別以50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃的退火溫度進行梯度PCR反應(yīng)，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。

最適引物濃度的確立：在25μL PCR反應(yīng)體系中分別以0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.6pmol/ μL、0.8pmol/μL和1.0pmol/μL的引物濃度進行PCR擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物濃度，篩選出多重PCR反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)模式。

1.6 特異性試驗

用已建立的多重PCR擴增，分別對PPV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV和JEV 的模板進行擴增，擴增反應(yīng)同時設(shè)雙蒸水陰性對照，擴增反應(yīng)結(jié)束后進行凝膠電泳檢測，以檢驗多重PCR的特異性。

1.7 多重PCR的敏感性試驗

分別提取PPV、PRV和PCV2的DNA，用儀器測定含量，并依次做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取lμL為模板，采用已優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)條件分別對上述不同稀釋度的DNA 進行多重PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后進行凝膠電泳檢測，以檢測建立的多重PCR的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗

用建立的多重PCR檢測方法分別對PPV感染的8份陽性樣品，PRV感染6份陽性樣品，PCV2感染的5份陽性樣品及5份陰性樣品重復(fù)檢測3次，以驗證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測

對山東、河南、江西、福建、四川和吉林等省65份送檢疑似病料進行多重PCR檢測。

表1 PPV、PRV和PCV2 基因擴增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對PPV、PRV和PCV2 3種引物濃度及多重PCR擴增溫度、時間和循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化，最后確定多重PCR中最佳引物濃度分別為PPV 0.4pmol/μL、PRV 0.6pmol/μL、PCV2 0.6pmol/μL，多重PCR的最佳反應(yīng)模式為：94℃ 5 min，94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45 s，30個循環(huán)，最后 72℃ 延伸10 min。

2.2 擴增產(chǎn)物的檢測

將PPV、PRV和PCV2的核酸分別進行多重PCR擴增，結(jié)果能擴增出與預(yù)期相符，PCV2的245bp，PPV的475bp，PRV的689bp的特異性片段，而對照組擴增不出任何條帶，其擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。

2.3 特異性試驗

采用建立的多重PCR方法對PPV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV和JEV在相同的條件進行擴增。結(jié)果顯示，PPV、PRV和PCV2的PCR產(chǎn)物的片段長度分別為475bp、 689bp和245bp，與預(yù)期大小一致，而CSFV、PRRSV、PEDV和JEV均未擴增出片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，說明本研究建立的多重PCR方法特異性強。

M：DL2000 MarKer，1：PPV PCR產(chǎn)物，2：PRV PCR產(chǎn)物，3：PCV PCR產(chǎn)物，4～5：3對引物的空白對照。圖1 單項PCR擴增結(jié)果

2.4 敏感性試驗

提取PPV、PRV、PCV2基因組DNA，用儀器測定含量，然后做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1μL，作為模板。結(jié)果顯示用10pg的PPV、10pg的PRV、1pg的PCV2可以擴增出特異性條帶(見圖3)。表明該多重PCR敏感性強。

M：DL2000 MarKer，1:PPV+PRV+PCV2，2:PPV+ PCV2，3:PRV+ PCV2，4:PPV +PRV，5:CSFV，6：PRRSV，7:PEDV，8:JEV，9:空白對照。圖2 三重PCR的特異性試驗

2.5 重復(fù)性試驗

M：DL2000 MarKer，1：100ng PPV+100ng PRV+100ng PCV2，2：10ng PPV+10ng PRV+10ng PCV2，3：1ng PPV+1ng PRV+1ng PCV2，4：100pg PPV+100pg PRV+100pg PCV2，5：10pg PPV+10pg PRV+10pg PCV2，6：1pg PPV+1pg PRV+1pg PCV2，7：100fg PPV+100fg PRV+100fg PCV2，8：10fg PPV+10fg PRV+10fg PCV2，9：空白對照。圖3 三重PCR的敏感性試驗

表2 被檢病料單項PCR與多重PCR檢測對比試驗結(jié)果

經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，表明本研究建立的多重PCR方法是穩(wěn)定可靠的。

2.6 臨床樣品的檢測

對65份在不同地區(qū)采集的疑似病料，用建立的多重PCR和單項PCR進行了檢測，兩者符合率達100%(見表2)，結(jié)果表明建立的多重PCR檢測體系的特異性和敏感性較好。

3 討論

在多重PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計很重要，對多重PCR反應(yīng)是否成功起著決定性的作用。

本研究分別針對PPV VP2、PRV gB和PCV2 ORF2保守基因序列設(shè)計引物，在這3種病毒中，由于PPV基因組序列的G+C含量較低，而PRV屬于皰疹病毒科，其G+C含量較高，達73%，因此，在設(shè)計引物時，將擴增PCV2、PPV、PRV這3對引物的G+C含量控制在45%～60%，這樣能確保所有的引物在相近的退火溫度進行多重PCR擴增，為成功進行多重PCR反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。最后確定多重PCR中最佳引物濃度分別為PPV、 PRV和PCV2最佳引物濃度分別為0.4pmol/μL、0.6pmol/μL和0.6pmol/ μL。多重PCR的最佳退火溫度為56℃。該多重PCR方法具有良好的特異性，對PPV、PRV和PCV2的擴增片段大小分別為475bp、689bp和245bp，對CSFV、PRRSV、PEDV和JEV擴增結(jié)果均為陰性。該法敏感性高，對PPV、PRV和PCV2的最低檢測量分別為10pg、10pg和1pg。

4 結(jié)論

本研究用建立的多重PCR方法對來自山東、河南、江西、福建、四川和吉林等省的65份病料進行檢測，同時進行單項PCR檢測，結(jié)果顯示，多重PCR方法與單項PCR檢測結(jié)果符合率為100%。共檢出PPV陽性樣品8份，PRV陽性樣本22份，PCV2陽性樣品14份，二重混合感染陽性樣品8份，三重混合感染陽性樣品3份。多重PCR方法比單項PCR檢測方法可節(jié)省70%的時間和2/3的試劑用量，減少了污染環(huán)境的機會，對臨床上豬細小病毒病、豬偽狂犬病毒病和豬圓環(huán)病毒病的檢測具有較好的應(yīng)用價值。

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基金項目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-06-011-14)。