李秋萍

(中國藥科大學(xué)綜合門診部,江蘇 南京　211198)

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O-羧甲基殼聚糖制備工藝研究

李秋萍

(中國藥科大學(xué)綜合門診部,江蘇 南京211198)

摘要：目的以殼聚糖為原料，運用苯甲醛與氨基的席夫堿反應(yīng)保護殼聚糖C2位氨基的方法制備O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)，并得到最佳反應(yīng)條件。方法 以產(chǎn)品的收率、取代度為指標(biāo)，通過單因素實驗研究堿濃度，氯乙酸與苯甲醛化的殼聚糖的質(zhì)量比，溫度對羧甲基反應(yīng)的影響。結(jié)果最佳反應(yīng)條件為25%的NaOH溶液，氯乙酸/苯甲醛化的殼聚糖的質(zhì)量比為2.8，反應(yīng)溫度為70 ℃。結(jié)論殼聚糖在最佳反應(yīng)條件下可制備得到取代度和收率較高的O-羧甲基殼聚糖。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；藥物調(diào)劑

羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)，是一種水溶性的兩性聚電解質(zhì)，由殼聚糖(Chitosan，CTS)經(jīng)化學(xué)改性引入羧甲基后得到。由于殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中有2個羥基(C3位和C6位)和1個氨基(C2位)，羧甲基化在這3個位置均可以發(fā)生。因此產(chǎn)物有N,O-CMC、N-CMC和O-CMC[1]。O-CMC與N,O-CMC、N-CMC相比，既含有氨基又含有羧基，具有更好的促凝血性、生物降解、抑菌作用[2]；可加快損傷愈合，有效地防止組織黏連和瘢痕的形成[3]；對酸根離子、蛋白質(zhì)具有較好的吸附效果[4]，對重金屬離子的負(fù)載能力強[5]；并具有良好的成膜性、吸濕性和保濕性[6]，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、化工等領(lǐng)域。有關(guān)O-CMC的制備，國內(nèi)報道較多的是采在較低溫度下在堿性介質(zhì)中與氯乙酸進行反應(yīng)將羧甲基引入在CTS O-位，但在上述反應(yīng)條件下仍會有少量N-位CMC產(chǎn)物，特別是為了獲得具有較高取代度的產(chǎn)物而反應(yīng)時間較長時N-位產(chǎn)物的出現(xiàn)會較明顯，而且反應(yīng)過程中易受溫度波動的影響[7]。本文以CTS為原料，利用苯甲醛與氨基的席夫堿反應(yīng)生成亞胺結(jié)構(gòu)來保護其鏈上的氨基，再在堿性條件下接入羧甲基后在酸性條件下除去苯甲醛，生成O-CMC。

1材料與儀器

1.1材料與試劑大連雪蟹殼、甲殼素：江蘇雙林海洋生物藥業(yè)有限公司；氯乙酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苯甲醛：永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀、異丙醇、甲醇：中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉：南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備ZDJ-4A型自動電位滴定儀、PHS-3C型pH計：上海雷磁儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：金壇恒豐儀器廠；萬分之一電子分析天平E11140：Ohau Corporation公司；DZF-6020型真空干燥箱、JB50-D增力電動攪拌機：上海標(biāo)本模型廠；85-2型恒溫磁動攪拌器：上海司樂儀器有限公司；TDZ4-WS臺式低速自動平衡離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；RC-6型落地式高速冷凍離心機：美國Thermo公司；ZHWY-L-3B恒溫培養(yǎng)振動器：上海智域分析儀器制造有限公司；LGJ-12型冷凍干燥機：北京松源科技發(fā)展有限公司；410型紅外光譜儀：Nicolet Impact公司。

2實驗方法

2.1O-CMC的制備方法

2.1.1殼聚糖C2位氨基的保護[8]精密稱取3.0 g CTS溶于240 mL 1%醋酸溶液中，在25 ℃下完全溶解后慢慢加入180 mL甲醇。精密稱取3.0 g苯甲醛溶于45 mL甲醇，均勻混合后逐滴加入，升溫到60 ℃攪拌反應(yīng)4 h。慢慢加入240 mL 5%NaOH溶液和60 ml甲醇，繼續(xù)攪拌8 h。反應(yīng)完后經(jīng)抽濾沉淀依次用95%乙醇洗滌、無水乙醇脫水，除去未反應(yīng)的苯甲醛，于55 ℃烘干。反應(yīng)多次積累產(chǎn)品備用。

2.1.2羧甲基反應(yīng)取上述產(chǎn)物5.0 g(過60目篩網(wǎng))懸浮于50 mL異丙醇中，55 ℃溶脹5 h。冷卻至25 ℃，在攪拌條件下慢慢滴加25 mL 25%NaOH溶液，速度為每滴3秒。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌1 h，使其充分混合，-20 ℃冷凍過夜。次日解凍后，在冰浴條件下，邊攪拌邊滴加20 mL異丙醇溶解的14 g氯乙酸，速度為5 s·d-1。滴加完畢后，在30 ℃攪拌反應(yīng)2 h，再在70 ℃加熱回流2 h。反應(yīng)完后經(jīng)抽濾去掉上清，沉淀依次用70%、60%乙醇分別洗滌數(shù)次后加200 mL蒸餾水溶解，離心去沉淀，用鹽酸調(diào)pH值為中性，上清加乙醇至總體積的70%，析出產(chǎn)品。再用70%乙醇洗滌數(shù)次，無水乙醇脫水，55 ℃干燥得產(chǎn)品，備用。

2.1.3保護基團的去除將上述反應(yīng)得到的產(chǎn)物用150 mL0.5 mol·L-1HCl室溫浸泡48 h，用NaOH調(diào)pH值為中性，離心去沉淀。上清加乙醇至總體積的70%，析出產(chǎn)品，再用70%乙醇洗滌數(shù)次，無水乙醇脫水，55 ℃烘干得產(chǎn)品。

2.2O-CMC取代度的測定稱取O-CMC樣品0.1 g，精密稱定、精確移取20 mL 0.1 mol·L-1HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液充分溶解，用0.1 mol·L-1的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液進行滴定，記錄pH計讀數(shù)變化。橫坐標(biāo)為消耗NaOH的體積，縱坐標(biāo)為ΔpH/ΔV，利用二次微商法作圖確定滴定終點。第一處的小突越是滴定過剩鹽酸產(chǎn)生的，體積為V1；第二處的突越是滴定樣品中的羧基產(chǎn)生的，體積為V2；第三處的突越是滴定樣品中的氨基產(chǎn)生的，體積為V3。按下式計算取代度[9]：

DS=[0.203(V2-V1)×C(NaOH)]/(m-m1+m2)

m1=(V2-V1)×C(NaOH)×0.080-(V3-V0)×C(NaOH)×0.022

m2=(V3-V2)×C(NaOH)×0.042

式中：DS—取代度，%；

m—O-CMC樣品的質(zhì)量(扣除水分)，g；

m1—樣品中總羧甲基(-CH2COOH，-CH2COONa)的質(zhì)量，g；

m2—樣品脫掉的乙?；|(zhì)量，g；

V0—相同體積標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液空白滴定所需NaOH溶液的體積，mL；

V2-V1—滴定總羧基所消耗NaOH溶液的體積，mL；

V3-V2—滴定總氨基(RNH3+，R+NH2CH2COO-)所消耗NaOH溶液的體積，mL；

V3-V0—樣品中游離羧甲基(-CH2COOH)所消耗NaOH溶液的體積，mL；

80—羧甲基鈉(-CHCOONa)的相對分子質(zhì)量，58—羧甲基(-CHCOOH)的相對分子質(zhì)量，22=80-58；42—乙?；?-COCH3)相對分子質(zhì)量，203—AGA結(jié)構(gòu)單元相對分子質(zhì)量。

2.3O-CMC紅外光譜分析稱取O-CMC樣品1 mg，與干燥的KBr粉末均勻混合，研磨壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

3結(jié)果與分析

3.1反應(yīng)條件對羧甲基反應(yīng)的影響

3.1.1堿濃度對羧甲基反應(yīng)的影響當(dāng)羧甲基反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)為異丙醇，溫度為70 ℃，M氯乙酸/M苯甲醛化的殼聚糖=2.8，NaOH溶液濃度分別為14.70%、20.00%、25.00%、30.00%，O-CMC的收率、取代度見表1。由表1可知：隨著NaOH溶液濃度增加，產(chǎn)品的收率和取代度均先增加后減少，當(dāng)NaOH溶液濃度為25%時，其收率和取代度均達(dá)到最大。天然的高分子中存在非結(jié)晶區(qū)與結(jié)晶區(qū)，NaOH可以破壞分子中的結(jié)晶區(qū)，使其充分溶脹，同時NaOH與苯甲醛化CTS分子中的羥基反應(yīng)，形成堿化的活性中心，再與氯乙酸反應(yīng)[10]。NaOH的用量將直接影響苯甲醛化的殼聚糖形成堿化的活性中心的數(shù)量，隨著NaOH用量增大，形成的活性中心的數(shù)量增大，氯乙酸的利用率增高，有利于羧甲基反應(yīng)的進行，產(chǎn)品收率和取代度均增大；但NaOH用量過大，副反應(yīng)的發(fā)生率增高，氯乙酸的利用率降低，產(chǎn)品收率和取代度均降低[11]。

表1　堿濃度對O-CMC產(chǎn)品收率和取代度的影響

3.1.2氯乙酸的用量對羧甲基反應(yīng)的影響當(dāng)羧甲基反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)為異丙醇，溫度為70 ℃，NaOH在反應(yīng)液的終濃度為25%，M氯乙酸/M苯甲醛化的殼聚糖分別為1.0、2.0、2.8、3.5、4.5，O-CMC的收率、取代度見表2。由表2可知：隨著氯乙酸用量增加，產(chǎn)品的收率和取代度均先增加后減少，當(dāng)M氯乙酸/M苯甲醛化的殼聚糖=2.8時，其收率和取代度均達(dá)到最大。因為當(dāng)NaOH用量一定時，形成的活性中心數(shù)量也一定，隨著氯乙酸用量增加，其與活性中心發(fā)生碰撞機率增加，產(chǎn)品取代度增加；但當(dāng)氯乙酸用量增至過量時，會中和一部分堿，促進副反應(yīng)的發(fā)生，氯乙酸的利用率降低，產(chǎn)品收率和取代度均降低[12]。

表2　氯乙酸用量對O-CMC產(chǎn)品收率和取代度的影響

3.1.3溫度對羧甲基反應(yīng)的影響當(dāng)羧甲基反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)為異丙醇，NaOH在反應(yīng)液的終濃度為25%，M氯乙酸/M苯甲醛化的殼聚糖=2.8，溫度為60 ℃、65 ℃、70 ℃，O-CMC的收率、取代度見表3。由表3可知：在一定范圍內(nèi)，隨著溫度增加，產(chǎn)品的收率和取代度逐漸增加。羧甲基反應(yīng)是SN2反應(yīng)(雙分子親核取代反應(yīng))，是由堿化的苯甲醛化殼聚糖進攻氯乙酸中的伯碳中心，溫度升高則提供更多的能量使更多活性中心發(fā)生羧甲基反應(yīng)，促進羧甲基反應(yīng)的進行，從而提高產(chǎn)品的收率和取代度。

表3　反應(yīng)溫度對O-CMC產(chǎn)品收率和取代度的影響

3.2O-CMC的紅外光譜分析O-CMC和CTS的紅外光譜圖分別見圖1、2。由O-CMC的紅外光譜圖可知：1 606.0 cm-1和1 420.09 cm-1是羧甲基殼聚糖羧酸鹽中-COO-對稱及反對稱伸縮振動的特征吸收峰。由于羧酸鹽的分子中，其氧負(fù)離子含有一對孤對電子可與原來羰基的P電子發(fā)生共軛作用，形成一個三中心四電子的分子軌道，氧上負(fù)電荷分散在三個原子上，出現(xiàn)兩個平均化的-CO結(jié)構(gòu)，振動頻率在C-O和C=O之間，紅外吸收在υ 和υc=o之間，說明改性成功生成了CMC。3 435.4 cm-1為O-H和-NH2伸縮振動峰，與CTS相比該特征峰較窄，由于取代后的CMC中-OH或-NH2減少，則由締合而形成氫鍵的數(shù)量減少，進一步說明-OH或-NH2上發(fā)生了取代反應(yīng)。2 929.6 cm-1為C-H伸縮振動峰，1 326.8 cm-1為C-N振動峰，1 121.6 cm-1和1 061.5 m-1為C-O-C特征吸收峰。

圖1　O-CMC紅外光譜圖

圖2　CTS紅外光譜圖

4討論

由于CTS分子鏈中C3和C6位有游離的-OH，C2位有游離-NH2，羧甲基反應(yīng)在這3個位置均可以發(fā)生，可生成N,O-CMC、N-CMC和O-CMC。由于在堿性條件下羧甲基在羥基的取代活性大于氨基，同時C3上的取代反應(yīng)受C2和C3之間的氫鍵作用與C3上位阻效應(yīng)的影響，所以取代的羧甲基的含量O(C6)>N(C2)>O(C3)[13]。據(jù)文獻報道[14]，只有當(dāng)取代度≥1時，氨基上才會發(fā)生羧甲基取代反應(yīng)，形成N,O-CMC。通過本方法制備的CMC，其測定的取代度均<1，是選擇性較好、產(chǎn)物單一的O-CMC。

由實驗結(jié)果可知：以異丙醇為反應(yīng)介質(zhì)，隨著堿濃度、氯乙酸用量的增加，O-CMC的收率和取代度均先增加后減少；而在一定范圍內(nèi)其收率和取代度隨著反應(yīng)溫度的增加而增加，當(dāng)堿濃度為25.00%，M氯乙酸/M苯甲醛化的殼聚糖=2.8，反應(yīng)溫度為70 ℃時，O-CMC的收率和取代度達(dá)到最大，收率為30.74%，取代度為87.24%?？朔藗鹘y(tǒng)制備方法C6位選擇性差、取代度低的缺點。

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Studies on preparation of O-carboxymethyl chitosan

LI Qiu-ping

(ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu211198,China)

Abstract:Objective To obtain the highly yield and substitution of C2in O-CMC, the amino of chitosan reacted with benzaldehyde to form imides.Methods Carboxymethylation was conducted in alkaline condition and benzaldehyde was removed in acidic condition to form O-CMC.The yield and substitution degree were regarded as assessment indexes.The effects of reaction conditions were evaluated on carboxymethylation by the single factor test,including the concentration of alkali,the dosage of chloroacetic acid,and the temperature of reaction. Results 25% alkali concentration,Chloroacetic acid/Benzaldehyde of Chitosan(m/m) equaled 2.8 and 70 ℃ reaction temperature were considered as optimum reaction conditions.Conclusions The highly yield and substitution of O-CMC was obtained under the optimal reaction conditions.

Key words:Chitosan;Drug compounding

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.007

(收稿日期：2015-11-16，修回日期：2016-02-10)