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緩釋前列腺素E2對成骨細胞凋亡的影響

2016-07-18 11:58:48于國寧白雪濤白艷潔
中國美容整形外科雜志 2016年2期
關(guān)鍵詞:成骨細胞株微球

于國寧,白雪濤,白艷潔

?

實驗研究

緩釋前列腺素E2對成骨細胞凋亡的影響

于國寧,白雪濤,白艷潔

目的 探討緩釋前列腺素E2(PGE2)對成骨細胞MC3T3-E1凋亡的影響。方法 使用以往實驗制備的粒徑均勻的緩釋PGE2,以無添加物培養(yǎng)基、空白微球作為對照組,PGE2和緩釋PGE2微球為實驗組(濃度分別為0.0125, 0.0500, 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 μmol/L),與成骨樣細胞株MC3T3-E1孵育,分別于不同時間,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果 PGE2、緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞的凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用;0.0125 μmol/L PGE2、緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞的凋亡具有抑制作用(P<0.05);0.0500 μmol/L PGE2、緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞的凋亡無明顯抑制作用;0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L PGE2、緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞的凋亡具有一定的促進作用(P<0.05);緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的抑制/促進作用明顯高于等濃度的PGE2,并具有時間和劑量依賴性。結(jié)論 PGE2-MSs具有明顯的緩釋特征,影響成骨細胞MC3T3-E1的凋亡,并呈時間和劑量依賴性。

前列腺素E2; 緩釋微球; 成骨樣細胞株; 凋亡; 小鼠

前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是具有高生物活性的脂類化合物,是一種復(fù)雜的多功能的骨代謝調(diào)節(jié)因子。其參與血管形成、骨修復(fù)和軟骨代謝。PGE2 現(xiàn)已被公認為組織工程骨和軟骨組織再生解決方案中重要的靶分子[1]。但由于PGE2是一種局部激素,其在局部合成、滅活,且半衰期極短(一般為1~2 min),因此,限制了它的應(yīng)用。乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)是聚乳酸與羥基乙酸按照不同配比制備成的生物降解型高分子聚合緩釋材料,是少數(shù)取得美國FDA批準的載體材料之一?;诖?,在骨科、口腔科等領(lǐng)域的研究中,筆者構(gòu)建PLGA-PGE2微球控釋系統(tǒng)緩釋PGE2,充分觀察其在骨改建中的重要作用。自 2014年6月至2015 年12月,遼寧省人民醫(yī)院以PLGA為藥物載體,探討緩釋PGE2對成骨細胞凋亡的影響,以期為未來實驗探索緩釋藥物載體在骨改建過程中的作用機制提供量化指標和理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆 14 (MC3T3-E1 Subclonel4),購自中國科學(xué)院上海細胞庫 (ATCC CRL-2594)。

1.2 主要試劑與儀器

MEM培養(yǎng)基、MTT、TritonX-100(美國SIGMA公司);小牛血清白蛋白(美國XIASI公司);胎牛血清(美國HYCLONE公司);OriCellTM小鼠成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(美國CYAGEN BIOSCIENCES公司);二甲基亞砜(DMSO)、EDTA、Trito-X100(華美公司);PGE2(武漢三洹);緩釋PGE2(沈陽藥科大學(xué)自制);HeRA Cell CO2恒溫培養(yǎng)箱 (德國KENDRO公司);Tecan Sunrise型酶標儀(奧地利TECAN公司);CK40型倒置顯微鏡( 日本OLYMPUS公司);eppendorf 5804 R型低溫高速離心機(EPPENDORF中國有限公司);SW-CT-IF型超凈工作臺(上海博訊);BP 211D型電子天平(德國SARTORIUS公司);Series 1000型超低溫冰箱(美國KELVINATOR公司);Tecan Sunrise全自動酶標儀(奧地利TECAN公司);RCT Basic恒溫磁力攪拌器(德國IKA公司);FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 成骨細胞株MC3T3-E1的細胞培養(yǎng) 將小鼠MC3T3-E1細胞按3×105/瓶培養(yǎng)于100.0 ml 10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中,置于CO2孵箱(飽和濕度95%、5%CO2、37 ℃)孵育。根據(jù)細胞生長狀況以及培養(yǎng)液pH值變化,1、2 d換液1次,待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時傳代。

1.3.2 成骨樣細胞株MC3T3-E1的傳代培養(yǎng) 當(dāng)MC3T3-E1細胞株生長形成單層,鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時,在無菌條件下傳代。用D-Hank′s液清洗鋪滿細胞的培養(yǎng)瓶后,加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 0.5 ml,室溫下觀察3~5 min,見瓶底出現(xiàn)針孔樣透明時,吸去胰酶,加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,吹打細胞制成細胞懸液,按1∶3傳代,置于CO2孵箱,每2 d換液1次。1.3.3 成骨樣細胞株MC3T3-E1的凍存和復(fù)蘇 將鋪滿100 ml培養(yǎng)瓶的MC3T3-E1細胞用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化收集后,加入1 ml凍存液(含40%DMEM,50%小牛血清,5%DMSO和5%甘油),吸入凍存管,分4階段從4℃~-196℃緩慢放入液氮罐內(nèi)長期保存(約1℃/min)。細胞復(fù)蘇時采用快速復(fù)溫法,將液氮中凍存的裝有MC3T3-E1細胞的凍存管取出后立即置于37℃水浴中復(fù)溫,融化后立即以DMEM培養(yǎng)液離心清洗3次(1500 r/min, 10 min),再接種于細胞培養(yǎng)瓶,并置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.4 緩釋PGE2對小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1細胞凋亡的影響 ⑴將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化收集后,加入10%FCS的MEM培養(yǎng)液制成2×105/ml細胞懸液加于12孔培養(yǎng)板,每孔1.0 ml,待細胞鋪滿孔底后,分別取用OriCellTM小鼠成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液稀釋的不同濃度(0.0125、0.0500、0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L)PGE2和緩釋PGE2加于24孔培養(yǎng)板中,2個對照組分別添加等量培養(yǎng)液、空白微球,將培養(yǎng)板置于37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1/2。分別于第4、 6、 8、 10天取出,細胞凋亡的檢測采用 Annexin V-PI 雙染色法。⑵用不含 EDTA 的胰酶消化各實驗組細胞,吹打制成單細胞懸液,加入 10 ml 離心管中。⑶加入預(yù)冷的無鈣、鎂離子的 PBS 緩沖液離心, 1000 r/min,5 min,洗滌細胞2次,棄上清。⑷加入孵育緩沖液進行離心,1000 r/min,5min。⑸加入100 μl 標記溶液重新懸浮細胞,避光條件下孵育15 min。⑹重復(fù)步驟⑶。⑺加入熒光溶液,4℃下避光孵育 20 min。⑻采用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

PGE2和緩釋PGE2作用MC3T3-E1細胞10 d后,流式細胞儀檢測結(jié)果見圖1。可見PGE2和緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的作用是雙向的;低濃度(0.0125 μmol/L)PGE2和緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的抑制作用最強,凋亡發(fā)生率最低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而高濃度(3.2 μmol/L)PGE2和緩釋PGE2則抑制MC3T3-E1細胞增殖,促進細胞凋亡,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的抑制作用明顯大于等濃度的PGE2(P<0.05)。

圖2是不同濃度PGE2和緩釋PGE2分別作用MC3T3-E1細胞4、6、8、10 d后,細胞凋亡百分比的柱狀圖。由圖中可見,0.0125 μmol/L PGE2和緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的抑制作用最強,凋亡發(fā)生率最低(P<0.05);0.0500 μmol/L PGE2和緩釋PGE2是促進或抑制成骨細胞凋亡的臨界濃度;而0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L濃度則抑制MC3T3-E1細胞增殖,促進細胞凋亡的發(fā)生;隨著作用時間的延長,緩釋PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的促進大于相同濃度PGE2對MC3T3-E1細胞凋亡的促進作用。

圖1 雙變量流式細胞儀散點圖(左下象限代表活細胞,右上象限代表死細胞,右下象限則代表凋亡細胞) 圖2 不同劑量PGE2、緩釋PEG2微球?qū)Τ晒羌毎蛲鲇绊?br/>Fig 1 Scatterplot of double variable flow cytometry (left lower quadrant represents the living cells, upper right quadrant shows the dead cells, the lower right quadrant represents the apoptotic cells). Fig 2 Effect of PGE2 and sustained release PEG2 on osteoblast apoptosis with different concentrations.

3 討論

PLGA是少數(shù)取得美國FDA的批準的載體材料之一,并已逐步用于臨床、組織工程支架[1-3]和藥物載體[4-9]。因其毒性低、安全性高、穩(wěn)定性好、生物相容性良好,常作為多肽、蛋白質(zhì)及抗腫瘤類藥物的載體。其通過自身降解,可在幾周或幾個月內(nèi)以較穩(wěn)定的速率釋放藥物,維持有效血液濃度,減少藥物半衰期的給藥次數(shù),適用于半衰期短而又需要長期使用的藥物。現(xiàn)已廣泛用于組織工程支架和藥物載體。因此本實驗選PLGA為藥物載體,與對照組比較,載體安全無細胞毒性反應(yīng)。

MC3T3-E1成骨樣細胞系來源于胎鼠顱骨,并且具有專一向成骨細胞分化的特性,因此,是研究成骨細胞分化調(diào)控機制的理想細胞系。成骨細胞MC3T3-El細胞株是日本學(xué)者Koala等從新生C57BL/6小鼠顱頂骨中分離培養(yǎng)所建立的一株成骨細胞株。該細胞株具備堿性磷酸酶活性、Ⅰ型膠原合成和基質(zhì)礦化等體外培養(yǎng)成骨細胞的各種生物學(xué)特性,是一種良好的體外培養(yǎng)成骨細胞株[10],可作為一個良好的成骨細胞體外模型系統(tǒng)。本研究以MC3T3-E1成骨樣細胞系分化為成骨細胞過程中生物性能的變化來考察藥物載體的緩釋效果,療效肯定,在細胞凋亡過程中與對照組相比均有顯性意義。

Paralkar等[11]研究顯示,1×10-6mol/L PGE2處理人成骨樣細胞24 h后,細胞中BMP-7的mRNA水平和蛋白水平都顯著增加;權(quán)金星等[12]發(fā)現(xiàn),PGE2對OCIL mRNA表達的調(diào)節(jié)存在明顯的時間效應(yīng)和劑量依賴關(guān)系, 0.1 μmol/L 的PGE2在處理細胞6 h后,對OCI LmRNA表達的上調(diào)幅度最大;王樂禹等[13]用10 μmol/L PGE2處理MC3T3-El成骨細胞2 h和4 h后,檢測其對成骨細胞增殖活力和細胞周期的影響,證明了10 μmol/L PGE2可抑制成骨細胞的增殖; 2.84 μmol/L PGE2處理小鼠成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30 3 d和6 d時,能明顯抑制細胞增殖,并提高ALP的活力[14];而300 nmol/L PGE2處理OCCM-30細胞3周后,可明顯降低礦化結(jié)節(jié)生成的數(shù)量,而30~300 nmol/L PGE2處理OCCM-30細胞6 d時,就可明顯抑制ALP的活力。

本實驗通過預(yù)實驗設(shè)定6個實驗濃度,即0.0125、0.0500、0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/LPGE2分別處理MC3T3-El成骨細胞后,結(jié)果顯示PGE2對成骨細胞凋亡的作用是雙相的。這與其他學(xué)者關(guān)于PGE2對骨形成具有雙相調(diào)節(jié)作用,即在低濃度或有糖皮質(zhì)激素存在的情況下,PGE2可促進成骨細胞的分化,從而促進骨形成;而在高濃度或有胰島素樣生長因子-1存在的情況下,PGE2可抑制膠原的合成,從而抑制骨形成[15]的觀點,其本質(zhì)上是一致的。

本實驗觀察了PGE2-MSs微球的緩釋作用,在以往研究中,筆者已進行過相關(guān)微球的體外藥物釋放度測定的實驗,結(jié)果證實低分子量的微球具有持續(xù)的藥物緩釋效果。本實驗中,由于具體時間的緩釋濃度累積及代謝量無法精確控制,故設(shè)計緩釋微球的終釋放量等于PGE2組的起始濃度。在本實設(shè)定的4個觀察時間點(4、6、8、10 d)上,隨著時間變化,緩釋PGE2微球出現(xiàn)明顯的緩釋特征,其對凋亡的促進作用逐漸增強,與PGE2組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),結(jié)合以往實驗[16]的結(jié)果,進一步確定了PLGA-PGE2微球在成骨細胞實驗中具有緩釋作用。

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Effects of sustained release prostaglandin E2 on apoptosis of osteoblasts

YUGuo-ning,BAIXue-tao,BAIYan-jie.

(DepartmentofOrthopedicSurgery,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

BAIYan-jie,Email:yanjiebai2008@sina.cn

Objective To explore the effect of sustained release prostaglandin E2 (PGE2) on apoptosis of MC3T3-E1 cells. Methods The prior preparation of uniform PGE2-MSs (sustained release microspheres) was used, additive-free culture medium and blank microspheres as the control group, while PGE2 and PGE2-MSs (concentrations were 0.0125, 0.0500, 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 μmol/L, respectively) served as the experimental groups. All samples were incubated with ossification cell line MC3T3 and then cell apoptosis were detected by flow cytometry at different times. Results PGE2, sustained release of PGE2 had a regulatory action on the apoptosis of MC3T3-E1 cells. 0.0125 μmol/L PGE2, sustained release PGE2 had inhibitory action on the apoptosis of MC3T3 E1 cells (P<0.05); 0.0500 μmol/L PGE2, sustained release PGE2 had no obvious inhibitory action on the apoptosis of MC3T3 E1 cells , 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 μmol/L PGE2, sustained release PGE2 had certain promotive action on the apoptosis of MC3T3 E1 cells (P<0.05) in a time-dependent manner. The effect of sustained release PGE2 was significantly higher than PGE2 at the same concentration. The effect was time and dose-dependent. Conclusion PGE2-MSs has obvious characteristics of sustained release which affect the apoptosis of osteoblast MC3T3-E1. The effect was time and dose-dependent.

Prostaglandin E2; Sustained release microspheres; Osteoblast-like cell; Apoptosis; Mice

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金(2014001023)

110016 遼寧 沈陽, 遼寧省人民醫(yī)院(骨外科:于國寧;口腔正畸科:白艷潔);中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 麻醉科(白雪濤)

于國寧(1977-),男,遼寧沈陽人,主治醫(yī)師,博士.

白艷潔,110016,遼寧省人民醫(yī)院 口腔正畸科,電子信箱:yanjiebai2008@sina.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.018

R318

A

1673-7040(2016)02-0121-05

2015-12-10)

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