蘆永昌，錢 帥，毛繼祖，許生勝，馬禪娟

（1. 青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2. 青海省青藏高原植物化學(xué)重點實驗室）

柳蘭中總黃酮含量的測定

蘆永昌1，2，錢 帥1，2，毛繼祖1，2，許生勝1，馬禪娟1

（1. 青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2. 青海省青藏高原植物化學(xué)重點實驗室）

利用正交實驗對分離提取條件進行優(yōu)化，研究柳蘭中黃酮類化合物的分離提取和測定方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用AlCl3顯色—分光光度法測得柳蘭中總黃酮含量為1.60%，樣品平均回收率99.15%，RSD為1.51%（n=5）。結(jié)果表明，最佳分離提取條件為：乙醇濃度為50%，固液比為1∶30（g?mL-1），提取溫度為95℃，提取時間為4h。

柳蘭;總黃酮;分光光度法; AlCl3顯色法

柳蘭為柳葉菜科柳蘭屬植物柳蘭的全草，生長在海拔2700～4200m的山坡林緣及河谷濕草，分布于西北地區(qū)，味辛、苦，性平；有小毒;有利水滲濕，理氣消脹，活血調(diào)經(jīng)之功效。柳蘭的藏藥名為“貢布甲班區(qū)孜”，可治風(fēng)寒濕熱、瘡癤疹毒、皮膚瘙癢。藥理研究表明，柳蘭有抗炎、抗氧化、抗焦慮及抑制前列腺細(xì)胞增殖的作用。柳蘭全草含槲皮素，金絲桃苷等黃酮或多酚類化合物，但至今還未見對柳蘭中總黃酮含量測定的相關(guān)研究報道。本研究以蘆丁為對照品，通過AlCl3顯色法對柳蘭中總黃酮的含量進行測定，以期為其生物活性評價及藥理作用研究提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

蘆丁對照品（批號：20040412，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（沸程：60～90℃）；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、氯化鋁均為分析純。

柳蘭于2015年7月采自青海省互助縣北山林場，經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院毛繼祖教授鑒定，陰干粉碎，過80目篩保存待用。

1.2 儀器

FW7362M/24電子分析天平（德國制造）；SHB-111循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

2 試驗方法

2.1 柳蘭樣品的預(yù)處理

取待用柳蘭樣品用濾紙包好，放入索氏提取器中用石油醚加熱提取6h后置于通風(fēng)處晾干。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品，加適量無水乙醇溶解，稍加熱溶解，冷卻后移入容量瓶，用乙醇定容。

2.3 柳蘭中總黃酮的提取

精密稱取2.00g經(jīng)石油醚抽提后的柳蘭樣品，置于圓底燒瓶中，按固液比為1∶30（g?mL-1）加入50%的乙醇溶液，在95℃的溫度下加熱回流提取4h，將提取液過濾后定容于100mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0mL、0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mL、2.20mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于7個25mL容量瓶中，各加入1%的AlCl3溶液3.00mL，用10%的乙醇定容，顯色20min后在417nm處測定吸光度，同時以未加標(biāo)準(zhǔn)蘆丁的溶液作空白參比。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度c為橫坐標(biāo)作圖，回歸方程為：A=28.766c+0.0062，R=0.9998。

2.5 樣品中總黃酮含量的測定

取適量樣液于25mL容量瓶中，按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的步驟，同時做試劑空白，以試劑空白為對照，于417nm處測定吸光度A；計算柳蘭中總黃酮的含量（%），重復(fù)5次，取平均值。按下列公式計算：柳蘭中總黃酮含量=c×V1×V2/ (V3×W×1000)×100%，式中：c為由回歸方程計算得到的待測液的濃度，V1為提取液體積（mL）；V2為稀釋后提取液體積（mL）；V3為移取樣液的體積（mL）；W為柳蘭的重量。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯色方法的選擇

采用兩種顯色方法：在堿性條件下的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和在酸性條件下的AlCl3顯色法分別實驗。兩種方法顯色機理不同，前者顯色后溶液為橙紅色，而酸性條件下AlCl3顯色法為黃色溶液。在300～600nm檢測最大波長，見圖1和圖2。

圖1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法吸收曲線

圖2 酸性條件下AlCl3顯色法的吸收曲線

由圖1-2可見，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)AlCl3顯色后在417nm處有較明顯的吸收峰，而NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法中蘆丁與Al3+配合物在可見光波長范圍內(nèi)（390～780nm）的峰值在510nm左右，但該處的吸收峰相對于AlCl3顯色法較弱。考慮到柳蘭的黃酮提取液樣品中可能含有較多的雜質(zhì)，且在堿性條件下，有些非黃酮類物質(zhì)會在510nm附近有最大或較強吸收，因而選用AlCl3顯色法測定柳蘭中黃酮類化合物具有更好的專屬性。

3.2 溶劑的選擇及樣品預(yù)處理

黃酮類物質(zhì)水溶性較差，醇溶性較好，常用甲醇和乙醇作提取溶劑，但考慮到甲醇的毒性，而且乙醇不僅可以去除一部分親水性蛋白質(zhì)、果膠及其他水溶性雜質(zhì)，而且毒性小，價格低廉，可以回收利用，因此采用乙醇作為提取溶劑。但直接將柳蘭用乙醇提取，會不可避免地將脂溶性色素一起提取出來，為了消除葉綠素等物質(zhì)的影響，本試驗采用60～90℃沸程石油醚索氏提取6h的方法進行簡單的提純，排除部分干擾物質(zhì)。樣品經(jīng)石油醚脫脂、脫色脫蠟處理可提高總黃酮的提取率。這可能是由于蠟質(zhì)的破壞及脂類的消除，有利于極性提取劑的滲透和黃酮類物質(zhì)的滲出。

3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響柳蘭總黃酮提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗，選擇乙醇的濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4 個因素，采用四因素三水平 L9（34）正交試驗表安排試驗，確定最佳提取工藝，因素及水平見表1，試驗分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗中的因素及水平

表2 正交試驗結(jié)果分析

表3 方差分析

由表2分析結(jié)果可知，因素C和D的第3水平較好，因素A的第1水平較好， 因素B的3個水平差別不大。于是選出來的最優(yōu)提取條件是A1B1C3D3，即柳蘭中總黃酮的最佳提取分離條件是：乙醇濃度為50%，固液比為1∶30（g?mL-1），提取溫度為95℃，提取時間4h。由表3可知，因素C、D高度顯著，因素A、B不顯著。影響柳蘭中總黃酮提取的個因素主次順序為：提取時間>提取溫度>乙醇濃度>料液比。

3.4 柳蘭中總黃酮含量的測定

在最佳提取條件下，用AlCl3顯色法測得柳蘭中總黃酮含量為1.60%（RSD%=0.61，n=5）。

4 方法學(xué)考察

由于AlCl3顯色法測定結(jié)果較NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定結(jié)果準(zhǔn)確，對AlCl3顯色法在線性關(guān)系良好的基礎(chǔ)上進一步進行方法學(xué)考察。

4.1 穩(wěn)定性實驗

按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時采用的顯色方法在417nm處測定吸光度的穩(wěn)定性，每隔5min測一次，結(jié)果表明，該方法在30min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.2 精密度實驗

精密量取定容后的提取液，加入配好的AlCl3溶液，再用10%乙醇定容至25mL，待20min后在417nm下測定吸光度，測得RSD%為0.14%（n=5）。

4.3 回收率實驗

稱取已知含量經(jīng)石油醚抽提后的柳蘭干品5份，每份0.75g，分別加入適量的蘆丁對照品，按照前述操作進行處理，測定吸光度，計算平均回收率99.15%，RSD%為1.51（n=5）。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

5 小結(jié)

實驗結(jié)果表明：柳蘭中黃酮類化合物的最佳分離提取條件為：乙醇濃度為 50%，固液比為1∶30（g?mL-1），提取溫度為95℃，提取時間為4h。用 AlCl3顯色法測得柳蘭中總黃酮的含量為1.60%，樣品平均回收率為99.15%，RSD 值為1.51%。

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Assay Study on Total Flavanoids in Chamaenerion angustifolium

LU Yongchang1,2, QIAN Shuai1,2, MAO Jizu1,2, XU Shengsheng1, MA Chanjuan1
(1. College of Pharmacy, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China; 2. Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research)

This paperi, the extraction and separation of the total flavones from Cham aenerion angustifolium were studied. The extraction process conditions were optimized by using orthogonal test. Under the above conditions,the content of total flavones from dry Cham aenerion angustifolium was 1.60%. The average recovery rate and RSD were 99.15% and 1.51% respectively（n = 5）. Results showed that the optimal extraction conditions were as ethanol concentration 50%，ratio of raw material to ethanol solution 1∶30（g?mL-1），extraction temperature 95 ℃ and extraction time 4 h.

cham aenerion angustifolium; total flavonoids; UV-Vis spectrophotometry; AlCl3coloration

R284

A

1003-4749（2016）11-0013-04

2016-07-15

青海省重點實驗室發(fā)展專項（2014-Z-Y13），青海民族大學(xué)校級理工自然科學(xué)項目（2015XJZ05）

蘆永昌(1965-)，男，陜西藍(lán)田人，教授，主要從事中藏藥質(zhì)量控制工作。