徐建峰，張艷麗，容維中，王　珂

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)觥?44000； 2.平?jīng)鍪修r產(chǎn)品質量安全檢測檢驗中心，甘肅平?jīng)觥?44000)

早勝牛及其雜交類群 IGF-Ⅱ基因多態(tài)性與肉用性狀關聯(lián)分析

徐建峰1，張艷麗2，容維中1，王珂1

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000； 2.平?jīng)鍪修r產(chǎn)品質量安全檢測檢驗中心，甘肅平?jīng)?44000)

為研究 IGF-Ⅱ基因多態(tài)性對胴體性狀和肉質性狀的影響，采用PCR-SSCP和DNA測序技術檢測早勝牛及其雜交類群(南德溫×早勝牛雜交一代、安格斯×早勝牛雜交一代) IGF-Ⅱ基因第2外顯子的遺傳多態(tài)性，分析不同基因型與肉用性狀的相關性。結果表明，檢測到1個SNPs (T116C)，等位基因E和基因型EF頻率分別為0.56和0.40，為優(yōu)勢等位基因和基因型；相關分析顯示，屠宰率和優(yōu)質肉塊占宰前活質量比例FF型顯著高于EE和EF型，凈肉率EE型顯著高于FF和EF型，背膘厚度FF和EE型都顯著高于EF型，剪切力FF型顯著低于EE和EF型。以上結果說明， IGF-Ⅱ基因第2外顯子可以作為早勝牛肉用方向選育的有效分子標記。

早勝牛； IGF-Ⅱ 基因；PCR-SSCP；肉用性狀；選育

早勝牛是甘肅省引入陜西秦川牛，經(jīng)過長期人工馴化和雜交選育形成的地方群體，屬于秦川牛的優(yōu)秀類群之一，于1986年被列入《甘肅省畜禽品種志》[1]，現(xiàn)主要分布在隴東黃土高原溝壑山區(qū)，年飼養(yǎng)量近5萬頭，是當?shù)仞B(yǎng)殖的主導肉牛群體。近年來，人們對優(yōu)質高檔牛肉數(shù)量和質量的要求越來越高，早勝牛特有的脂肪沉積好、肉質細嫩等品質逐漸受到廣大消費者的青睞。同時，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，在基因組水平開展早勝牛的肉用性能研究對其遺傳改良和種質資源創(chuàng)新是非常必要的。

IGFs家族是一種多肽類激素，對脊椎動物的生長和發(fā)育具有重要作用[2-3]。Froesch等[4]在血清中發(fā)現(xiàn)不能被胰島素抗體所中和的生長因子，將其命名為非抑制性胰島素樣活性(NSILA)。Rinderknecht等[5]通過NSILA測序方法發(fā)現(xiàn)不同的生長因子，它們在結構和功能上都與胰島素相似，由此被命名為 IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ。其中， IGF-Ⅱ基因屬于母系印記父系表達基因，全長8.8 kb，由10個外顯子和9個內含子組成，因其對胚胎發(fā)育、肌肉生長和分化、基因組印跡等方面具有重要的調節(jié)和促進作用，已成為研究畜禽生長發(fā)育和肉質性狀的重要候選基因[6-7]。目前肉牛生產(chǎn)盲目追求引種和雜交改良，忽視地方黃牛遺傳資源的保護和利用，對品質內涵和肉用潛力的挖掘遠遠不夠，導致品種選育進展緩慢[8]。

基于此，本研究采用PCR-SSCP和DNA測序技術對早勝牛及其雜交類群 IGF-Ⅱ基因第2外顯子多態(tài)性及其與肉用性狀的相關性進行分析，以期篩選出影響產(chǎn)肉率、肌肉嫩度、脂肪沉積等性狀的SNPs，為進一步了解早勝牛生產(chǎn)優(yōu)質牛肉的遺傳特性及潛力、加快甘肅現(xiàn)代肉牛新品群選育提供基礎數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

30頭早勝牛及其雜交類群(南德溫×早勝牛雜交一代、安格斯×早勝牛雜交一代)均選自慶陽市寧縣興旺牧業(yè)有限責任公司，在同一飼養(yǎng)條件下集中育肥。采用靜脈采血法每頭牛采血7 mL，加入檸檬酸葡萄糖抗凝后低溫條件下帶回實驗室，于-20 ℃保存。根據(jù)《GB/19477-2004 牛屠宰操作規(guī)程》，在涇川縣食品有限責任公司對試驗牛只進行屠宰試驗，測定宰前活質量、屠宰率、凈肉率、優(yōu)質高檔肉塊質量、眼肌面積、背膘厚度7個胴體性狀和剪切力、熟肉率、失水率、大理石紋、pH值5個肉質性狀。

1.2基因組DNA提取與檢測

采用Omegabiotek公司生產(chǎn)的D3471型血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和分光光度計檢測OD260/OD280值。

1.3引物設計與PCR擴增

參照Genbank公布的 IGF-Ⅱ基因核苷酸序列(登錄號：DQ298739)，采用Prime 5.0 軟件設計特異性引物，由北京三博遠志生物技術有限責任公司進行合成。引物序列：上游5′-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3′，下游5′-CT-GTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3′。

PCR反應體系：總體積50 μL，其中2×TaqMaster Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min，34個循環(huán)(94 ℃變性5 min，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4SSCP檢測與基因測序

取2 μL PCR產(chǎn)物與6 μL變性緩沖液(φ=98%的甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.25 g/L的溴酚藍、0.25 g/L的二甲苯青)混勻，98 ℃變性10 min，冰浴5 min，然后上樣于12%、交聯(lián)度為29∶1的非變性聚丙烯酰胺凝膠，220 V、4 ℃恒溫恒壓電泳16 h。電泳結束后銀染法染色和判型。根據(jù)SSCP檢測結果，將不同基因型產(chǎn)物送至北京三博遠志生物技術有限公司進行純化和測序。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

利用 PopGen 32 軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、純合度(Ho)、雜合度(He)，利用PIC CALC V 0.6軟件計算多態(tài)性信息含量(PIC)。根據(jù)影響肉質性狀的不同因素，建立最小二乘線性模型，采用SPSS 13.0 軟件對 IGF-Ⅱ基因第2外顯子不同基因型與胴體性狀和肉質性狀進行關聯(lián)分析。

最小二乘線性模型：

yijkmn=μ+Farmi+Breedj+Agek+Sexm+Markern+eijkmn

其中：yijkm為個體表型記錄，μ為群體均值，F(xiàn)armi為場別效應，Breedj為品種效應，Agek為年齡效應，Sexm為性別效應，Markern為標記基因型效應，eijkm為隨機誤差。

2結果與分析

2.1PCR-SSCP檢測

對早勝牛及其雜交類群 IGF-Ⅱ基因第2外顯子進行擴增，結果顯示，PCR擴增產(chǎn)物條帶清晰，無非特異性條帶，且片段長度與目的條帶大小一致(圖1)。經(jīng)SSCP檢測和測序后發(fā)現(xiàn)，在第2外顯子116 bp處發(fā)生T/C的單堿基突變(圖2)，產(chǎn)生2個等位基因(E、F)和3種基因型(EE、FF、EF)(圖3)。

M.DL2000 Marker; 1～6.PCR產(chǎn)物PCR amplifications

圖1 IGF-Ⅱ 基因 PCR 擴增產(chǎn)物

Fig.1Amplifications of IGF-Ⅱ gene

圖2　 IGF-Ⅱ 基因不同基因型測序

2.2遺傳多態(tài)性分析

遺傳多態(tài)性分析結果表明(表1)，30頭早勝牛及其雜交類群中，E的基因頻率和EF基因型頻率最高，分別為優(yōu)勢等位基因和優(yōu)勢基因型。純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量通常用來衡量一個群體的遺傳變異程度，該群體純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)分別為0.69、0.31和1.45，多態(tài)信息含量為0.42，屬于中度多態(tài)，表明早勝牛及其雜交類群多態(tài)性較為豐富，人工選擇潛力較大。

2.3 IGF-Ⅱ基因多態(tài)性與肉用性狀的相關性分析

早勝牛及其雜交類群 IGF-Ⅱ基因第2外顯子不同基因型與其肉用性狀的相關性分析結果表明

圖3　 IGF-Ⅱ基因 PCR-SSCP 檢測

(表1)，不同基因型與屠宰率、凈肉率、剪切力、背膘厚度、優(yōu)質肉塊質量占宰前活質量的比例具有相關性，而與其他3個胴體性狀和4個肉質性狀的相關性不顯著(P>0.05)。其中，屠宰率FF型顯著高于EE和EF型(P<0.05)，但后兩者差異不顯著(P>0.05)；凈肉率3種基因型間存在顯著性差異(P<0.05)，且EE型>FF型>EF型；優(yōu)質肉塊質量占宰前活質量比例中FF型顯著高于EE和EF型(P<0.05)；背膘厚度FF型和EE型差異不顯著(P>0.05)，但都顯著高于EF型(P<0.05)；剪切力FF型顯著低于EE和EF型(P<0.05)。其他指標的平均數(shù)以FF型較大，如宰前活質量、高檔肉塊質量占宰前活質量比例、眼肌面積、大理石紋等。

從相關性分析結果來看， IGF-Ⅱ基因第2外顯子不同基因型對早勝牛及其雜交類群部分肉用性狀具有顯著影響(P<0.05)，可以作為肉用遺傳資源選育的分子標記基因。根據(jù)專用化肉牛品種的選育方向，從改善和提高肉用性能的角度出發(fā)，優(yōu)先選留FF基因型個體，淘汰EF和EE基因型個體，可以提高群體的生產(chǎn)水平和選育質量。

表1　 IGF-Ⅱ 基因第 2 外顯子遺傳多態(tài)性

表2　 IGF-Ⅱ 基因第 2 外顯子不同基因型與肉用性狀的關聯(lián)性

注：數(shù)值為“平均數(shù)±標準誤”。同行數(shù)值后不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。

3討 論

3.1 IGF-Ⅱ基因第2外顯子的遺傳特征

IGF-Ⅱ基因在不同片段具有較高的多態(tài)性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多處SNPs位點[9-11]。本研究在 IGF-Ⅱ基因第2外顯子檢測到1個SNP位點(T116C)，發(fā)現(xiàn)E、F 2個等位基因和EE、EF、FF 3種基因型，這與前人在不同牛種中檢測的結果類似[12-13]。關于牛 IGF-Ⅱ基因在其他位點是否存在多態(tài)性，還有待進一步驗證。

雜合度 (He)、多態(tài)信息含量(PIC) 的大小可以用來反映群體遺傳變異水平的高低，其數(shù)值越大，表明群體遺傳多樣性越豐富，選擇潛力越大。早勝牛及其雜交群體第2外顯子的群體雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.31和0.42，屬于中度多態(tài)，這與早勝牛雜交選育中導入外來品種引起遺傳結構變化和生活環(huán)境不同等因素有關，表明該位點多態(tài)性較為豐富，后期肉用方向選育中應加大人工選擇的強度，以提高群體生產(chǎn)水平。

3.2 IGF-Ⅱ基因多態(tài)性與肉用性狀的相關性

Vykoukalova 等[14]研究表明， IGF-Ⅱ基因內含子7 存在多態(tài)性，且基因型與背膘厚和瘦肉率呈顯著相關。Jeon等[9]在歐洲野公豬×大白豬參考系 IGF-Ⅱ基因中定位1個影響肌肉表達的QTL，發(fā)現(xiàn)該位點對眼肌面積、背膘厚度、肉質等性狀的影響非常明顯。Oksbjerg等[15]發(fā)現(xiàn)，綿羊中 IGF-Ⅱ基因的表達量與背膘厚度呈正相關，且影響背膘厚度。綜上， IGF-Ⅱ基因可以作為肉用性狀與標記間連鎖分析的候選標記，本研究結果也證實上述觀點。 IGF-Ⅱ基因第2外顯子多態(tài)性與早勝牛及其雜交類群肉用性狀的相關分析結果顯示，基因型對屠宰率、凈肉率、背膘厚度、優(yōu)質肉塊占宰前活質量比例和剪切力具有顯著影響，其中，屠宰率和優(yōu)質肉塊占宰前活質量的比例，F(xiàn)F型都顯著高于EE型和FF型；凈肉率和背膘厚度，F(xiàn)F型和EE型都顯著高于EF型；剪切力，F(xiàn)F型顯著低于EE和EF型。根據(jù)牛肉等級分級標準和消費者對牛肉質量的市場需求，從生產(chǎn)優(yōu)質高檔牛肉的角度考慮，在牛肉嫩度、優(yōu)質高檔肉塊的重量、脂肪沉積等方面，以FF型個體肉質最佳，這與早勝牛特有的肉質細嫩、脂肪沉積好的品質相符，也說明在長期人工選擇中，部分個體已經(jīng)向專門化肉用方向改良。因此，建議將FF基因型作為早勝牛肉用方向選育的有效標記，進一步加大人工選擇強度，堅持選留含有FF型的優(yōu)秀個體，提高優(yōu)勢基因純合度，更好的指導早勝牛的育種工作，為肉牛肉質性狀遺傳改良和種質創(chuàng)新提供基礎數(shù)據(jù)。

3.3早勝牛肉用開發(fā)前景

早勝牛作為秦川牛的優(yōu)秀類群，經(jīng)過多年改良，在體型外貌、產(chǎn)肉率等方面較好地繼承秦川牛生長發(fā)育快、脂肪沉積好的特性[16]，是甘肅省黃牛雜交改良的主打品種。通過18個月集中育肥和屠宰測定，屠宰率變幅為55.81%～60.75%，凈肉率變幅為48.65%～53.30%，眼肌面積變幅為72.67～76.50 cm2，優(yōu)質肉塊質量占宰前活質量比例約7%，高檔肉塊質量占宰前活質量比例約為16%，肉用性能較本地黃牛及雜交后代得到明顯改善，具有生產(chǎn)優(yōu)質高檔牛肉的內在潛質和培育現(xiàn)代肉牛的外在特征。如果后期限制秦川牛的雜交利用，加快培育自有種公牛，逐步使早勝牛具有更穩(wěn)定的品種特征，并應用傳統(tǒng)育種和分子育種技術相結合對早勝牛進行群體內選育提高和橫交固定，有望培育成肉牛新品種(類群)。

Reference：

[1]甘肅省畜牧廳主編.甘肅省畜禽品種志[M].蘭州:甘肅人民出版社,1986:45-47.

Chief Editor with Animal Husbandry Department of Gansu Province.Gansu province Livestock Breeds[M].Lanzhou:China Petrochemical Press,1986:45-47(in Chinese).

[2]KOLYCHEV A P.Insulin-like growth factor Ⅱ ( IGF-Ⅱ).Insulin-like growth factor Ⅱ ( IGF-Ⅱ).Its role among regulatory peptides of the insulin superfamily[J].JournalofEvolutionaryBiochemistryandPhysiology,2000,36 (2):268-274.

[3]DUAN C,REN H,GAO S.Insulin-like growth fators (IGFs),IGF receptors,and IGF-binding proteins:roles in skeletal muscle growth and differentiation[J].GeneralandComparativeEndocrinology,2010,167(3):344-351.

[4]FROESCH E R,BUERGI H,RAMSEIER E B,etal.Antibody-suppressible and nonsuppressible insulin-like activities in human serum and their physiologic significance,an insulin assay with adipose tissue of increased precision and specificty [J].TheJournalofClinicalInvestigation,1963,42:1816-1834.

[5]RINDERKNECHT E,HUMBEL R E.Amino-terminal sequences of two polypeptides from human serum with nonsuppressible insulin-like and cell-growth-promoting activities:Evidence for structural homology with insulin B chain[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA,1976,73(12) :4379-4381.

[6]VANLAERE A S,NGUYEN M,BRAUNSCHWEIG M,etal.A regulatory mutation in IGF2 causes a major a QTL effect on muscle growth in the pig[J].Nature,2003,425(6960):832-836.

[7]MAGRI K A,BENEDICT M R,EWTON D Z.Negative feedback regulation of insulin-like growth factor-Ⅱ gene expression in differentiating myoblasts in vitro[J].Endocrinology,1994,135(1):53-62.

[8]曹兵海.我國肉牛與牛肉產(chǎn)業(yè)最近的形勢、問題與對策[C]//國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術體系第五屆技術交流大會論文集.湖北隨州：國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術體系,2015:1-6.

CAO B H.Recent situation,problem and countermeasure of the beef cattle and beef industry in China[C]//The proceedings of the fifth technical communication meeting with Beef cattle and Yak(Bosgrunniens) industry technology system in China.Suizhou Hubei:Beef cattle and Yak(Bosgrunniens) industry technology system in China,2015:1-6(in Chinese).

[9]JEON J T,CARLBORY O,TOMSTON A,etal.A paterally expressed QTL affecting skeletal and cardiac muscle mass in pigs maps to the IGF2 locus[J].NatureGenetics,1999,21(2):157-158.

[10]NEZER C,MOREAU L,BROUWERS B,etal.An imprinted QTL with major efect on muscle mess and fat deposition maps to the IGF-Ⅱ locus in pigs[J].NatureGentics,1999,21(2):155-156.

[11]DEVANEY J M,HOFFMAN E P,GORDISH D H,etal. IGF-Ⅱ gene region polymorphisms related to exertional muscle damage[J].JournalofAppliedPhysiology,2007,102(5):1815-1823.

[12]毛海霞,陳宏,張春雷,等.郟縣紅牛 IGF2基因多態(tài)性與生長性狀關系研究[J].中國牛業(yè)科學,2008,34(2):1-4.

MAO H X,CHEN H,ZHANG CH L,etal.Association of polymorphism of IGF2 gene with groth traits in Jiaxian red cattle[J].ChinaCattleScience,2008,34(2):1-4 (in Chinese with English abstract).

[13]韓瑞華,昝林森,林大鵬,等.秦川牛 IGF2基因SNPs檢測及其與胴體、肉質性狀的相關性[J].遺傳,2008,30(12):1579-1584.

HAN R H,ZAN L S,LIN D P,etal.SNPs detection of IGF2 gene and its relationship with carcass and meat quality traits in Qinchuan cattle[J].Hereditas,2008,30(12):1579-1584 (in Chinese with English abstract).

[14]VYKOUKALOVA Z,KNOLL A,DVORAK J,etal.New SNPs in the IGF2 gene and association between this gene and backfat thickness and lean meat content in Large White pigs[J].JournalofAnimalBreedingandGenetics,2006,123(3):204-207.

[15]OKSBJERG N,GONDRET F,VESTERGARD M.Basic principles of muscle development and growth in meat-producing mammals as affected by the insulin-like growth factor (IGF) system[J].DomestAnimalEndocrinology,2004,27(3):219-240.

[16]黃磊.秦川牛LXRa基因SNPs檢測及其與部分胴體肉質性狀相關性研究[D].陜西楊凌:西北農林科技大學,2010.

HUANG L.SNPs detection ofLXRaand its relationship with carcass and meat quality traits in Qinchuan cattle[D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2010(in Chinese with English abstract).

Association Analysis between Polymorphism of IGF-Ⅱ Gene in Exon 2 and Beef Performance Traits in Zaosheng Cattle and Hybrid Groups

XU Jianfeng1,ZHANG Yanli2,RONG Weizhong1and WANG Ke1

(1.Gansu Provincial Animal Husbandry and Veterinary Research Institute , Pingliang Gansu744000, China;2.Examing and Inspection Center for Agricultural Product Safety and Quality of Pingliang City, Pingliang Gansu744000, China)

In order to study polymorphism of IGF-Ⅱ gene (Insulin-like growth factor-Ⅱ ) and its influence with characteristics of carcass and meat quality traits. PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect heredity polymorphism of IGF-Ⅱ gene in exon 2 with Zaosheng cattle (Bostaurus) and hybrid groups(Hybrid of South Devon with Zaosheng cattle, hybrid of Angus with Zaosheng cattle), and analyze the correlation of different genotypes with beef performance traits.The results indicated that there was a base mutation at c. 116 T > C of exon 2, which leaded to three genotypes such as EE, EF and FF. The alleles E with the frequency of 0.56 and genotype EF with the frequency of 0.40,were the highest. Before slaughter of FF genotype, dressing percentage and proportion of high quality meat in live mass were significantly higher than that of EE genotype and EF genotype,percentage of net meat of EE genotype was significantly higher than that of FF and EF genotype, Backfat thickness with FF genotype and EE genotype were significantly higher than that of EF genotype, shear force with EE genotype and EF genotype were significantly higher than that of FF genotype. Therefore these results suggested that the exon 2 mutation of IGF-Ⅱ gene could be maker to beef performance breeding with Zaosheng cattle.

Zaosheng cattle; IGF-Ⅱ gene;RCP-SSCP; Beef performance traits;Breeding

2016-01-18

2016-03-10

Project for Technology Research and Development of Gansu Province(No.1207TCYL016).

XU Jianfeng, male, assistant research fellow.Research area:molecular biology.E-mail:xjf_fx@126.com

WANG Ke, male, associate research fellow. Research area:animal breeding technology. E-mail:710401384@qq.com

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

2016-01-18修回日期：2016-03-10

甘肅省技術研究與開發(fā)專項計劃(1207TCYL016)。

徐建峰，男，助理研究員，從事分子生物學研究。E-mail:xjf_fx@126.com

王珂，男，副研究員，主要從事動物繁育技術研究。E-mail:710401384@qq.com

S813.3

A

1004-1389(2016)07-0955-05

網(wǎng)絡出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.002.html