霍 瑞，薛守聰，任加慶，許汝冰，李錫宏，趙秀云*（.華中農業(yè)大學生命科學技術學院，武漢 430070；.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

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疫霉葡聚糖激發(fā)子Gep1誘導煙草對煙草花葉病毒的抗性研究

霍 瑞1，薛守聰1，任加慶1，許汝冰2，李錫宏2，趙秀云1*
（1.華中農業(yè)大學生命科學技術學院，武漢 430070；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

摘 要：煙草花葉病毒病是危害煙草的重要病害，可通過激發(fā)子誘導煙草產生抗病性。利用乙醇沉淀、DEAE-52、SephadexG-100柱層析的方法，從疫霉菌中分離純化出一種葡聚糖類激發(fā)子Gep1。Gep1誘導后，煙草葉片產生和積累H2O2、酚類物質；煙草葉片苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和過氧化物酶活性均有不同程度的提高。Gep1可以誘導煙草抗TMV。盆栽實驗表明，4mg/mL Gep1的防效為67.4%，降低了發(fā)病率，推遲了發(fā)病時間。半定量RT-PCR結果顯示，Gep1激發(fā)子誘導煙草抗病相關基因的上調表達，表明Gep1可激發(fā)煙草防衛(wèi)反應，誘導煙草產生系統(tǒng)抗性，提高煙草對病毒的抗性。

關鍵詞：煙草花葉病毒；疫霉；葡聚糖激發(fā)子；防衛(wèi)反應

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）引起的病毒病是煙草主要病害之一，嚴重制約了煙草的生產［1］。目前，抗病毒劑的作用以抑制病毒活性和誘導煙株抗性為主［2］。已有許多關于糖類作為激發(fā)子防治煙草花葉病的報道。商文靜等［3］報道殼寡糖對煙草花葉病防效可達84.73%。蒼耳多糖可誘導煙草產生抗性，抑制 TMV的侵染［4］。氨基寡糖對煙草花葉病的防效可達77.9%［5］。

糖類激發(fā)子是指具有激活植物自身免疫、提高植物抗病能力的糖類物質［6］。糖類激發(fā)子包括以下幾類：寡聚半乳糖醛酸、葡聚糖及其寡糖、幾丁聚糖及其寡糖、殼聚糖及其寡糖、海藻酸鈉寡糖、果寡糖、木寡糖等［7-8］。目前已鑒定的真菌激發(fā)子多數(shù)是低聚糖或糖蛋白，少數(shù)為蛋白質或多肽。β-1，3-β-1，6-葡寡糖是從大豆致病菌大雄疫霉菌（Phytophthora megasperma）的細胞壁水解產物中得到的激發(fā)子，可誘導大豆葉片產生植保素。殼多糖能夠誘導多種植物產生抗病性，如可誘導番茄對根腐菌（Fusarium oxyporum）和早疫霉（Alternaria spp.）的抗性［10-11］。β-D-葡聚糖（β-D-glucan）廣泛存在于真菌、褐藻、地衣中，具有誘導植物產生抗細菌、抗病毒等活性［12-13］。

寡聚糖不僅能夠調控植物生長，還能夠誘導植物產生抗性相關活性物質，抑制病害的發(fā)生。本研究擬從疫霉中挖掘新的糖鏈類激發(fā)子，分析多糖激發(fā)子誘導煙草后，煙草早期信號事件、防衛(wèi)物質的產生、防御相關酶活性的變化以及抗性相關基因的表達規(guī)律，以明確其作用機制，為煙草病毒病的綠色防控開發(fā)新的生物藥劑。

1 材料與方法

1.1 材料

疫霉菌（Phytophthora sp.）由本實驗室保存。煙草懸浮細胞BY2由華中農業(yè)大學柳俊教授饋贈。煙草花葉病毒由中國農業(yè)科學院煙草研究所饋贈。

DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司，反轉錄試劑盒購自寶生物工程（TaKaRa）有限公司，超敏蛋白為美國伊甸生物技術公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 疫霉多糖激發(fā)子的分離純化 將疫霉接種于土豆培養(yǎng)液中，26 ℃、200r/min培養(yǎng) 24 d后，發(fā)酵液離心，收集上清液，加入1/5體積的氯仿振蕩、離心，取上清液，加入 4×體積的無水乙醇于-20 ℃沉淀過夜，8000r/min離心5min，真空冷凍干燥獲得多糖。

多糖溶于蒸餾水（10mg/mL），上樣至DEAE-52纖維素柱層析，依次用蒸餾水0.1、0.5、1mol/L NaCl溶液洗脫。多糖生物活性檢測：取上述多糖組分各20 μL（1mg/mL）分別注入葉片，以蒸餾水作對照。2 d后觀察過敏反應。選擇能誘導煙草產生過敏反應的多糖組分，分別加到 Sephadex G-100柱，以0.01mol/L NaCl為洗脫液，分別收集各主峰，得到均一多糖，再次檢測其生物活性，確認獲得的多糖激發(fā)子命名為Gep1。

1.2.2 多糖激發(fā)子 Gep1的單糖組成分析 采用三氟乙酸水解多糖激發(fā)子，并用薄層色譜法（TLC）分析其單糖組成［14］。展開劑為乙酸乙酯-吡啶-無水乙醇-水（8：1：1：2，V/V），顯色劑為苯胺-二苯胺-磷酸。以葡萄糖、果糖、核糖（10mg/mL）為參照。

1.2.3 Gep1誘導煙草過氧化氫和酚類的產生用0.4mg/mL的Gep1注射煙草葉片，24 h后，采用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）組織染色法檢測 H2O2的產生［15］，蒸餾水注射作對照。

取300 μL煙草細胞，加入0.4mg/mL Gep1，于25 ℃，150r/min處理108 h后，在熒光顯微鏡（395 nm激發(fā)波長）下觀察酚類物質的積累。

1.2.4 過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定 用4mg/mL多糖激發(fā)子噴霧煙株葉片，以蒸餾水為對照。處理前采樣1次，噴霧后第4天開始每天采樣1次，共8次。分別測定POD、PPO、PAL酶活性［16］。

1.2.5 Gep1誘導煙草抗性基因的表達 用 4mg/mL激發(fā)子Gep1噴霧煙草的下位葉片，在處理后不同時間，采取上位葉片，利用Trizol試劑提取RNA，測定RNA濃度。采用半定量 RT-PCR分析抗性基因的表達，以Actin基因作內參。首先合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增抗性基因。PCR反應體系為：ddH2O 6.4 μL，2×Taq Mix 10 μL，正、反向引物 各0.8 μL，cDNA 2 μL。擴增條件：94 ℃預變性4min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)。PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠中檢測。

1.2.6 盆栽試驗檢測Gep1對TMV的防治效果 8葉期云煙87煙苗，分別用2、3、4mg/mL的多糖激發(fā)子Gep1噴霧葉片，每濃度處理3次，以蒸餾水和超敏蛋白（1mg/mL）為對照。10 d后摩擦接種TMV。煙苗開始發(fā)病時進行第1次病情調查，每隔7天調查，共4次。按下列公式計算病情指數(shù)和防治效果：

病情指數(shù)= ［Σ（各級病株×該病級值）/（調查總株數(shù)×最高級值）］×100

防治效果/% = ［（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)］×100%

1.2.7 統(tǒng)計分析方法 不同處理組間的差異顯著性分析采用 SPSS Statistics 20軟件的單因素ANOVA進行分析。

2 結 果

2.1 多糖激發(fā)子Gep1的分離純化

多糖經DEAE-纖維素層析純化后，收集到5個組分HD1～5，其中HD2組分能引起煙草葉片的過敏性反應。HD2經Sephadex G-100柱層析純化，分離得到主要組分Gep1（圖1），Gep1能夠誘導煙草產生過敏性反應，形成明顯的壞死斑。

圖1 多糖激發(fā)子的分離純化Fig.1 Isolation and purification of polysaccharide elicitors

2.2 Gep1的單糖組分

Gep1的酸水解產物，經薄層層析分離后發(fā)現(xiàn)只有一個深藍色的斑點（圖 2），通過與標準單糖的Rf值比對，發(fā)現(xiàn)其組成成分中只含有葡萄糖。確定Gep1為由葡萄糖組成的多糖或寡糖。

2.3 Gep1激活過氧化氫在煙草葉片內的沉積

DAB可以與煙草葉片中產生的 H2O2反應，形成紅褐色斑點。Gep1激發(fā)子處理后，誘導煙草葉片產生H2O2，主要在葉脈和處理部位累積（圖3）。

2.4 Gep1誘導酚類的產生

酚類化合物具有抗氧化活性，它的積累有利于提高植物的抗病抗逆性。Gep1處理煙草細胞后，可明顯的觀察到酚類物質的產生和積累（圖4）。

2.5 Gep1誘導煙草防御相關酶的活性

從圖5看出，Gep1可誘導煙草防御相關酶的活性提高。Gep1誘導4 d后，POD活性明顯高于對照組（P＜0.01），7 d后活性最高，為對照組的3倍（P ＜0.01）。Gep1處理煙草后，PPO活性開始升高，7 d時達到最大值，顯著高于對照組（P＜0.01）。Gep1處理6 d后，PAL活性開始增加，9 d時活性最高，為對照組的1.6倍（P＜0.05）。

圖2 Gep1酸水解產物的薄層層析Fig.2 Analysis of hydrolysates from Gep1 by TLC

圖3 檢測煙草體內H2O2的積累.Fig.3 Deposition of H2O2in tobacco leaves

2.6 Gep1誘導煙草抗性相關基因的表達

在Gep1處理后，水楊酸（SA）信號途徑的關鍵調控蛋白基因NPR1和EDS1，及抗性基因PR1-b的轉錄量開始增加，7 d時轉錄量均達到最大值。PR1-a的轉錄在7 d時也達到最大值（圖6）。表明，Gep1可誘導煙草產生系統(tǒng)性抗性，并且依賴于SA信號途徑。

2.7 Gep1對TMV的防治效果

圖4 Gep1誘導煙草葉片酚類物質的積累Fig.4 Gep1 induced phenolic substances deposition in tobacco leaves

圖5 Gep1誘導煙草葉片防御相關酶的活性Fig.5 Gep1 induces increased activities of defense-related enzymes

Gep1處理后的煙草，病毒病顯癥明顯推遲，癥狀減輕。2mg/mL和3mg/mL Gep1對TMV的防治效果低于4mg/mL Gep1。4mg/mL Gep1處理組的防效在4次統(tǒng)計中依次為100%，96.67%，87.93% 和67.4%，均比超敏蛋白、2和3mg/mL Gep1處理組的防效高（圖7）。

圖6 Gep1 誘導水楊酸信號途徑相關基因的表達Fig.6 Expression of SA signal pathway genes induced by Gep1

圖7 激發(fā)子Gep1對TMV的防治效果Fig.7 Control effect of Gep1 elicitor on TMV

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，寡糖、殼寡糖等功能糖具有激活植物自身免疫、提高植物抗病性的功能。例如，殼寡糖及其衍生物可降低侵染病毒煙草中的葉綠素下降幅度，還可以提高葉片中超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和苯丙氨酸解氨酶的活性［17］。我們從疫霉菌中分離純化出一種多糖激發(fā)子Gep1。Gep1的酸水解產物，經薄層層析分離后，確定其中只含有葡萄糖，無其他單糖成分。

有報道β-葡寡糖激發(fā)子能誘導大豆、甜椒、紫花苜蓿、水稻、擬南芥、煙草、小麥等多種植物產生抗性［18-19］。我們發(fā)現(xiàn)葡聚糖激發(fā)子 Gep1也能激發(fā)煙草防衛(wèi)反應。Gep1可誘導煙草葉片積累H2O2和酚類，并誘導煙草葉片PAL、PPO和POD等防御酶活性明顯提高，有助于寄主植物抵抗病原菌的侵染。

系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）指植物的某個局部受到生物或非生物的因子脅迫時產生的信號物質傳遞到未被侵染的部位或整個植株，進而誘導產生對脅迫因子的抗性。水楊酸（salicylic acid，SA）是SAR的介導信號分子。NPR1蛋白是 SAR信號轉導途徑中的關鍵調控因子，能誘導PR1等基因的表達［20］。PR1基因被視為SAR的標記基因。我們研究發(fā)現(xiàn)激發(fā)子Gep1可誘導煙草產生依賴于SA的系統(tǒng)獲得性抗性，從而提高對TMV的抗性。Gep1誘導了煙草葉片NPR1、EDS1、PR1-a和PR1-b等的上調表達，并表現(xiàn)一定的時序性。

目前已報道的多糖抗病毒制劑中，對TMV引起的煙草花葉病防效最好的是氨基殼寡糖，最高可達84.73%［3］。室內盆栽實驗表明，多糖激發(fā)子Gep1誘導處理后的煙草可顯著降低發(fā)病程度。4mg/mL 的Gep1對煙草花葉病的防治效果最好，其能有效地抑制TMV在煙草體內的繁殖，顯癥明顯推遲，癥狀減輕。在4次統(tǒng)計調查中，其防治效果依次為100.00%、93.00%、87.78%、67.39%，優(yōu)于超敏蛋白和氨基殼寡糖。

綜上所述，本研究從疫霉發(fā)酵液中分離出葡聚糖激發(fā)子Gepb1，對Gep1的理化性質及其誘導煙草抗 TMV的抗病機制進行了研究。但尚需要對Gep1的結構以及Gep1多糖的發(fā)酵條件、田間應用技術等進行研究。

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Study of Glucan Elicitor Gep1 from Phytophthora Which Induces Resistance in Tobacco to Tobacco Mosaic Virus

HUO Rui1， XUE Shoucong1， REN Jiaqing1， XU Rubing2， LI Xihong2， ZHAO Xiuyun1*
（1.College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China； 2.Tobacco Research Institute of Hubei Province， Wuhan 430030， China）

Abstract:Tobacco mosaic virus is an important disease and causes damage on tobacco.Elicitors can induce tobacco systemic resistance against TMV.In this study， a glucan elicitor Gep1 was isolated and purified from the culture filtrate of Phytophthora sp.through the procedures of ethanol precipitation， DEAE-52 and SephadexG-100 column chromatography.Gep1 triggered tobacco defense responses.After induced by Gep1， H2O2and phenolics accumulated more and activities of peroxides， polypheol oxidase and phenylalanine ammonia lyase all increased in tobacco leaves.Gep1 could induce tobacco resistance against TMV.In pot experiment，control efficiency of 4mg/mL Gep1 was 67.4%.Gep1 could effectively reduce the incidence and delay the onset time.Semi-quantitative RT-PCR data revealed that expression of the resistance-related genes in tobacco was up-regulated after Gep1 treatment.The results suggested that Gep1 could trigger defense reactions， induce systemic resistance and improve resistance of tobacco against TMV.

Keywords:tobacco mosaic virus； Phytophthora sp.； glucan elicitor； defense response

中圖分類號：S435.72

文章編號：1007-5119（2016）02-0001-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.001

基金項目：湖北省煙草公司科技項目“煙草主要病毒病快速檢測及防控新技術研究集成與示范”（027Y2013-006）

作者簡介：霍 瑞，女，碩士，研究方向為生物防治。E-mail：176545420@qq.com。*通信作者，E-mail：xiuyunzh@mail.hzau.edu.cn

收稿日期：2015-09-27 修回日期：2016-03-15