沈 飛，吳啟芳，唐培安，邵小龍，姜大峰（.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧 食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京　003；.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南　5004）

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糙米中黃曲霉毒素B1的ATR-FTIR快速測定

沈 飛1，吳啟芳1，唐培安1，邵小龍1，姜大峰2
（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧 食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210023；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南250014）

摘 要：擬建立基于衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）的糙米中微量黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的快速檢測方法。首先將16 份糙米樣品經(jīng)輻射滅菌后接種產(chǎn)毒菌株并在適宜條件下（28 ℃、相對濕度85%）貯藏30 d，測定其AFB1含量。其次將受AFB1污染樣品磨粉后與空白糙米樣品按質(zhì)量比例進(jìn)行精確混合，獲得AFB1含量在0～890.20 μg/kg內(nèi)的糙米樣品共計(jì)128 份。ATR-FTIR建模分析結(jié)果顯示，依據(jù)AFB1含量高低將樣品劃分為4 類，臨近算法判別分析模型的預(yù)測整體正確率達(dá)到83.3%。運(yùn)用偏最小二乘回歸分析建立的定量模型精度最優(yōu)，預(yù)測相關(guān)系數(shù)、均方根誤差和相對分析誤差值分別為0.970、70.8 μg/kg和4.0。結(jié)果表明，ATR-FTIR技術(shù)用于糙米黃曲霉毒素污染程度的快速分析與篩選具有一定可行性，但需進(jìn)一步研究來提升對低AFB1含量樣品的預(yù)測精度。

關(guān)鍵詞：衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜；糙米；黃曲霉毒素B1（AFB1）；快速檢測

引文格式：

沈飛, 吳啟芳, 唐培安, 等. 糙米中黃曲霉毒素B1的ATR-FTIR快速測定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 187-191. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612033. http://www.spkx.net.cn

SHEN Fei, WU Qifang, TANG Peian, et al. Attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) for rapid detection of aflatoxin B1in brown rice[J]. Food Science, 2016, 37(12): 187-191. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612033. http://www.spkx.net.cn

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是主要由黃曲霉（Asperillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各類糧食產(chǎn)品中，具有強(qiáng)致畸、致癌和致突變等作用[1-2]。糧食中常見的黃曲霉毒素主要有B1、B2、G1和G2四種形式，尤以AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)，1993年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為Ⅰ類致癌物[3]。因此，快速準(zhǔn)確地測定糧食受黃曲霉毒素污染情況具有十分重要的意義。目前黃曲霉毒素測定方法主要有高效液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、酶聯(lián)免疫吸附法[6]等，但這些技術(shù)均存在過程繁瑣、時效性差或成本高等缺點(diǎn)[7-8]，難以滿足現(xiàn)場大批量樣品快速在線檢測需求，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)的檢測分析方法變得十分迫切。

紅外和拉曼光譜分析技術(shù)，具有分析速度快、多組分同時檢測、無需樣品預(yù)處理等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注，已被用于糧食多種品質(zhì)指標(biāo)的分析預(yù)測，并在真菌毒素污染的快速鑒定方面展現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛力[9-12]。Berardo等[13]利用近紅外光譜成功區(qū)分了受串珠鐮刀菌污染的小麥樣品，并對伏馬毒素B1進(jìn)行了定量預(yù)測，預(yù)測均方根誤差（root mean-square error of prediction，RMSEP）達(dá)到1.33 mg/kg。Kos等[14]運(yùn)用衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）檢測了玉米樣品受脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染的情況，建立的模型對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的預(yù)測誤差為600 μg/kg。Lee 等[15]系統(tǒng)比較了近紅外、中紅外和拉曼光譜用于玉米中AFB1（0～1 206 μg/kg）檢測的模型精度，發(fā)現(xiàn)基于拉曼和中紅外光譜的檢測結(jié)果略優(yōu)于近紅外，拉曼光譜模型的RESEP達(dá)到104～124 μg/kg。

然而，從目前的報道中可以得出，光譜技術(shù)用于真菌毒素的檢測仍處于探索階段，研究對象多集中在玉米、小麥和花生等更易受真菌毒素污染的樣品，對稻米的研究則較少[16-18]。雖然有一些定量檢測研究，但主要用于定性分析。因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用ATR-FTIR分析技術(shù)，建立糙米中AFB1的定性定量檢測方法，為最終實(shí)現(xiàn)真菌毒素的在線監(jiān)測提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

2014年黑龍江產(chǎn)糙米樣品，初始水分含量18.7%，真空包裝4 ℃冷藏待用。

產(chǎn)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)菌株：黃曲霉3.17和寄生曲霉3.395，購于中國北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院，置于－18 ℃冷藏待用。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司。

Tensor 27型FTIR儀德國Bruker公司；ZnSe衰減全反射附件美國Pike公司。

1.2方法

1.2.1霉菌培養(yǎng)與接種

首先，將黃曲霉3.17和寄生曲霉3.395標(biāo)準(zhǔn)菌株置于高鹽察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，采用無菌水沖洗培養(yǎng)基斜面，分別調(diào)整2種霉菌孢子懸浮液濃度至約6.03×106CFU/mL。然后，將初始糙米樣品用60Co輻照滅菌，劑量為12 kGy。取4 kg滅菌糙米樣品，以250 g/份分裝為16 份。其中8 份噴灑接種黃曲霉3.17，另8份接種寄生曲霉3.395，經(jīng)平板計(jì)數(shù)法確定接種量約為1.02×105CFU/g。接種后所有樣品置于28 ℃、85%相對濕度環(huán)境條件下進(jìn)行貯藏，30 d后取樣分析。

1.2.2樣品AFB1含量測定

參照GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》，采用高效液相色譜法測定樣品中AFB1含量。步驟簡敘如下：稱取50 g樣品加入200 mL乙腈-水（84∶16，V/V）提取液，振蕩提取30 min。移取8 mL提取液至MycoSepTM228多功能柱凈化，再移取2 mL凈化液在50 ℃條件下氮?dú)饬鞔蹈?。剩余含黃曲霉毒素殘?jiān)尤?00 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，40 ℃條件下衍生反應(yīng)15 min。室溫條件下干燥后，以1 mL乙腈-水（15∶85，V/V）復(fù)溶，過0.45 μm濾膜，裝入樣品瓶，采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。激發(fā)和發(fā)射波長分別為360 nm和440 nm。進(jìn)樣體積為10 μL，流速為1.0 mL/min。每份樣品重復(fù)測定3 次，外標(biāo)法定量。

1.2.3不同AFB1含量樣品配制

高效液相色譜檢測結(jié)果顯示空白樣品中未檢出AFB1，而16 份接種霉菌樣品中AFB1含量均較高。因此，為得到AFB1含量范圍分布較廣的樣品，首先將空白和含AFB1樣品分別經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩。再從每份含AFB1樣品中精確稱量10 g，按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14共7 個質(zhì)量比例，摻入空白樣品，從而將AFB1在樣品中的含量調(diào)整為7.33～890.20 μg/kg。每個水平梯度配制16 個樣品，共計(jì)獲得糙米樣本128 份（16 份空白＋16×7 份AFB1污染樣品）。

1.2.4ATR-FTIR光譜采集

采用Tensor 27型FTIR儀和45 ℃ ZnSe衰減全反射附件采集糙米樣品的光譜信息。將約1 g樣品置于ATR附件的ZnSe晶體上，以空氣為背景進(jìn)行檢測，樣品測定前先掃描空氣背景光譜。光譜區(qū)域?yàn)? 000～600 cm－1，掃描64 次，分辨率為4 cm－1。每份樣品重復(fù)測量3 次，取平均光譜建模。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用TQ analyst 6.0（美國Thermo Electron公司）和Matlab 8.0（美國Mathworks公司）軟件對糙米樣品的ATR-FTIR光譜信息進(jìn)行處理和建模，通過臨近算法（K-Nearest Neighbor，KNN）、偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLSR）、逐步多元性回歸分析（stepwise multiple linear regression，SMLR）和主成分回歸分析（principle component regression，PCR）建立糙米AFB1含量的定性判別及定量預(yù)測模型。運(yùn)用相關(guān)系數(shù)（r）、建模集均方根誤差（root mean-square error of calibration，RMSEC）、交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean-square error of cross-validation，RMSECV）、RMSEP和相對分析誤差（residual predictive deviation，RPD）對模型預(yù)測性能進(jìn)行綜合評價。

2　結(jié)果與分析

2.1AFB1測定結(jié)果

表1 糙米樣品建模集和驗(yàn)證集中AFB1含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1　Descriptive statistics of AFB1concentrations for calibrationn and validation sets of brown rice samples

由表1可知，AFB1含量范圍分布較廣，具有良好的代表性，適用于分析模型的建立。在模型建立前，運(yùn)用Kennard-Stone算法從128 個樣品中選取86 個樣品作為建模集，剩余42 個樣品作為預(yù)測集[19]。

2.2ATR-FTIR光譜特征分析

圖1 不同類別糙米樣品的ATR-FTIR平均光譜Fig. 1　Average ATR-FTIR spectra of brown rice samples from different groups

依據(jù)樣品中AFB1含量的高低，將糙米樣品劃分為4類：第1類（≤5 μg/kg）、第2類（＞5 μg/kg，≤50 μg/kg）、第3類（＞50 μg/kg，≤300 μg/kg）和第4類（＞300 μg/kg）。圖1為4類糙米樣品的ATR-FTIR原始平均光譜。觀察可知，其光譜形狀基本一致，不同類別差異不顯著。其中，3 600～3 030 cm－1范圍內(nèi)強(qiáng)吸收峰與水中O—H的伸縮振動有關(guān)。樣品在1 780～800 cm－1波段內(nèi)吸收變化較為明顯，可作為定性和定量分析的特征圖譜區(qū)。如1 764～1 724 cm－1處的吸收峰與酯類和酸類C＝O的伸縮振動相關(guān)，1 700～1 500 cm－1處對應(yīng)于酰胺中N—H、C—O的彎曲振動，且與黃曲霉毒素中C＝C的伸縮振動有關(guān)。1 475～1 390 cm－1處與C—C及C—H基團(tuán)的彎曲振動有關(guān)；1 390～1 310 cm－1處對應(yīng)于甲基中—C—H的彎曲振動；1 180～950 cm－1處可能來源于—CH2—伸縮振動[20-22]。雖然不同類別樣品的光譜差異微小，仔細(xì)觀察可知，在特定波段，如1 760～1 730 cm－1范圍內(nèi)，吸收峰值隨著AFB1含量的上升而逐步降低，表明光譜變化趨勢與AFB1含量存在一定內(nèi)在聯(lián)系。

2.3判別分析模型建立

表2　不同AFB1水平糙米樣品KNNN分類結(jié)果Table 2　KNN classification results for AFB1contaminated brown ricee samples from different groups

利用主成分分析法提取糙米樣品在1 780～800 cm－1波段內(nèi)的前10 個主成分得分，建立KNN判別分析模型，判別結(jié)果如表2所示。由表2可知，建模集中所有樣品均判別正確，而在驗(yàn)證集42 個樣品中，共有5個樣品被錯判，總體正確率為83.3%。其中，第3類樣品被誤判為第2類幾率最高，表明部分樣品間AFB1絕對含量差別較小，而第4類高含量AFB1正確率最高。圖2為不同類別樣品判別函數(shù)第1、第2主成分得分圖。觀察可知，不同類別樣品有大致分離趨勢。第1類和第4類區(qū)分效果較好，而第2、3類樣品存在部分重疊，與判別分析結(jié)果一致。結(jié)果表明，利用ATR-FTIR區(qū)分樣品受AFB1具有一定可行性，但仍需要進(jìn)一步研究，增加樣品數(shù)量來提高模型的精度和適用性。

圖2　4 類糙米樣品的第1、2判別函數(shù)得分圖Fig. 2　Scatter plot of the first and second discriminant functions for four brown rice groups

2.4定量分析模型建立

為消除基線噪音和散射的影響，采用多元散射校正MSC和SG平滑對糙米樣品光譜進(jìn)行預(yù)處理，并比較了一階和二階微分處理對模型精度的影響，建模結(jié)果如表3所示?？傮w而言，基于PLSR、SMLR和PCR三種方法所建立的模型性能均較佳，預(yù)測相關(guān)系數(shù)rv均高于或接近0.900，RPD值大于2.0。比較而言，PLSR所建模型精度和穩(wěn)健性最佳，SMLR模型次之，PCR模型最低。在PLSR所建模型中，RPD值均大于3.0，尤以一階微分模型穩(wěn)健性最高，RPD值達(dá)到4.0，具有實(shí) 際應(yīng)用潛力。一階微分結(jié)合SMLR所得模型復(fù)雜度低，RMSEP達(dá)到91.2 μg/kg。PCR結(jié)合二階微分性能最佳，但因子數(shù)為13，模型復(fù)雜，預(yù)測精度也不高。圖3為基于一階微分光譜建立的PLSR分析模型的實(shí)際值與預(yù)測值相關(guān)關(guān)系圖。雖然模型預(yù)測精度最優(yōu)（70.8 μg/kg），但對于部分低含量樣品的預(yù)測結(jié)果誤差較大，同他人研究類似，可能與黃曲霉毒素在樣品中的分布不均及毒素在紅外光譜波段的響應(yīng)太低有關(guān)[23]。因此，后續(xù)研究可通過優(yōu)化樣品粉碎等預(yù)處理方法，采用更高效建模算法以及改進(jìn)光譜采集技術(shù)，或者結(jié)合其他分析手段來進(jìn)一步來降低分析誤差，提升檢測精度。

表3　糙米中AFB1含量的PLSR、SMLR和PCR模型建模集與預(yù)測集結(jié)果Descriptive statistics of the multivariate calibration models built by PLSR, SMLR and PCR for the prediction of AFB1concentration in brown rice

圖3　糙米中AFB1實(shí)際值和ATR-FTIR預(yù)測值相關(guān)關(guān)系圖Fig. 3　Correlation statistics between reference values and ATR-FTIR predictions for AFB1in brown rice

3　結(jié) 論

本研究利用ATR-FTIR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立了糙米中AFB1的定性定量分析模型。結(jié)果表明，不同AFB1含量糙米樣品光譜存在一定差異，基于ATR-FTIR光譜建立的KNN模型的判別正確率達(dá)到80%以上。運(yùn)用PLSR方法建立的AFB1定量預(yù)測模型的 預(yù)測相關(guān)系數(shù)rv、RMSEP和RPD值分別為0.970、70.8 μg/kg和4.0，模型精度和穩(wěn)健性均較優(yōu)，表明利用ATR-FTIR光譜分析技術(shù)對糧食的米黃曲霉毒素污染程度的快速分析具有一定可行性。研究同時發(fā)現(xiàn)，部分低質(zhì)量濃度或空白樣品的預(yù)測誤差過大，容易引起誤報警，還需要進(jìn)一步加大樣品量和樣品種類，改善樣品預(yù)處理方法來建立更穩(wěn)健的數(shù)學(xué)模型，如采用自然侵染AF的樣品，減小樣品顆粒尺寸及確保樣品檢測狀態(tài)的一致性等，以提升模型預(yù)測性能。

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Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) for Rapid Detection of Aflatoxin B1in Brown Rice

SHEN Fei1, WU Qifang1, TANG Pei’an1, SHAO Xiaolong1, JIANG Dafeng2
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing210023, China; 2. Shandong Center for Disease Control and Prevention, Jinan250014, China)

Abstract:The objective of this work was to establish a rapid method for aflatoxin B1detection in brown rice by attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR). A set of 16 brown rice samples were sterilized with radiation, incubated after inoculation with toxigenic strains and stored under appropriate conditions (28 ℃ and 85% RH) for 30 days, and the concentrations of AFB1were determined. Then the samples contaminated by AFB1were blended with blank samples in various weight proportions. A total of 128 samples with concentrations ranging from 0 to 890.20 μg/kg were obtained. The ATR-FTIR calibration results indicated that a classification accuracy of 83.3% was obtained by K nearest neighbors (KNN) when the samples were divided into four groups according to AFB1concentration. Quantitative analysis model was built by partial least square regression (PLSR), which showed the best performance in predication, and the regression coefficient of validation (rv), root mean square error of prediction (RMSEP) as well as RPD value, which were 0.970, 70.8 μg/kg and 4.0, respectively. Overall, ATR-FTIR offers a feasible method for rapid screening of brown rice samples contaminated by AFB1. However, further study is needed to improve the prediction power for samples with low AFB1concentrations.

Key words:attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR); brown rice; aflatoxin B1(AFB1); rapid detection

收稿日期：2015-09-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301482）；江蘇省青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20131007）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13KJB550009）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

作者簡介：沈飛（1984—），男，講師，博士，主要從事糧食儲藏和檢測技術(shù)研究。E-mail：shenfei0808@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612033

中圖分類號：TS272.7；O657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0187-05