仇利紅, 韓 悅, 鄭 惠, 易成剛, 伍錦華

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實驗研究

堿性成纖維細胞生長因子聯(lián)合血管內(nèi)皮細胞生長因子促進自體脂肪移植成活的動物實驗研究

仇利紅, 韓 悅, 鄭 惠, 易成剛, 伍錦華

目的 探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)聯(lián)合血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)對大鼠自體脂肪移植血管新生及成活的影響。方法 建立大鼠自體脂肪移植模型，將腹股溝處脂肪組織與生長因子蛋白溶液或生理鹽水混合移植于大鼠背部。大鼠背部隨機注射脂肪組織與生理鹽水或0.5 μg bFGF、1.0 μg bFGF、2.0 μg bFGF、0.5 μg bFGF+0.5 μg VEGF、1.0 μg bFGF+1.0 μg VEGF。12周后，對移植物進行成活率分析、組織學(xué)觀察以及CD31免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果 向0.3 ml脂肪組織中添加2.0 μg bFGF可顯著提高移植物成活率及微血管密度。0.5 μg bFGF組及1.0 μg bFGF組與生理鹽水組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但分別聯(lián)合應(yīng)用0.5μgVEGF和1.0μgVEGF以后，可顯著升高移植物成活率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。1.0μgbFGF+1.0μgVEGF聯(lián)合應(yīng)用組的移植物成活率和血管密度亦高于2.0μgbFGF單添加組。結(jié)論 相比單獨應(yīng)用bFGF，VEGF與bFGF聯(lián)合應(yīng)用可刺激更多的血管生成，從而提高移植脂肪的成活率。

堿性成纖維細胞生長因子； 血管內(nèi)皮細胞生長因子； 血管生成； 脂肪移植

自體脂肪由于具備來源豐富、操作簡單、無排斥反應(yīng)以及塑形效果自然等優(yōu)點，常被作為理想的軟組織填充材料應(yīng)用于整形和重建手術(shù)。但是脂肪組織的術(shù)后低成活率使得手術(shù)長期效果難以預(yù)測，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。因此，如何提高移植脂肪組織的成活率是目前眾多學(xué)者關(guān)注的焦點。自2015年11月至2016年3月，筆者采用不同濃度的外源性細胞因子與大鼠自體顆粒脂肪混合注射移植的方法，研究堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進血管生成的情況以及提高脂肪移植成活率的潛能，探索bFGF和VEGF促進血管新生的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

健康雌性SD大鼠11只，體質(zhì)量200～250 g，由解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。重組大鼠VEGF165蛋白、重組大鼠bFGF蛋白(美國PEPROTECH公司)，Anti-CD31小鼠單克隆抗體(英國ABCAM公司)，小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗分組及手術(shù)步驟

1.2.1 實驗分組 實驗分為生理鹽水對照組(A組)，0.5 μg bFGF組(B組)，1.0 μg bFGF組(C組)，2.0 μg bFGF組(D組)，0.5 μg bFGF+0.5 μg VEGF組(E組)，1.0 μg bFGF+1.0 μg VEGF(F組)。將11只大鼠背部不同注射部位按簡單隨機抽樣分配的方法分為以上6組，每組注射7次。

1.2.2 大鼠自體脂肪移植 腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉，待大鼠麻醉成功后，于雙側(cè)腹股溝和背部備皮，常規(guī)消毒鋪巾。從大鼠腹股溝處切取約1.5 ml的脂肪組織，生理鹽水沖洗，剪碎至顆粒。按上述分組稱取所需的生長因子蛋白粉末，稀釋于0.2 ml生理鹽水中。將脂肪組織與生長因子溶液或生理鹽水混合，隨機注射入大鼠背部皮下不同位置。

1.3 檢測指標

1.3.1 計算脂肪移植成活率 分別于術(shù)后12周麻醉處死大鼠，剝離脂肪移植物，用排水法測量體積，計算成活率。

1.3.2 病理學(xué)染色 將所取標本迅速置于10%甲醛中固定。24～48 h常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，行蘇木素-伊紅染色。光鏡下觀察并拍照，進行組織學(xué)評價。

為進一步檢測脂肪組織新生血管密度，行CD31免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟、水化后微波修復(fù)抗原，3%H2O2去內(nèi)源性過氧化物酶，一抗為鼠源Anti-CD31抗體(1∶250稀釋)，于4℃孵育過夜；第2天按照小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑盒進行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 脂肪移植成活率比較

于術(shù)后12周，采用移植物體積保持率(volume retention rate)代表移植脂肪成活率。結(jié)果顯示，與生理鹽水組(27.14±1.49)%相比，2.0 μg bFGF組脂肪移植成活率(52.21±3.93)%較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而0.5μgbFGF組(30.36±3.59)%及1.0μgbFGF組(38.57±5.74)%相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用0.5μgbFGF+0.5μgVEGF或1.0μgbFGF+1.0μgVEGF時，脂肪成活率顯著提高，分別為(53.43±5.29)%，(69.86±2.87)%，且聯(lián)合應(yīng)用組的移植物成活率均高于相應(yīng)劑量的bFGF單添加組，而1.0μgbFGF+1.0μgVEGF組的移植物成活率甚至高于2.0μgbFGF單添加組。

2.2 移植物組織學(xué)觀察

進一步用HE染色觀察脂肪移植物炎性細胞浸潤、纖維化程度以及脂肪細胞完整性等。如圖1所示，A組和B組脂肪組織被大量炎性細胞浸潤，脂肪細胞被纖維組織包裹或分隔，脂肪細胞所占面積小。隨著細胞因子濃度的增高和兩種細胞因子的聯(lián)合應(yīng)用，炎性細胞和纖維組織均見減少，纖維間隔變薄，脂肪細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞間質(zhì)可見新生的血管(圖1f紅色箭頭所示)。

2.3 血管密度比較

采用CD31免疫組化的方法觀察脂肪組織中的新生血管情況。如圖2a所示，在脂肪細胞周圍的間質(zhì)中，內(nèi)皮細胞被標記為深棕色，并連接成血管樣結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Image-ProPlus6.0計數(shù)微血管密度(microvesseldensity,MVD)，對于組織中常存在的較大的管腔，不列入微血管進行計數(shù)，見圖2b。統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖2c)，相比生理鹽水組(3.40±0.29)，單獨應(yīng)用2.0μgbFGF可顯著增加移植物中的血管密度(6.30±0.38)。相比相應(yīng)劑量的bFGF單添加組(B組和C組，分別為3.13±0.36和3.80±0.45)，聯(lián)合應(yīng)用組(E組和F組，分別為5.53±0.53和8.73±0.81)血管密度增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與脂肪移植成活率相一致，1.0μgbFGF+1.0μgVEGF聯(lián)合應(yīng)用組的血管密度高于2.0μgbFGF單添加組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

為了改善移植的脂肪組織缺血損傷，許多學(xué)者嘗試將各類血管生長因子應(yīng)用于促進脂肪移植的成活。1992年，Eppley等報道，混有bFGF(以葡聚糖珠為載體)脂肪組織移植物的成活率遠高于單純脂肪移植組。1998年，廖天安等證明，bFGF(以纖維蛋白為緩釋劑)的促移植脂肪成活作用具有濃度依賴性，以在0.2 g移植脂肪中加入4000 U bFGF效果最佳。2005年，杜學(xué)亮等通過對微血管定性和定量分析，證明bFGF(以多聚糖酐珠為載體)可以促進移植體血管化，進而促進移植脂肪的成活。為了使血管生長因子更持久、更穩(wěn)定地發(fā)揮促血管再生作用，近些年的相關(guān)研究多集中在微球緩釋技術(shù)的探索上，但由于生物相容性和安全性等問題，以及相關(guān)制備過程和應(yīng)用標準尚缺乏統(tǒng)一標準，該技術(shù)的臨床應(yīng)用仍受到限制。目前，局部生長因子蛋白(混合)注入仍是臨床研究應(yīng)用最多的方法。易陽艷[1]和李衛(wèi)華等[2]的臨床對照研究發(fā)現(xiàn)，將bFGF直接加入移植物中，可促進移植脂肪的成活，提升自體脂肪移植對面部凹陷的治療效果；近年黃成等[3]報道，純化脂肪顆粒與成纖維細胞生長因子混合可提高自體脂肪移植隆乳術(shù)術(shù)后乳房隆起值及滿意度。

圖1 脂肪移植物組織學(xué)觀察(×100) a～f. 分別代表實驗A～F組 圖2 各組微血管密度 a. 標記的微血管(×200) b. 較大的血管腔不參與微血管計數(shù)(×200) c.各組微血管密度統(tǒng)計結(jié)果 (與A組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與B組相比較，#P<0.05；與C組相比較，&P<0.01；與D組相比較，$P<0.05；與E組相比較，aP<0.01)

Fig 1 Histologic observation of the transplanted fat tissues (×100). a～f. respectively represent group A～F. Fig 2 MVD in each group. a. marked microvessels counted (×200). b. large vessel lumens were not defined as a microvessel (×200). c. statistical results: of MVD in each group (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,comparedwithgroupA;#P<0.05comparedwithgroupB;

&P<0.01comparedwithgroupC;$P<0.05comparedwithgroupD;aP<0.01comparedwithgroupE.).

由于各實驗脂肪移植的體積、實驗?zāi)康牡炔煌?，bFGF的應(yīng)用劑量波動較大。本實驗采用直接混合注射的方法，將不同濃度的bFGF與脂肪顆?；旌献⑷氪笫笃は?，以檢測bFGF的促脂肪移植物成活效應(yīng)。結(jié)果顯示，2.0μgbFGF可顯著提高移植脂肪的成活率和血管密度，與廖天安和杜學(xué)亮等報道一致。在本實驗中，添加0.5μgbFGF和1.0μgbFGF均不能降低脂肪的吸收，這可能是因為bFGF用量過低，低于其有效作用劑量，不能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；此外，也可能與單個生長因子治療效果有限有關(guān)。

VEGF是目前所知的最為有效的血管形成促進因子，特異性最高。有研究認為,在脂肪移植的受區(qū)提供VEGF，可因周圍血管的增多而提高脂肪移植的成活率。血管形成是一個動態(tài)的過程，涉及多種細胞及細胞因子的相互作用，多種因子聯(lián)合應(yīng)用可能會產(chǎn)生更好的促進效果。1995年，TAsahara等研究結(jié)果顯示，相比單用其中任意一種生長因子，VEGF和bFGF聯(lián)合應(yīng)用可顯著增加血管新生，改善兔子缺血后肢的血運。另有一些體內(nèi)外實驗研究亦證明,兩種生長因子聯(lián)合應(yīng)用比單因子有更強大的促血管新生作用[4]。很多學(xué)者認為生長因子半衰期短，單純注入的VEGF蛋白，因作用時間短而無法持續(xù)發(fā)揮生物效應(yīng)[5]。我們的研究結(jié)果表明，VEGF可協(xié)同bFGF刺激移植脂肪的血管形成，減輕組織壞死，提高脂肪移植的成活率。

VEGF、bFGF都是血管內(nèi)皮細胞的絲裂原，能增強血管內(nèi)皮細胞分裂增殖，抑制血管內(nèi)皮細胞調(diào)亡，促進早期原始血管網(wǎng)的形成；VEGF、bFGF還可促進脂肪干細胞的增殖和分化[6]。近期研究報道，將這兩種因子輔助脂肪干細胞或SVF應(yīng)用于脂肪移植，可進一步增加移植物成活率和成活質(zhì)量[7-8]。VEGF雖顯示，可強有力地促血管生長，但存在注射部位血管通透性強、易滲漏的問題。而bFGF是一種作用廣泛的生物活性物質(zhì)，可作用于不同血管成分細胞，如成纖維細胞、平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞，影響內(nèi)皮細胞遷移增生、膠原合成、毛細血管基膜降解等多個血管形成環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，bFGF與VEGF激活不同的信號通路[9]，形成不同的血管表型[10]。以上可以看出，bFGF與VEGF起著不同而互補的促血管作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用，可更好地的促進有功能的血管生成及有效血運的建立，進而發(fā)揮促脂肪成活的效應(yīng)。

出于對安全性的考慮，生長因子單純的局部應(yīng)用目前只批準了外用劑型，主要用于促進潰瘍、褥瘡、燒傷等創(chuàng)面愈合，而體內(nèi)應(yīng)用的生長因子仍未獲批準。生長因子輔助自體脂肪移植帶來的主要危害，為受區(qū)組織不可控的增生。而在本實驗中，未觀察到移植組織或者受區(qū)出現(xiàn)嚴重的增生情況，說明本實驗所應(yīng)用的生長因子劑量，可能在安全范圍之內(nèi)，也可能與個體差異等因素有關(guān)。那么，生長因子應(yīng)用的安全濃度究竟如何，生長因子的濃度升高是否會導(dǎo)致該現(xiàn)象的發(fā)生? 我們將在接下來的實驗中進一步總結(jié)。

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Synergistic effect of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor on the improvement of the survival of autologous fat transplantation in vivo

QIULi-hong,HANYue,ZHENGHui,YICheng-gang,WUJin-hua.

(DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

WUJin-hua,Email:jinxiunianhua@163.com

Objective To investigate the synergistic effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in angiogenesis and survival of transplanted fat in a rat autologous fat transplantation model. Methods Autologous fat tissue from inguinal regions was mixed with growth factor protein solutions or saline and transplanted into the back of rats. Rats were randomized to transplant fat with either normal saline or 0.5 μg bFGF, 1.0 μg bFGF, 2.0 μg bFGF, 0.5 μg bFGF+0.5 μg VEGF, 1.0 μg bFGF+1.0 μg VEGF. Twelve weeks later, the grafts were assessed by survival rate analysis, histological observation, and immunohistochemical staining for CD31. Results Adding 2.0 μg bFGF in 0.3 ml fat tissue may significantly improve microvessel density and graft survival. There was no significant difference in the 0.5 μg bFGF group and the 1.0 μg bFGF group compared with the saline group (P>0.05),butwhenitwascombinedwith0.5μgVEGFor1.0μgVEGF,respectively,thedifferencewassignificant(P<0.05).Thegraftsurvivalandthemicrovesseldensityinthe1.0μgbFGF+1.0μgVEGFgroupwasalsohigherthanthatinthe2.0μgbFGFgroup. Conclusion Compared with bFGF alone, the combined administration of VEGF and bFGF can significantly stimulate angiogenesis, resulting in increased survival of transplanted fat tissue.

Basic fibroblast growth factor; Vascular endothelial growth factor; Angiogenesis; Fat transplantation

710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科(仇利紅,韓 悅,鄭 惠,易成剛)；西安市中心醫(yī)院 整形 外科(伍錦華) 第一作者：仇利紅(1987-)，女，山東臨沂人，碩士研究生. 通信作者：伍錦華，710032，西安市中心醫(yī)院 整形外科，電子信箱：jinxiunianhua@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.12.017

R

A

1673-7040(2016)12-0759-04

2016-06-23)