何冬蘭，詹　銳，萬文結，薛芷筠

(中南民族大學 生命科學學院,湖北省重金屬廢水處理與回收工程技術研究中心, 武漢 430074)

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一株厭氧型聚磷菌的分離鑒定與聚磷特性

何冬蘭，詹銳，萬文結，薛芷筠

(中南民族大學 生命科學學院,湖北省重金屬廢水處理與回收工程技術研究中心, 武漢 430074)

摘要在厭氧-缺氧環(huán)境下，從磷礦廢水中篩選出一株高效的厭氧型聚磷菌，命名為AP06.對該菌株進行了生理生化研究及16S rDNA序列分析，并對該菌株的聚磷效率和影響聚磷特性的因素進行了研究.結果顯示：菌株初步鑒定為Aeromonassobria，聚磷效果最佳的pH值為7，溫度為30℃，磷源為KH2PO4，接種量(V/V)為7%，菌株的聚磷效率為86.1%.

關鍵詞篩選; 聚磷菌; 厭氧; 鑒定

水是人類與所有生物生存與發(fā)展的最基礎資源之一.近年來水體富營養(yǎng)化問題越來越嚴重，使得人類面臨著水資源短缺與水環(huán)境污染的雙重挑戰(zhàn).氮、磷污染物是導致眾多內(nèi)陸湖、水庫甚至河流水體富營養(yǎng)化的主要因素[1].在所有已知的除磷方法中，成本低廉且無二次污染的微生物修復技術是解決水體富營養(yǎng)化的有效途徑之一[2].

隨著反硝化細菌的發(fā)現(xiàn)，厭氧型的聚磷菌已經(jīng)成為了研究熱點，這類微生物能在厭氧-缺氧的條件下完成反硝化和有效聚磷的雙重目的，對水體富營養(yǎng)化的治理具有巨大的潛力及重大意義[3].

通過本研究，希望從磷礦廢水中篩選出能在厭氧環(huán)境下高效聚磷的菌株，同時對該菌株的聚磷條件進行研究，能為磷污染水體的生物修復奠定基礎.

1材料與方法

1.1材料和儀器

厭氧培養(yǎng)箱(YQX-II型上海厭氧培養(yǎng)箱)，紫外分光光度計(Lambda 35型，英國PerkinElmer公司)，數(shù)字型pH計(國營杭州萬達儀器儀表廠)，BA400顯微鏡(德國Motic公司).

過硫酸鉀，抗壞血酸，鉬酸銨，硫酸，磷酸二氫鉀等試劑均為國藥集團分析純.

廢水樣本取自湖北省宜昌市長陽開發(fā)區(qū)磷礦區(qū)廢水.

主要培養(yǎng)基包括：1) 分離培養(yǎng)基[4]：無水乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O、CaCl20.2 g、 (NH4)2SO42 g、K2HPO4分別為2、5、 8 、10、15、 20 mg、水1000 mL；2)YG培養(yǎng)基基[5]：酵母浸膏1 g、葡萄糖1 g、K2HPO40.3 g、KH2PO40.25 g、MgSO40.2 g、水 1000 mL；3)合成廢水[6]：乙酸鈉0.925 g、蛋白胨0.1 g、酵母膏0.01 g、NaCl 0.05 g、KH2PO40.0655 g，MgCl2·7H2O 0.1537 g、CaCl20.025 g、水1000 mL 、pH 7.0～7.2；4) LB培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1000 mL、pH 7.0～7.2.

1.2厭氧型聚磷菌的篩選

取1 mL的磷礦廢水加入到100 mL分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600>0.3)后，依次取1 mL接入不同磷含量的分離培養(yǎng)基中，將有菌落生長的含磷濃度最大的菌液進行梯度的稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落并保存菌種.

1.3菌株AP06聚磷效果的測定

1.4AP06菌株聚磷條件的研究

以合成廢水為基礎，通過控制不同條件，分別研究pH、溫度、磷源和接種量對菌株AP06聚磷效果的影響.

1.4.1pH對聚磷效果的影響

將合成培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，并接種7%(V/V)的AP06菌株，于厭氧培養(yǎng)箱中30℃下培養(yǎng)48 h 后測定OD600和聚磷效果.

1.4.2溫度對聚磷效果的影響

將活化的AP06菌株以7%(V/V)的接種量接種至合成廢水中，于厭氧培養(yǎng)箱中分別為22℃、25℃、28℃、30℃、34℃、37℃等不同溫度條件下培養(yǎng)48 h后測定菌株的OD600值和聚磷率.

1.4.3磷源對聚磷效果的影響

將活化的AP06菌株以7%(V/V)的接種量分別接種至以(NaPO3)6、NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、K3PO4為磷源的合成廢水中，于厭氧培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后測定OD600值和聚磷率.

1.4.4接種量對聚磷效果的影響

將活化的AP06菌株分別取1%、3%、5%、7%、10%(V/V), 不同接種量的菌液至合成廢水中，厭氧培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后測定菌株的OD600值和聚磷率.

1. 5菌株生理鑒定與16S rDNA分析

對菌株AP06進行亞甲基染色和革蘭氏染色[7,8].將AP06菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，提取菌株總DNA，隨后PCR擴增得其16S rDNA.將PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上，經(jīng)DNA測序后，使用NCBI和MEGA5對序列進行分析并建系統(tǒng)進化樹.

2結果與分析

2.1聚磷效果的測定

菌株的聚磷效果結果見圖1.從圖1可知，AP06菌株在厭氧環(huán)境下經(jīng)過48 h的生長后進入對數(shù)期，培養(yǎng)基中的磷含量隨著菌株的對數(shù)生長而快速減少，當培養(yǎng)至48 h時，磷濃度由最初的27.3 mg/L降至1.9 mg/L，培養(yǎng)基中磷的去除率即菌株的聚磷效率達到了86.1%.而作為對照的E.coli，培養(yǎng)基上清液中的磷濃度由最初的30.4 mg/L降至24.1 mg/L，磷的去除率為20.7%.

圖1　菌株AP06的聚磷效果Fig.1　Efficiency of phosphate accumulating of strain AP06

2.2不同條件對菌株聚磷效果的影響

2.2.1pH值對菌株聚磷效果的影響

圖2　pH值對菌株AP06聚磷效果的影響Fig.2　Effect of pH on the phosphorus removal rates by strain AP06

pH對AP06菌株的生長和聚磷效果有明顯的影響(見圖2).當pH低于7時，菌株AP06的生長受到了抑制，除磷的效果也較差.菌株AP06在pH為7時除磷效果達到最佳， 培養(yǎng)液中磷濃度由20.5mg/L降至8.1mg/L，磷的去除率為68.3%.隨著pH的升高，菌株在48 h時也能生長，但除磷效果未提升.

2.2.2溫度對菌株AP06聚磷效果的影響

溫度對菌株AP06聚磷效果的影響見圖3.由圖3可見AP06菌株的最佳生長溫度是30℃，此時除磷效果最佳，磷濃度由19.5 mg/L降至6.4 mg/L，效率為71.8%.當溫度低于28℃時，菌株的生長和聚磷效果均受到了抑制.溫度過高不適合菌株的生長和除磷.

圖3　溫度對菌株AP06聚磷效果的影響　Fig.3　Effect of temperature on the phosphorus removal rates by strain AP06

2.2.3磷源對菌株AP06聚磷效果的影響

在5種磷源中， AP06菌株對K2HPO4的吸附效果最好(圖4)，磷濃度由122.46mg/L降到115.86mg/L，聚磷效果為21.7%.NaH2PO4的吸附效果最差.由于5種磷源的培養(yǎng)液含磷量均較高(磷含量>60 mg/L)，導致AP06對各種磷源的培養(yǎng)液處理效果均不理想.

圖4　磷源對菌株AP06聚磷效果的影響Fig.4　Effect of resource of phosphorus on the phosphorus removal rates by strain AP06

2.2.4接種量對菌株AP06聚磷效果的影響

10%以內(nèi)的 接種量與AP06菌株的生長及聚磷效果呈正相關(見圖5).當菌株的接種量低于7%時，菌株的生長和聚磷效率都與接種量成正相關，菌株的最佳接種量為7%，磷濃度由30.6 mg/L降至5.5 mg/L，聚磷效率為82%，當接種量大于7%時，接種量的增加不會影響菌株的生長和聚磷效率.

圖5　接種量對菌株AP06聚磷效果的影響Fig.5　Effect of inoculum volume on the phosphorus removal rates by strain AP06

2.2.5染色結果與系統(tǒng)進化樹

在分離培養(yǎng)基中，AP06菌株的菌落呈乳白色，表面光滑，較厚、不透明.顯微鏡下觀察成短桿狀，革蘭氏染色結果陰性.亞甲基藍染色結果能在菌株體內(nèi)觀察到明顯的黑色顆粒，為Poly-P構成的異染顆粒.

AP06菌株與Aeromonassobria16S rDNA序列有99%的同源性，初步鑒定該菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonassobria)

圖6　AP06菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.6　Phylogenetic tree of strain AP06

3結語

本研究從磷礦廢水中篩選出一株厭氧型的高效聚磷菌AP06，為革蘭氏陰性菌，并能在菌株體內(nèi)形成Poly-P的異染顆粒，進一步經(jīng)16S rDNA序列比對分析,AP06菌株初步鑒定為嗜水氣單胞菌(Aeromonassobria).通過聚磷效果的測定表明：該株菌在厭氧環(huán)境下48h計入對數(shù)生長期，聚磷效果為86.1%.根據(jù)國內(nèi)外近些年的報道，氣單胞菌聚磷特性的研究數(shù)量很少，周康群等[10]篩得的氣單胞菌菌株聚磷效率為91.0%，Jyotsnarani Jena等[11]篩得的菌株聚磷效率為86%，高茜等[12]所篩得的氣單胞菌聚磷效率為70%.

AP06菌株的最佳聚磷單因素分別為：pH為7，溫度為30℃，磷源為K2HPO4，接種量不低于7%，其中磷源對菌株聚磷效率的影響較小，pH值、溫度和接種量等單因素對菌株聚磷效果影響明顯.

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Isolation and Characteristics of an Anaerobic Phosphate-Accumulating Bacterium Strain

HeDonglan,ZhanRui,WanWenjie,XueZhijun

(Research Center for Heavy Metal Wastewater Treatment and Reuse Engineering & Technology of Hubei Province,College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

AbstractA high-efficiency phosphate-accumulating bacterium strain named AP06 was isolated from phosphorite wastewater . The strain was identified according to its physiological and biochemical characteristics, and its 16S rDNA sequence. The biological phosphorus removal characteristics of this strain were also studied. The results showed that the strain was identified asAeromonassobria. The phosphorus effect was best with removal rate of 86.1% when pH of the fermentation medium was 7, culture temperature was 30 ℃, KH2PO4was used as phosphorus source, and the inoculum concentration was 7%(V/V).

Keywordsisolation; phosphate-accumulating bacterium; anaerobic-anoxic condition；identification

收稿日期2014-03-14

作者簡介何冬蘭(1964-)，女，教授，研究方向：資源微生物，E-mail:hdl@mail.scuec.edu.cn

基金項目湖北省自然科學基金重點資助項目(BZZ11003);中央高校基本業(yè)務費專項資助項目(CZW15054)

中圖分類號Q28； Q291

文獻標識碼A

文章編號1672-4321(2016)02-0023-03