趙連前,張 宇,回 薔,郭冰玉,常 鵬,陶 凱

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實驗研究

富血小板凝膠對金黃色葡萄球菌的體外抗菌性研究

趙連前,張 宇,回 薔,郭冰玉,常 鵬,陶 凱

目的 探究人體富血小板凝膠(PRG)對金黃色葡萄球菌的體外抗菌作用；對比觀察不同濃度富血小板凝膠對金黃色葡萄球菌的體外抗菌作用。方法 分別取20例健康志愿者外周靜脈血30 ml，制備不同濃度富血小板凝膠,血小板濃度依次為1.8×1012/L(PRG1組)、1.2×1012/L(PRG2組)、0.6×1012/L(PRG3組)。通過體外抗菌實驗觀察不同濃度PRG在甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)溶液中孵育1、2、4、8、12、24 h后的抗菌效果。結果 在孵育開始后，各濃度PRG菌落計數(shù)明顯少于PBS對照組，PRG對MRSA和MSSA均有明顯的抗菌作用(P<0.05)，各濃度PRG抗菌作用均在孵育2 h后最明顯，隨后逐漸下降；同一時間PRG1、PRG2和PRG3的抑菌率依次下降，與其含血小板濃度呈正相關關系，各組間菌落計數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在孵育12 h后，細菌生長進入穩(wěn)定期，各組抑菌率明顯下降，各組菌落計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 在一定時間內，PRG對MSSA和MRSA均有明顯的抑制作用，PRG的抗菌作用與血小板濃度呈正相關關系。

富血小板凝膠； 抗菌肽； 抗菌作用； 金黃色葡萄球菌； 體外研究

近年來，隨著金黃色葡萄球菌耐藥性的產(chǎn)生和耐藥菌株增加，控制其感染逐漸成為臨床一大難題。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是自體全血經(jīng)梯度離心、分離得到的血小板濃縮物。PRP與激活劑按一定比例混合，即得富血小板凝膠(platelet rich gel，PRG)。PRG中因含有大量高濃度生長因子，能促進創(chuàng)面修復和組織再生，現(xiàn)已作為一種新興的治療方法，廣泛應用于促進骨折愈合[1-2]、脂肪移植[3-5]、面部年輕化[6-9]等整形外科領域，且取得了良好的臨床效果。但PRG抗菌機制還有待進一步研究。自2015年6月至2015年12月，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院整形外科通過體外實驗探究健康人不同濃度的PRG對甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抗菌作用，以期為PRG應用于臨床治療感染提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 主要試劑

甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌菌株(MSSA)ATCC25923、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株(MRSA)ATCC43300(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科提供)；哥倫比亞血培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；凝血酶凍干粉(一格制藥有限公司)；氯化鈣(國藥集團)。

1.2 主要儀器及工具

ELITIST 5K-R低速冷凍離心機(長沙市鑫奧儀器儀表有限公司)，XT 1800i全自動血細胞分析儀(日本希森美康)，恒溫箱(日本三洋公司)，densicCHEK plus比濁儀(法國梅里埃公司)，一次性無菌真空采血管(廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司)，移液器(德國EPPENDORF公司)，15 ml無菌離心管。

1.3 研究對象

健康志愿者20例。男性10例，女性10例；年齡18～35歲，平均(27.4±3.4)歲。志愿者納入標準：近6個月內未服用抗炎藥、抗生素；未行免疫抑制治療；無任何系統(tǒng)疾?。粺o癌癥既往史和吸煙史；血紅蛋白濃度不低于110 g/L，血小板數(shù)量1.5×1011～2.5×1011/L。采血后的樣品隨機匿名編號。所有志愿者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.4 實驗方法

1.4.1 PRP制備 取健康志愿者血液30 ml，用2步離心法提取PRP、貧血小板血漿 (platelet-rich gel，PPP)，2次離心的條件分別為：25℃、1400 r/min、離心15 min和25℃、3500 r/min、離心10 min。測定PRP、PPP濃度后，將PRP分為3份，用PPP將PRP中血小板濃度依次稀釋為1.8×1012/L(PRG1組)、1.2×1012/L(PRG2組)、0.6×1012/L(PRG3組)。1000 IU凝血酶凍干粉中加入1 ml氯化鈣，混勻制備激活劑。在使用前，將PRP與激活劑以4∶1的比例混合，并勻速攪拌。

1.4.2 體外抗菌實驗 在生物安全柜中，用接種環(huán)將實驗菌株ATCC 25923，ATCC 43300接種在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，(34±1)℃恒溫培養(yǎng)16 h。用無菌棉簽取1個菌落，加入含 3 ml PBS的試管中，搖勻，(34±1)℃恒溫孵育2 h。用PBS配制0.5麥氏濃度菌懸液，金黃色葡萄球菌濃度大約是1.5×108CFU/L，并將此稀釋為2×106CFU/ml。將200 μl 2×106CFU/ml MSSA、MRSA懸液分別加入200 μlPBS及不同濃度PRG中，放入(34±1)℃恒溫箱。分別于1、2、4、8、12、24 h依次取樣并稀釋，取100 μl涂布平板，將平板放入(34±1)℃恒溫箱培養(yǎng)，18 h后觀察并記錄各平皿菌落數(shù)。

1.4.3 抑菌率的計算 繪制時間-抑菌曲線圖，計算各實驗組和PBS對照組相比減少的細菌比例，即抑菌率。實驗重復3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌體外抑菌實驗

不同濃度PRG對MSSA、MSSA抗菌效果如圖1，2所示，呈先上升后下降趨勢。孵育開始后各濃度PRG中的菌落計數(shù)開始下降，2 h達最低點，此時抗菌效果最明顯，隨后菌落計數(shù)開始上升，直至12 h后細菌生長進入穩(wěn)定期，PRG1、PRG2、PRG3組菌落計數(shù)在12 h內組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PBS組菌落計數(shù)在孵育開始即呈對數(shù)上升，12 h后趨于平穩(wěn)，細菌生長進入穩(wěn)定期。各濃度PRG組菌落計數(shù)在12 h內均低于PBS組，各時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即PRG組在12 h內有抗菌性；在同一時間點各PRG組菌落計數(shù)由高到低依次為PRG3、PRG2、PRG1，各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。12 h后各濃度PRG菌落計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，生長趨勢平穩(wěn)，細菌生長進入穩(wěn)定期。

2.2 不同濃度PRG在不同時間的抑菌率

各濃度PRG對MSSA、MRSA的抗菌作用在12 h內很明顯，在4 h時抑菌率最高，可達52%，4 h后抑菌率逐漸下降，24 h降到最低。在12 h內，同一時間PRG1、PRG2、PRG3的抑菌率依次下降，與血小板濃度呈正相關關系，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。12 h后各組間抑菌率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，2。

3 討論

早在1992年，MR Yeaman等就發(fā)現(xiàn)兔子的血小板在體外由凝血酶激活后，可以釋放有廣譜抗菌作用的抗菌多肽，這些多肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌病原體均有一定的抗菌性。1997年，MR Yeaman等繼續(xù)對兔子血小板釋放的有效體外抗菌活性多肽進行研究，發(fā)現(xiàn)并提純了7種抗菌多肽，對這7種抗菌多肽進行氨基酸分析，分別表示為PMP-1，PMP-2，PMP-3，PMP-4，PMP-5，tPMP-1，tPMP-2。然而，兔子血液與人體血液成分和性質是有差別的。Tang等[10]利用人凝血酶激活正常人的血小板，以檢查血小板的抗菌性并提取出7種抗菌肽：血小板因子-4(PF-4)、趨化因子(RANTES)、結締組織活性多肽(CTAP-3)、血小板堿性蛋白、胸腺素β-4(Tβ-4)、血纖維蛋白肽B(FP-B)、血纖維蛋白肽A(FP-A)，并將提純出來的抗菌多肽行體外抗菌活性檢測。結果表明,血小板在機體感染防御中起重要作用，其可以通過局部釋放抗菌多肽來抑制微生物繁殖或者殺滅微生物。

圖1 各組不同時間點MSSA菌落計數(shù)(時間-抑菌曲線圖) 圖2 各組不同時間點MRSA菌落計數(shù)(時間-抑菌曲線圖)
Fig 1 Colony count of MSSA at different time point. Fig 2 Colony count of MRSA at different time point.

表1 不同濃度PRG對MSSA的抑菌率Tab 1 Antibacterial rate of PRG with different concentrations against MSSA

表2 不同濃度PRG對MRSA的抑菌率Tab 2 Antibacterial rate of PRG with different concentrations against MRSA

本實驗通過PRG體外抗菌實驗進一步觀察了不同濃度PRG的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)PRG抗菌性隨血小板濃度的增加而增加，在12 h內差異有統(tǒng)計學意義。PRG中主要成分血小板可以釋放抗菌多肽，提示PRG的抑菌作用可能與PRG中血小板濃度有直接關系，即血小板濃度越高，激活后釋放的抗菌多肽越多，抗菌性越強。這說明PRG的抗菌性有劑量依賴性。

筆者觀察到PRG在體外可以抑制MSSA和MRSA生長，在2 h時最明顯，隨后可能由于抗菌多肽消耗，細菌開始呈對數(shù)生長，抗菌作用逐漸減弱，至12 h后未見明顯抗菌作用，這表明PRG抑菌作用有時效性。Li等[11]在體外抗菌實驗研究中發(fā)現(xiàn)，在孵育后4 h內,PRG能顯著抑制MSSA、MRSA、甲類鏈球菌、淋球菌生長，但隨后其抗菌效果逐漸降低。

筆者還發(fā)現(xiàn)，相同濃度的PRG在孵育2 h內，對MSSA的抗菌作用要強于對MRSA的抗菌作用，表明PRG 對不同病原微生物的抗菌作用可能是不同的。Drago等[12]采用雙重連續(xù)微稀釋法檢測PRP對常見口腔微生物的抗菌性，結果表明PRG對糞腸球菌、白色念珠菌、無乳鏈球菌和口腔鏈球菌有抗菌性，但不能抑制銅綠假單胞菌生長。Li等[11]研究表明，PRG對E型大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抗菌效果不明顯。Bielecki等[13]發(fā)現(xiàn)，PRG能抑制E型大腸桿菌生長，并能促進銅綠假單胞菌生長，加速微生物感染，建議將銅綠假單胞菌感染作為PRG治療的禁忌證。Tohidnezhad等[14]在標準紙片擴散實驗研究中發(fā)現(xiàn)，PRP對銅綠假單胞菌(ATCC27853)有抗菌作用，但相對于大腸桿菌抗菌效果較弱。由于多次實驗的菌株類型和實驗方案設計的差異，對銅綠假單胞菌表現(xiàn)出不同的抗菌效果。由此可見，PRG在體外能抑制多種細菌生長，但對不同的病原微生物抗菌作用不同，且同一種細菌在不同的實驗條件下也可能出現(xiàn)不同的抗菌作用，甚至可能促進某些細菌生長。

本實驗結果提示,PRG體外抗菌性呈劑量依賴性，濃度越高抗菌效果越強；PRG體外抗菌性呈時間依賴性，在2 h時抗菌性最明顯，隨后呈下降趨勢，12 h后未見明顯抗菌性；PRG對不同的病原微生物抗菌作用是不同的，且同一種細菌在不同的實驗條件下也可能表現(xiàn)出不同的抗菌作用。未來我們可以進一步研究其抗菌機制，通過生物工程推進抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)，或將推動新型抗生素發(fā)展。

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Antibacterial activity of platelet-rich gel against Staphylococcus aureus in vitro

ZHAOLian-qian,ZHANGYu,HUIQiang,GUOBing-yu,CHANGPeng,TAOKai.

(DepartmentofPlasticSurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110084,China)

TAOKai,Email:plastypaper@163.com;CHANGPeng,Email:cp17625@163.com

Objective To explore the antibacterial effects of human platelet-rich gel (PRG) against Staphylococcus aureus in vitro,comparing the antibacterial effect at different concentrations of PRG against Staphylococcus aureus in vitro.Methods 30 ml peripheral venous from 20 healthy volunteers was prepared for platelet-rich gel with different concentrations.The platelet concentration in PRG1and PRG2and PRG3groups was 1.8×1012/L、1.2×1012/L and 0.6×1012/L,respectively.Antibiotic actions were observed after PRG at different concentrations was incubated in the MSSA (Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus),MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) solution for 1,2,4,8,12,24 hours in vitro.Results The colony count of PRG was significantly less than that of the PBS control group at 12 hours incubation.PRG had obviously antibacterial effect on MRSA and MSSA (P<0.05),the antibacterial effects of PRG were most pronounced at 2 hours; At the same time the inhibitory rate of PRG1and PRG2and PRG3groups were decreased in turn,and containing platelet concentrations were positively correlated.The differences of each colony count were statistically significant (P<0.05).After 12 hours of incubation,when the growth of bacteria had entered the stable phase,the inhibitory rate of each group was significantly decreased.There was no significant difference in the colony count (P>0.05).Conclusion In a certain period of time,PRG has a significant inhibitory effect on MSSA and MRSA,and the antibacterial activity of PRG was positively correlated with the platelet concentration.

Platelet-rich gel； Antimicrobial peptide； Antibacterial activity； Staphylococcus aureus;In vitro study

遼寧省科技廳科學技術計劃項目(2013225220)

110084 遼寧 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科

趙連前(1989-)，男，山西孝義人，碩士研究生.

陶 凱，110084，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科，電子信箱：plastypaper@163.com；常 鵬，電子信箱：cp17625@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.016

R378.1+1

A

1673-7040(2016)06-0371-04

2016-01-25)