羅依雨, 羅　維, 劉峻熙, 楊志民, 倪　賀, 李海航

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

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啤酒廢酵母自溶提取物的制備及抗氧化活性研究

羅依雨, 羅維, 劉峻熙, 楊志民, 倪賀*, 李海航

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

摘要：以廣州本地啤酒廠廢酵母為材料，通過單因素實驗研究其最佳自溶條件及最佳微波水解條件.比較自溶、微波水解與外加酶制劑處理法制備酵母提取物的效果，研究了該提取物的抗氧化活性. 結(jié)果表明，啤酒酵母的最佳自溶條件為固液比1∶20、溫度45.0 ℃、pH 6.0、時間48 h，在此條件下，酵母蛋白質(zhì)的水解度為41.5%，提取蛋白質(zhì)得率為42%. 自溶法制備啤酒酵母提取物的效率與外加酶制劑處理的效果相當(dāng)，而顯著高于微波水解法，提取物具有較高的抗氧化活性. 研究表明，自溶法是開發(fā)利用啤酒廠廢棄的酵母和制備酵母提取物的較好方法.

關(guān)鍵詞：啤酒酵母； 提取物； 自溶； 微波水解； 蛋白質(zhì)得率； 抗氧化活性

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 是一種用于啤酒生產(chǎn)的繁殖極快的單細(xì)胞微生物，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，且氨基酸組成齊全，富含人體所缺乏的各種維生素和微量元素，兼?zhèn)涿廊荨⑹萆?、養(yǎng)生的功效，具有很高的開發(fā)價值[1]. 中國啤酒產(chǎn)量連續(xù)10年保持世界第一，每年產(chǎn)生約50 萬t的啤酒廢酵母，除很少部分用作飼料外，大部分被直接排放[2].由于啤酒廢酵母的蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價值和安全性，用啤酒廢酵母提取和制備食用功能蛋白引起了研究者的關(guān)注. 但酵母具有非反芻動物難以消化的堅固的細(xì)胞壁，其細(xì)胞內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)很難釋放出來；細(xì)胞內(nèi)還含有較高的核酸，需將其分解，否則易引起人體的尿酸偏高，導(dǎo)致痛風(fēng)癥. 因此，開發(fā)高效和經(jīng)濟的啤酒廢酵母蛋白質(zhì)利用方法尤為重要[3].

外加酶制劑處理可使啤酒酵母細(xì)胞破壁，提高營養(yǎng)物的提取率、縮短提取時間，成為國內(nèi)食品加工業(yè)的研究熱點.研究[4-5]表明，利用蛋白內(nèi)切酶、外切酶、磷酸二酯酶和AMP-脫氨酶聯(lián)合酶解酵母細(xì)胞22 h，酵母固形物得率能夠達(dá)到53%. 但酶制劑價格昂貴，作用效果不一.

利用活性酵母自身的水解酶(如蛋白酶、核酸酶)將啤酒酵母細(xì)胞內(nèi)的大分子水解成多肽、氨基酸和核苷酸等. 影響酶促反應(yīng)的因素，如溫度、pH和時間等，均會影響自溶效果.研究[6-7]發(fā)現(xiàn)啤酒酵母在45～60 ℃、近中性pH條件下水解48～121 h，自溶效果較好. 經(jīng)自溶后的酵母提取物具有廣泛的生理藥理活性，包括降血壓、抗菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等，具有保健食品和藥品的開發(fā)潛力. 目前，關(guān)于酵母自溶與酶解法等相關(guān)研究尚少，其在生產(chǎn)中的優(yōu)越性并未完全體現(xiàn).

本研究對啤酒廢酵母的自溶條件進(jìn)行了研究，并與微波水解法和外加酶制劑水解法的效果進(jìn)行了比較，測試了自溶法制備的酵母多肽的抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用啤酒廢酵母資源提供依據(jù).

1材料與方法

1.1實驗材料

啤酒廢酵母由廣州市本地啤酒廠提供，酵母泥經(jīng)水洗、烘干得到干酵母，-20 ℃保存?zhèn)溆? 酵母復(fù)合水解酶購于廣東五洲藥業(yè)有限公司，保存于-20 ℃.

1.2啤酒廢酵母自溶水解

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，料液比為1∶20時酵母自溶的蛋白質(zhì)得率最高.向裝有1.0 g干酵母粉的錐形瓶中加入20.0 mL蒸餾水，分別在不同溫度和不同pH條件下置于振蕩培養(yǎng)箱中自溶不同時間，自溶后沸水浴5 min，以6 000 r/min離心10 min，收集上清液中的提取液，測定蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)得率.

1.3啤酒廢酵母微波水解

向裝有1.0 g干酵母的錐形瓶中加入20.0 mL蒸餾水，分別在不同pH、微波水解次數(shù)等條件下置于微波爐中中低火處理6 min. 將提取液定容至5.0 mL，以6 000 r/min離心10 min，收集上清液中的提取液，測定蛋白質(zhì)得率和蛋白質(zhì)水解度.

1.4啤酒廢酵母酶水解

酵母蛋白質(zhì)的酶水解在已有研究[8]所得的最佳酶解條件下進(jìn)行. 向裝有1.0 g啤酒廢酵母的錐形瓶中加入20.0 mL蒸餾水、酵母復(fù)合水解酶∶干酵母質(zhì)量比3.5∶100，調(diào)節(jié) pH至6.5，在60 ℃水浴中酶解6 h. 酶解后沸水浴5 min，以6 000 r/min離心10 min，收集上清液中的提取液，測定蛋白質(zhì)得率和蛋白質(zhì)水解度.

1.5蛋白質(zhì)含量測定

采用雙縮脲法[9]測定蛋白質(zhì)含量. 以不同質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線.取各種提取液1.0 mL，置于試管內(nèi)，加入雙縮脲試劑4.0 mL，混勻后靜置30 min，測其在540 nm下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度.

1.6蛋白質(zhì)水解度測定

采用甲醛滴定法[10]，取啤酒廢酵母的各種提取液5.0 mL，置于250 mL的燒杯中，加入30.0 mL去二氧化碳的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入5.0 mL pH 9.2甲醛溶液，用磁力攪拌器混勻，再用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至 pH 9.2，記錄NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗數(shù)V1(mL)，同時，取未水解的酵母提取液5.0 mL，按上述方法做空白實驗，記錄NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗數(shù)V2(mL),計算啤酒廢酵母的各種提取液中蛋白質(zhì)水解度.

1.7蛋白質(zhì)得率測定

用凱氏自動定氮法測定蛋白質(zhì)的總得率[11]. 分別取啤酒廢酵母的各種提取液3.0 mL，置于消化管中，進(jìn)行凱氏定氮，最后滴定的標(biāo)準(zhǔn)硫酸濃度為0.05 mol/L，記錄硫酸體積消耗數(shù)，并計算各水解條件下的蛋白質(zhì)得率.

1.8DPPH·清除力測定

1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)清除力的測定參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行.配制120 μmol/L DPPH-乙醇溶液(體積比為50%)，取0.1 mL樣品溶液，加入2.9 mL DPPH，室溫靜置20 min后按以下式計算清除力：

清除力ORSC%=(1-(A-B)/Ao)×100%，

式中A為樣品與DPPH反應(yīng)(樣品0.1 mL+2.9 mL DPPH)后的吸光度；B為樣品的空白(樣品0.1 mL+2.9 mL乙醇)的吸光度;Ao為未加樣的DPPH(2.9 mL DPPH+0.1 mL 50%乙醇)的吸光度.

1.9薄層色譜自顯影法測體積比抗氧化活性

將最佳自溶條件下所得的提取液在2塊硅膠薄層色譜板上展層分離，展層劑為正丁醇∶水∶乙酸體積比=3.5∶5.0∶1.5. 展層后的硅膠板置于室溫下，使展層溶劑充分揮發(fā). 將其中一塊展層的硅膠板置于碘蒸汽罐中顯色，觀察樣品成分的分離. 另一塊展層的硅膠板采取自顯影法測定抗氧化活性，用0.04% DPPH·的乙醇溶液均勻噴霧，于40 ℃加熱30 min，在硅膠板上直接觀察和記錄各分離物質(zhì)的抗氧化活性[13].

2結(jié)果與討論

2.1啤酒酵母最佳自溶條件研究

2.1.1溫度的影響已知酵母自溶中起主要作用的是蛋白酶、核酸酶和葡聚糖酶，最適反應(yīng)溫度一般在40～60 ℃[14].將干酵母按照1∶20的料液比加入到pH 7.0的水中，在40～60 ℃的不同溫度下自溶24 h. 當(dāng)溫度為40 ℃時(圖1A)，提取液中的蛋白質(zhì)含量和水解度都較低.當(dāng)溫度升高到45 ℃時，其蛋白質(zhì)含量(3.73 g/L)和水解度(28%)均達(dá)到最大.隨著溫度的繼續(xù)升高，提取液的蛋白質(zhì)含量和水解度都隨溫度的上升降低.因此，確定啤酒酵母的最佳自溶溫度為45 ℃.

2.1.2pH的影響啤酒酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶一般在pH 5.0～8.0時有活性. 在45.0 ℃條件下自溶24 h、pH 6.0時(圖1B)兩者都達(dá)到最高值. 因此，確定啤酒酵母的最佳自溶pH為6.0.

2.1.3水解時間的影響在溫度為45.0 ℃、pH為6.0的自溶條件下，探究自溶時間對啤酒酵母自溶的影響. 在12～48 h(圖1C)，提取液中蛋白質(zhì)含量和水解度均隨自溶時間的增加而增加，在48 h時達(dá)到最高.之后，水解度不再增加，而蛋白質(zhì)含量則下降. 因此，確定啤酒酵母的最佳自溶時間為48 h. 本研究采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，只能測定蛋白質(zhì)中肽鍵的量，自溶48 h后的蛋白質(zhì)含量下降可能由于有部分蛋白質(zhì)被水解成氨基酸.

綜上所述，確定啤酒酵母的最佳自溶條件為溫度45 ℃、pH 6.0，自溶48 h.在此條件下，提取液中蛋白質(zhì)含量為5.15 g/L，水解度為41.5%.凱氏定氮法測得自溶蛋白質(zhì)的得率為42.3%.

圖1　溫度(A)、pH(B)和時間(C)對酵母自溶的影響

2.2微波水解對啤酒酵母蛋白質(zhì)提取效果的影響

2.2.1pH的影響根據(jù)提取液全部蒸干的時間確定啤酒酵母的微波水解時間.將含有1 g酵母粉的20.0 mL蒸餾水，在中低火的微波條件下處理6 min后，提取液被全部蒸干，由此確定微波水解啤酒酵母的處理時間為6 min. 在中低火的微波條件下水解啤酒酵母6 min，在pH 5.0～8.0(圖2A)，提取液中蛋白質(zhì)含量隨pH的升高逐漸增加，pH為8.0時達(dá)到最高，pH大于8.0時，蛋白質(zhì)含量下降. 由此確定啤酒酵母微波水解的最佳pH為8.0.

2.2.2微波水解次數(shù)的影響在中低火、pH 8.0的微波條件下處理酵母6 min，發(fā)現(xiàn)提取液中蛋白質(zhì)含量隨著水解次數(shù)的增加而升高(圖2B)，微波水解4次時，提取液的蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高(4.40 g/L). 因此，確定微波水解啤酒酵母的最佳條件為料液比1∶20、pH 8.0的水溶液、用微波爐的低檔能量處理4次，每次6 min.在此條件下得到的提取液的蛋白質(zhì)含量為4.40 g/L.前述的最佳自溶條件下，提取液的蛋白質(zhì)含量為5.15 g/L，表明微波水解法水解酵母蛋白的效率顯著低于自溶處理.

圖2　pH(A)和微波水解次數(shù)(B)對酵母提取效果的影響

Figure 2Effects of pH (A) and microwave hydrolysis times (B) on yeast extraction

2.3啤酒酵母自溶水解效果

有研究[15]表明，酵母復(fù)合水解酶在其最佳反應(yīng)條件下(酵母復(fù)合水解酶∶干酵母質(zhì)量比為3.5∶100，反應(yīng)溫度60 ℃、pH 6.5、時間6 h)水解酵母蛋白，90%的蛋白質(zhì)被提取并水解，水解度為25.3%. 本研究比較了酵母自溶和酵母復(fù)合水解酶酶解對啤酒廢酵母制備效果的影響(圖3)，在啤酒酵母最佳自溶條件下，酵母蛋白質(zhì)得率與外加酶制劑處理的蛋白質(zhì)得率相當(dāng)，均能達(dá)到42%.將啤酒酵母自溶后再加酶制劑處理，提取液中的蛋白質(zhì)含量較單因素處理僅提高了2.6%. 表明自溶處理能有效水解啤酒酵母中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)提取率與外加酶制劑處理相當(dāng)，高于微波處理. 與外加酶制劑處理和微波處理相比，自溶處理簡單，可大幅度降低酵母蛋白制備的成本或能耗，是一種理想的制備啤酒廢酵母蛋白質(zhì)的方法.

圖3酵母自溶與外加酶制劑處理對酵母蛋白的提取效果

Figure 3Effects of yeast autolysis and enzyme preparation on yeast extraction

2.4酵母提取物抗氧化活性

初步分析了具有抗氧化活性的酵母提取物的DPPH·清除能力.啤酒酵母的提取液的蛋白質(zhì)含量為5.15 g/L(圖4)，其DPPH·的清除能力為20.6%.將提取液逐級稀釋后，其DPPH·清除能力逐漸下降；將提取液濃縮后，隨著蛋白質(zhì)含量的增加，其DPPH·清除能力逐漸升高，當(dāng)質(zhì)量濃度為41.2 g/L時，其DPPH·清除能力達(dá)到62%. 與沒有明顯抗氧化性的酶解酵母多肽相比，自溶所得啤酒酵母提取液具有較好的抗氧化性，其DPPH·清除能力呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性[21].

圖4　酵母自溶濃度對DPPH·清除力的影響

Figure 4Effect of concentration of yeast autolysis on DPPH· radical-scavenging activity

用硅膠薄層層析法對啤酒廢酵母的提取液成分進(jìn)行分析，并在薄層板上進(jìn)行了抗氧化活性分析. 將提取液點在硅膠薄層板上(圖5)，用展層劑(正丁醇∶水∶乙酸=3.5∶ 5.0∶1.5)展開后，在碘蒸汽罐中顯色可觀察到分離成3個主要組分(圖5A). 抗氧化活性自顯影結(jié)果(圖5B)顯示組分2、組分3部位DPPH·的紫色消失而組分1部位紫色依然存在，表明組分1無DPPH·清除活性，組分2和3具有DPPH·清除活性.

圖5　薄層色譜法分離(A)和酵母提取物抗氧化活性測定(B)

Figure 5Separation(A) and identification(B) of yeast antioxidant extract with TLC

3結(jié)論

探討了啤酒廢酵母的最佳自溶條件，并將其與微波水解和外加酶制劑處理的水解效果進(jìn)行了比較. 結(jié)果顯示，啤酒酵母的最佳自溶條件為固液比1∶20、自溶溫度45.0 ℃、自溶pH6.0、自溶時間48 h，自溶后提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5.15 g/L，水解度為41.5%，蛋白質(zhì)得率均為42%. 利用該方法制備啤酒酵母提取物，其蛋白質(zhì)的得率顯著高于微波水解法，且與外加酶制劑處理的作用效果相當(dāng)，并能大幅縮減酶解法制備酵母多肽的生產(chǎn)成本. 抗氧化活性研究表明，自溶法制備的啤酒酵母提取液具有較高的抗氧化活性.

參考文獻(xiàn)：

[1]李海霞. 啤酒廢酵母泥綜合利用的關(guān)鍵技術(shù)研究[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2009:11.

LI H X. Study on criticality technology of multi-utilization of the waste brewing yeast paste[D]. Changchun: Jilin University, 2009:11.

[2]李科德, 曾慶孝. 啤酒廢酵母泥綜合利用的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè). 2007, 33(2): 63.

LI K D, ZENG Q X. Preparation of yeast extract and β-1, 3-glucan from spent brewer’s yeast[J]. Food and Fermentation Industries, 2007, 33(2): 63.

[3]李祥, 羅倉學(xué), 彭莉, 等. 啤酒酵母抽提物工藝的研究[J]. 釀酒科技, 2002(1): 65.

LI X, LUO C X, PENG L, et al. Study on the techniques in extraction of waste beer yeast[J]. Liquor-making Science and Technology, 2002(1): 65.

[4]CHAE H J, JOO H, IN M J, et al. Utilization of brewer’s yeast cells for the production of food-grade yeast extract：Part I: effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics[J]. Bioresource Technology, 2001, 76(3): 253.

[5]MA C, NI X, CHI Z, et al. Purification and characterization of an alkaline protease from the marine yeastAureobasidiumpullulansfor bioactive peptide production from different sources[J]. Marine Biotechnology, 2007, 9(3): 343.

[6]ALCAIDE J M, PUEYO E, POLO MC, et al. Bioactive peptides released fromSaccharomycescerevisiaeunder accelerated autolysis in a wine model system[J]. Journal of Food Science, 2007, 72(7): M276-M277.

[7]TANGULER H, ERTEN H. Utilisation of spent brewer’s yeast for yeast extract production by autolysis: the effect of temperature[J]. Food and Bioproducts Processing, 2008, 86(4): 317.

[8]NI H, LI L, LIU G, et al. Isolation and identification of an angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptide from yeast (Saccharomycescerevisiae)[J]. Current Analytical Chemistry, 2012, 8(1): 180.

[9]程濤, 孫艷波, 李健. 雙縮脲法測定乳中酪蛋白含量[J]. 中國乳品工業(yè), 2000, 28(3): 34.

CHENG T, SUN Y B, LI J. Determination of casein content in milk by biuret’s method[J]. China Dairy Industry, 2000, 28(3): 34.

[10]李曉東, 牛治霞, 張柏林. 乳清蛋白水解物水解度3種測定方法的比較[J]. 中國乳品工業(yè), 2006, 34(10): 60.

LI X D, NIU Z X, ZHANG B L. Various methods available for the determination of hydrolyzed degree of whey protein[J]. China Dairy Industry, 2006, 34(10): 60.

[11]馬丹. 凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量[J]. 計量與測試技術(shù), 2008, 35(6): 57-58.

MA D. Kjeldahl determination of protein content[J]. Metrology and Measurement Techique, 2008, 35(6): 57-58.

[12]彭長連, 林植芳, 林桂珠. 光對4種木本植物葉片清除有機自由基能力的影響[J]. 植物學(xué)報, 2000, 42(4): 394.

PENG C L, LIN Z F, LIN G Z. Effect of light on scavenging capacity for organic free radical in leaves of four woody plants[J]. Acta Botanica Sinica, 2000, 42(4): 394.

[13]TORBATI M, NAZEMIYEH H, LOTFIPOUR F, et al. Chemical composition and in vitro antioxidant and antibacterial activity ofHeracleumtranscaucasicumandHeracleumanisactisroots essential oil Bioimpacts[J]. Bioimpacts, 2014, 4(2): 69.

[14]楊建梅, 李紅, 杜金華. 啤酒廢酵母自溶條件的研究[J]. 中國釀造, 2012, 31(2): 95.

YANG J M, LI H, DU J H. Autolysis conditons of waste brewer’s yeast[J]. China Brewing, 2012, 31(2): 95.

[15]郭莎莎. 酶解酵母蛋白制備生物活性肽的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2012: 5.

GUO S S. Preparation of bioactive peptides from yeast protein by enzymatic hydrolysis[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2012:5.

[16]YAMAVCHI F, SUETSVNA K. Immunological effects of dietary peptide derived from soybean protein[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 1993, 4(8): 450.

[17]HOSKIN D W, RAMAMOORTHY A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2008, 1778(2): 357.

[18]祝驥, 高飛, 易喻, 等. 抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2008, 20(4): 605-610.

ZHU J, GAO F, YI Y, et al. Progress on antimicrobial peptides[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2008, 20(4):605-610.

[19]凌秀梅. 利用啤酒廢酵母制備多肽的研究[D]. 貴陽: 貴州大學(xué), 2007:5.

LING X M. Preparation of bioactive peptides from beer yeast[D]. Guiyang: Guizhou Universitiy, 2007:5.

[20]倪賀. 酵母來源血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制多肽的制備及其抑制機理的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2012:5-7.

NI H. Preparation and inhibition mechanism of angiotensin converting enzyme-inhibitory peptide from yeast[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2012:5-7.

[21]王昕哲. 酵母β-葡聚糖和活性多肽的制備及其性質(zhì)研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2014: 5.

WANG X Z. Preparation and properties of bioactive peptides and β-glucans from yeast[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2014: 5.

【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

Preparation and Antioxidant Activity of Peptides from Waste Saccharomyces Cerevisiae

LUO Yiyu, LUO Wei, LIU Junxi, YANG Zhimin, NI He*, LI Haihang

(Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science,South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：The brewery waste yeast (Saccharomycescerevisiae) contains 50% proteins and has high values of application. The optimal conditions of autolysis ofS.cerevisiaecells were explored by the single-factor tests, and its efficiency was compared with the microwave-assisted hydrolysis and exogenous enzyme hydrolysis. The results showed that the optimal autolysis conditions of the yeast were with a solid-liquid ratio of 1∶20, at pH 6.0 and 45.0 ℃ for 48 h. Under these conditions, yeast proteins were hydrolyzed and extracted at the yield of 42%, the degree of hydrolysis was 41.5%. The autolysis method showed the same efficiency as the exogenous enzyme hydrolysis, but higher than that of the microwave-assisted hydrolysis. The prepared yeast extracts by autolysis showed high antioxidant activity.

Key words：Saccharomycescerevisiae; extract; autolysis; microwave-assisted hydrolysis; protein yield; antioxidant activity

收稿日期：2015-06-15《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金項目(2014A030313423)；廣東省科技計劃項目 (2014A010107026)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師類項目(20134407120004)

*通訊作者:倪賀，講師，Email: 022524328@163.com.

中圖分類號：Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:1000-5463(2016)01-0089-05