陳 勝， 閔紅葉， 周書琴， 張中琳， 江波杰， 郭長峰

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院急診醫(yī)學科，上海 200072； 2. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院護理部，上海 200072)

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·基礎(chǔ)研究·

亞低溫對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡和caspase-3釋放的影響

陳 勝1， 閔紅葉2， 周書琴1， 張中琳1， 江波杰1， 郭長峰1

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院急診醫(yī)學科，上海 200072； 2. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院護理部，上海 200072)

目的 從信號轉(zhuǎn)導及細胞凋亡角度，研究亞低溫對大鼠腦缺血再灌注損傷(I/R)的腦保護作用及機制。方法 72只雄性健康SD大鼠，隨機分成假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、亞低溫組(M組)，每組24只；三組缺血10min后分別按再灌注12h、24h、48h，再分為3個亞組，各亞組動物均為8只。大鼠腦缺血再灌注損傷模型制作采用改良四血管阻滯法，免疫組化SP法動態(tài)觀察各個時間點海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白的變化；光鏡和電鏡分別觀察再灌注48h亞組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)和線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果 (1) 大鼠腦缺血再灌注損傷后12h海馬CA1區(qū)caspase-3即有明顯表達，24h達高峰，48h后仍有較高表達；(2) IR組和M組各時間點caspase-3表達水平比S組明顯升高(P<0.05)；24h亞組線粒體超微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)細胞形態(tài)受損嚴重；(3) M組各個時間點caspase-3表達水平較IR組明顯下降(P<0.05或P<0.01)；24h亞組線粒體超微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元形態(tài)均有不同程度的改善。結(jié)論 亞低溫對caspase-3依賴的線粒體凋亡通路有干預作用，通過維持線粒體膜穩(wěn)定，抑制釋放和激活caspase-3蛋白，保護線粒體的形態(tài)功能，從而減少神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，發(fā)揮腦保護作用。

亞低溫； 腦缺血再灌注損傷； caspase-3

亞低溫(核心溫度32～34℃)對腦缺血再灌注損傷(I/R)后的神經(jīng)保護作用已在臨床上得到肯定，目前認為亞低溫的腦保護作用與大多數(shù)腦保護劑具有同等功效，但其作用機制尚不清楚。腦I/R與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系，凋亡被認為是腦I/R后神經(jīng)元死亡的重要方式之一。近來研究發(fā)現(xiàn)，低溫能選擇性地抑制神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生[1-2]。本實驗旨在通過檢測亞低溫對急性腦I/R 后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞病理形態(tài)和線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，以及對caspase依賴的線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白caspase-3表達的影響，從信號轉(zhuǎn)導及細胞凋亡角度研究亞低溫對腦I/R的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

72只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320g，隨機分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、亞低溫組(M組)，每組24只，三組缺血10min 后分別按再灌注12h、24h、48h，再分為3個亞組，各亞組動物均為8只。所有動物由同濟大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，實驗前3d適應環(huán)境，自由飲水和進食。

1.2 制作模型

大鼠全腦缺血再灌注損傷模型采用改良的四血管阻滯法建立。(1) 稱質(zhì)量及麻醉： 使用10%水合氯醛，按0.35ml/100g劑量腹腔注射，麻醉大鼠，待其四肢癱軟后取出。(2) 毀損或分離雙側(cè)椎動脈： 將大鼠腹臥位固定在定位儀上，頭與軀干向前屈曲30°，正中頸后切口長約1cm，將第一頸椎兩側(cè)橫突翼小孔暴露；凝閉雙側(cè)椎動脈，消毒后縫合肌肉和皮膚，回籠。(3) 夾閉或分離雙側(cè)頸總動脈和腦電監(jiān)測： 24h后大鼠稱質(zhì)量，再次給予10%水合氯醛按0.35ml/100g劑量腹腔麻醉，待麻醉后將銀制電極分別插入背部皮下額部及鼻顳部供腦電監(jiān)測。記錄正常腦電圖打標并保存。大鼠重新背位固定，頸正中切口2～3cm，分離暴露雙側(cè)頸總動脈，在頸總動脈下備留一根5-0絲線備用，缺血時，提拉兩端線頭，待動物清醒后，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，造成全腦缺血，并及時記錄腦電圖和記錄時間，腦電圖波幅下降至缺血前波幅25%以下，或呈一直線標志為全腦缺血模型成功。松開動脈夾恢復腦血流 10min 后即為再灌注。約15min后，腦電圖逐漸回復至原圖形波幅高度，縫合創(chuàng)口，回籠飼養(yǎng)。(4) 分 組造模： S組僅分離出雙側(cè)頸總動脈而不夾閉，暴露雙側(cè)椎動脈不凝閉。M組在腦缺血開始后立即向大鼠背部噴灑乙醇，用冰袋覆蓋其身，鼓膜溫度在10min之內(nèi)可低至33±0.5℃，改變燈泡、冰袋位置維持此溫度3h，亞低溫完成后用白熾燈烘烤使鼓膜溫度達到正常至蘇醒；S組，I/R組在整個手術(shù)過程中鼓膜溫度始終維持在37±0.5℃至蘇醒。(5) 在整個實驗過程中，用白熾燈照射動物，以維持鼓膜溫度在37℃左右直到恢復活動。再灌注前后觀察動物翻正反射、瞳孔變化、腦電圖等，以判斷是否發(fā)生全腦I/R。

1.3 模型成功標準

1.4 采集標本

所有大鼠分別于再灌注12h、24h、48h后用10%水合氯醛按0.35ml/100g劑量腹腔注射麻醉，處死暴露心臟，用0.9%生理鹽水250ml經(jīng)心臟快速灌注，隨后以體積分數(shù)為4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS，40℃，pH 7.14)250ml經(jīng)心臟灌注沖洗約0.5h。冰上快速取腦，在腦冠狀切面，視交叉后約1.5mm處切開腦組織，向后切取標本5mm。4℃ 4%多聚甲醛固定24h后，常規(guī)沖洗、脫水、透明、包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，做免疫組化實驗。同時，每組隨機抽取再灌注24h亞組大鼠兩只，麻醉后處死，取視交叉后1.5mm厚腦海馬組織浸泡于4℃ 3%戊二醛中固定、脫水、透明、包埋、切片、染色，做超微電鏡觀察。

1.5 指標檢測

1.5.1 caspase-3蛋白檢測 免疫組化SP法按試劑盒說明進行操作，檢測caspase-3蛋白表達水平。顯微鏡下控制DAB顯色時間，常規(guī)封片。陽性細胞為棕黃色顆粒出現(xiàn)在胞漿中，胞核不著色。切片圖像分析采用HPIAS-2000圖像分析系統(tǒng)(同濟大學醫(yī)學院病理教研室提供)，分析過程中光源強度相同，所有切片放大400倍，測試每張切片caspase-3陽性細胞的平均光密度值。

1.5.2 光鏡觀察 所有切片采用蘇木精伊紅(H-E)染色，通過光鏡觀察各組再灌注24h亞組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)改變。

1.5.3 透射電鏡觀察 鋨酸和戊二醛雙重固定，脫水、環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，采用硝酸鉛和醋酸鈾雙重染色，透視電鏡(日立H-600型，同濟大學醫(yī)學院病理教研室提供)觀察大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 caspase-3免疫組化結(jié)果

(1) 腦I/R后大鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白在再灌注12h即有明顯表達，于再灌注24h達高峰，48h仍有較高表達；(2) S組海馬CA1區(qū)僅有極少量的caspase-3表達，各亞組間比較，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IR組和M組各時間點caspase-3表達水平比S組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01);(3) M組各個時間點caspase-3表達水平較IR組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見表1，圖1。

表1 腦I/R后caspase-3的活化表達

項目12h亞組24h亞組48h亞組S組0．0768±0．00770．0787±0．00550．0815±0．0062IR組0．2341±0．0192#0．3846±0．0783#0．3570±0．0184#M組0．2160±0．0057#△0．2567±0．0119#▲0．2463±0．0136#▲

#P<0.01，vsS group；△P<0.05，▲P<0.01，vsIR group

2.2 H-E染色光鏡觀察

S組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列規(guī)整，無明顯水腫或皺縮，細胞間隙大致正常，數(shù)量無明顯增減，無炎性細胞浸潤，見圖2A。IR組較S組神經(jīng)細胞破壞嚴重，排列紊亂，細胞水腫破壞明顯，極少見正常神經(jīng)細胞，部分細胞胞漿呈強嗜酸性變，胞核濃縮深染明顯，可見核仁消失，細胞核固縮、碎裂和溶解，可見大量炎性細胞浸潤，細胞間隙明顯增寬，見圖2B。相比IR組，M組神經(jīng)細胞受損情況明顯減輕，接近于S組，神經(jīng)細胞呈輕度皺縮或水腫，細胞間隙稍增寬，數(shù)量大致正常，排列較整齊，浸潤的炎性細胞也較IR組明顯減少，見圖2C。

圖1 腦I/R后海馬caspase-3蛋白免疫組化結(jié)果(SP×400)Fig.1 Expression of caspase-3 at hippocampus CA1 region after I/R(SP×400)1A： Expression of caspase-3 in S 24h subgroup 1B： Expression of caspase-3 in IR 24h subgroup 1C： Expression of caspase-3 in M 24h subgroup

圖2 腦I/R后24h海馬CA1區(qū)光鏡結(jié)果(H-E×400)Fig.2 Cellular morphology at hippocampus CA1 region at 24 hours after I/R under the light microscope(H-E×400)2A： S 24h subgroup 2B： IR 24h subgroup 2C： M 24h subgroup

2.3 透射電鏡觀察

S組海馬CA1區(qū)的超微結(jié)構(gòu)基本正常： 神經(jīng)細胞核大小形態(tài)正常，呈橢圓形，核膜光滑，可見清晰的核仁，胞質(zhì)內(nèi)可見大量正常的線粒體，胞質(zhì)密度均勻，內(nèi)可見大量排列密雜的嵴和基質(zhì)，見圖3A。IR組： 神經(jīng)細胞破壞嚴重，染色質(zhì)聚集濃縮，核仁碎裂和邊移，核膜破壞，完整性和連續(xù)性中斷。胞質(zhì)排列紊亂，密度不均，線粒體水腫明顯，部分呈空泡樣或燒瓶樣改變，其內(nèi)部基質(zhì)嵴斷裂和脫落，排列欠緊密。見圖3B。M組： 較IR組受損明顯減輕，細胞有一定程度皺縮或腫脹，細胞核內(nèi)可見染色質(zhì)點狀凝集，細胞質(zhì)密度較均勻，核膜較平滑，未見核固縮，碎裂和溶解；線粒體仍有一定程度的水腫，大多數(shù)嵴完整，排列較緊密，未見明顯內(nèi)部基質(zhì)嵴斷裂和脫落，見圖3C。

圖3 腦I/R后24h海馬CA1區(qū)透射電鏡結(jié)果(×12000)(黑白)Fig.3 Cellular morphology at hippocampus CA1 region at 24 hours after I/R under the electron microscope(×12000)3A： S 24h subgroup 3B： IR 24h subgroup 3C： M 24h subgroup

3 討 論

近年來，大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，凋亡是腦I/R后神經(jīng)元細胞死亡的重要方式之一。大量研究同時也證實，在腦I/R過程中，半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在caspase依賴的線粒體凋亡途徑中起著十分重要的作用[3]。在細胞凋亡發(fā)生的各種通路中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)被認為是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而caspase-3又在其中起著關(guān)鍵的作用[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)caspase介導了腦I/R后神經(jīng)元細胞的凋亡，且參與了遲發(fā)性神經(jīng)細胞損傷的病理生理過程，在缺血性神經(jīng)元死亡中起著十分重要的作用[5]。國內(nèi)外的相關(guān)文獻也已證實，Caspase可誘導細胞發(fā)生凋亡，caspase-3作為細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，切斷凋亡細胞與周圍細胞的聯(lián)系，直接導致凋亡細胞酶解，同時關(guān)閉DNA的修復，裂解細胞結(jié)構(gòu)蛋白，降解DNA，最后將細胞酶解并包裹形成多個凋亡小體。Jin等[6]發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注5h后caspase-3開始表達，于24h達高峰。Martin等[7]發(fā)現(xiàn)caspase-3缺陷的大鼠缺血 2h 再灌注48h凋亡細胞減少36%，大腦皮質(zhì)梗死體積減小55%，同樣證明了caspase-3與缺血再灌注損傷的關(guān)系。caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行者，它在多種生理和病理因素的刺激下，通過其家族成員的級聯(lián)放大效應，實施細胞凋亡。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，不論腦缺血前、缺血中或缺血后，早期開始亞低溫治療，盡早達到亞低溫，能明顯減輕缺血再灌注后腦組織病理形態(tài)的損害，同時能夠促進患者大腦神經(jīng)功能的恢復。亞低溫對腦缺血再灌注有明顯的保護作用[8-11]。研究去血清誘導體外神經(jīng)細胞實驗發(fā)現(xiàn)，亞低溫能夠保護去血清引起的神經(jīng)細胞凋亡，其保護作用是通過降低caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性，減少細胞色素C的釋放；降低凋亡反應中凋亡執(zhí)行蛋白和調(diào)節(jié)蛋白的活性而發(fā)揮作用。在之前的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的作用，bax引發(fā)細胞凋亡的機制不是與bcl-x和bcl-2的相互作用，而是通過與線粒體上的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)和核苷酸腺嘌呤易位子(ANT)形成異源二聚體，轉(zhuǎn)位于線粒體，直接導致線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔復合體(PTPC)的構(gòu)型發(fā)生改變，增加線粒體膜的通透性，從而引發(fā)線粒體釋放Cyt-C，進一步激活caspase級聯(lián)反應。

本實驗結(jié)果顯示，大鼠IR組caspase-3蛋白表達水平較假手術(shù)組顯著增加，神經(jīng)細胞病理形態(tài)和線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯受損，腦I/R后海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白在再灌注12h即有顯著表達，于再灌注24h達峰值，之后表達逐漸減少。研究結(jié)果提示caspase依賴的線粒體凋亡途徑參與了腦I/R 后神經(jīng)細胞凋亡的調(diào)控。給予亞低溫治療后，通過穩(wěn)定線粒體膜，減少線粒體內(nèi)部基質(zhì)脫顆粒和嵴斷裂，阻止部分線粒體內(nèi)膜間隙cyt-C蛋白的激活和釋放，進一步保護線粒體的形態(tài)和功能，從而減少細胞凋亡的發(fā)生，在線粒體水平上發(fā)揮腦保護作用。

總之，亞低溫對caspase依賴的線粒體凋亡途徑有調(diào)控作用，通過穩(wěn)定線粒體膜，保護線粒體的形態(tài)和功能，抑制caspase-3的激活和釋放，從而減少細胞凋亡的發(fā)生，發(fā)揮腦保護作用，這可能是其治療腦I/R的部分作用機制。有關(guān)亞低溫治療腦I/R是否還存在其他具體分子機制和凋亡通路有待進一步的探索證實。

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doi： 10.16118/j.1008-0392.2016.06.007

Effects of subhypothermia on apoptosis and caspase-3 expression in neuronal cells after cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

CHENSheng1，MINHong-ye2，ZHOUShu-qin1，ZHANGZhong-lin1，JIANGBo-jie1，GUOChang-feng1

(1. Dept. of Emergency Critical Care， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China; 2. Dept. of Nursing， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China)

Objective To explore the effects and mechanism of subhypothermia on apoptosis and caspase-3 expression in neuronal cells after cerebral ischemia/reperfusion(IR) injury in rats. Methods Seventy two healthy male SD rats were randomly divided into three groups： group S(sham operation group)， group IR(ischemia/ reperfusion) and group M(subhypothermia treated group)， 24 rats in each group. The model of focal cerebral ischemia reperfusion injury was established by using Pulsinelli’s method. Rats in each group were further divided into 3 subgroups(n=8 in each)， which were treated with 10min ischemia， then 12h， 24h or 48h cerebral reperfusion， respectively. The expression of caspase-3 in neuronal cells were examined by immunohistochemical SP method， the pathological changes and mitochondria ultrastructure of neuronal cells in hippocampus CA1 region were observed by light microscope and electron microscope at 24h after reperfusion. Results The expression of caspase-3 started to increase at 12h after reperfusion， reached the peak at 24h and remained high level at 48h. Compared with group S， the expression of caspase-3 in group IR and M were increased significantly(P<0.01). The pathological changes of nerve cells and mitochondria ultrastructure were exacerbated at 24h after reperfusion. Compared with IR group ， the expression of caspase-3 in group M were decreased significantly(P<0.05 orP<0.01); and the pathological changes of nerve cells and mitochondria ultrastructure were attenuated at 24h after reperfusion. Conclusion Subhypothermia protects rat neuronal cells from ischemia/perfusion injury through stabilizing mitochondria membranes and inhibiting the caspase-3-dependent apoptosis.

subhypothermia； cerebral ischemia/reperfusion injury； caspase-3

10.16118/j.1008-0392.2016.06.004

2016-06-17

陳 勝(1984—)，男，主治醫(yī)師，博士研究生.E-mail： chensheng0302@163.com

R 743.3

A

1008-0392(2016)06-0018-05