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馬冷凍吸管精液制作方法

優(yōu)質(zhì)種公馬價(jià)格非常昂貴，如果采用自然交配的方法，公馬不僅利用率低還容易傳染生殖系統(tǒng)的疾病。為最大限度的提高種公馬利用率，減少種公馬感染生殖系統(tǒng)疾病的幾率，在實(shí)際生產(chǎn)中往往使用人工授精的方式。一匹種公馬1次采精的精液量至少可以交配10～100匹母馬，但是當(dāng)天不可能有這么多母馬同時(shí)發(fā)情，為了減少精液的浪費(fèi)，就必須制作吸管精液冷凍保存，以備今后使用或遠(yuǎn)距離運(yùn)輸。

1 采精

1.1 采精前的準(zhǔn)備

假陰道的準(zhǔn)備：采精前向假陰道內(nèi)胎夾層灌入40～42℃熱水1 500～3 000 mL，而后在假陰道入口前1/3段用玻璃棒均勻涂抹潤(rùn)滑劑，再充氣調(diào)試內(nèi)腔壓力，使內(nèi)胎呈“Y”字型，入口為較淺的漏斗狀為宜。灌水量、內(nèi)腔充氣壓力視公馬陰莖的粗細(xì)、長(zhǎng)短調(diào)整。采精時(shí)內(nèi)胎溫度應(yīng)保持37～39℃。

臺(tái)馬的準(zhǔn)備：選擇與種公馬相匹配、健康溫順、營(yíng)養(yǎng)良好的臺(tái)馬，保定繩保定，用繃帶布包扎整個(gè)馬尾并拉系于馬體左側(cè)，依次用2%來(lái)蘇兒液和清水清洗后軀和外陰部，用干凈紗布或毛巾擦干。

1.2 采精方法

將種公馬牽至采精場(chǎng)，以臺(tái)馬刺激其性欲。陰莖勃起后，用溫?zé)岬?%碳酸氫鈉溶液擦洗生殖器及包皮，溫開(kāi)水沖凈后用干凈紗布擦干。采精時(shí)，采精員右手持假陰道把柄并靠在右臂肘處，公馬爬跨時(shí)立即站于臺(tái)馬右后側(cè)，左手輔助將陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)，假陰道以30～35°固定于臺(tái)馬尻側(cè)；公馬射精后，將假陰道的集精杯端放低并打開(kāi)活塞放氣，充分排精后，緩慢將假陰道豎起并移開(kāi)，迅速送驗(yàn)。

1.3 采精頻率

成年公馬每周采精不超過(guò)6次，連續(xù)采精不超過(guò)3次；青年公馬每周1～2次。

2 精液品質(zhì)檢查

取下集精杯，用玻璃棒挑除副性腺，用4層無(wú)菌紗布或?qū)Ｓ脼V網(wǎng)過(guò)濾，在37～38℃環(huán)境下進(jìn)行檢查。

2.1 外觀檢查

射精量：用量杯測(cè)量精液量。色澤：正常情況下為淡乳白色或灰白色，帶有淡綠色、淡紅色、黃色、紅褐色等異常顏色的精液應(yīng)廢棄。氣味：新鮮精液略有腥味，氣味異常的應(yīng)廢棄。pH值檢測(cè)：用精密pH試紙或pH計(jì)檢測(cè)，正常精液為弱堿性，一般pH為7.0～7.4。

2.2 顯微鏡檢查

精子活率評(píng)定：檢查時(shí)以滴管或滅菌玻璃棒蘸取1滴精液，放在載玻片上加蓋玻片，在400～ 600倍顯微鏡下觀察，每個(gè)滴片不得少于3個(gè)視野，觀察不同層次內(nèi)的精子運(yùn)動(dòng)情況，求其活力的平均值。顯微鏡載物臺(tái)溫度應(yīng)保持37～38℃。精子活率評(píng)定方法見(jiàn)表1。精子活率<0.3的精液應(yīng)廢棄。

表1 精子活率十級(jí)評(píng)定方法

精子密度檢查：種公馬連續(xù)采精10次應(yīng)測(cè)定1次精子密度。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定法：用白細(xì)胞細(xì)管吸取一定的原精，再吸取3%氯化鈉溶液將原精稀釋10倍，混合均勻后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器在顯微鏡下放大400倍計(jì)數(shù)，計(jì)算每mL精液中的精子數(shù)。目測(cè)評(píng)定法：分“密”“中”“稀”3級(jí)，“密”精子間空隙很小，每mL精液中約有精子數(shù)2億個(gè)；“中”精子間空隙明顯，含精子1～2億個(gè)·mL-1；“稀”精子空隙超過(guò)兩個(gè)精子的長(zhǎng)度，<1億個(gè)·mL-1。

精子畸形率檢查：抽樣檢查精子畸形率。取精液樣本放在載玻片上，按常規(guī)方法制成抹片，風(fēng)干后在顯微鏡下放大400～600倍下檢查200～500個(gè)精子，觀察畸形精子數(shù)，計(jì)算畸形精子的百分率。馬的精子畸形率>15%時(shí)不能用于輸精，應(yīng)廢棄。

存活時(shí)間檢查：應(yīng)經(jīng)常檢查采精種公馬的精子存活時(shí)間。常溫保存：在15～20℃保存，精子存活時(shí)間應(yīng)>48 h。低溫保存：在0～5℃保存，精子存活時(shí)間應(yīng)在2～3 d。

2.3 精液品質(zhì)檢查記錄

精液品質(zhì)檢查記錄表包括配種站名稱、種公馬號(hào)、年齡、品種、毛色特征、采精日期、采精量（mL）、顏色、氣味、pH、密度（億個(gè)·mL-1）、活率、稀釋液種類、稀釋后活力、輸精量、輸精母馬數(shù)、采精員、檢測(cè)員及備注。

3 精液稀釋

原精存放時(shí)間應(yīng)≤20 min，精液品質(zhì)檢查后應(yīng)盡快稀釋。

3.1 稀釋液的配置和準(zhǔn)備

稀釋液可自行配置，也可用專用稀釋液。稀釋液常用配方見(jiàn)表2。

表2 稀釋液常用配方

鮮馬奶要用6層紗布濾入燒瓶?jī)?nèi)，放在水浴鍋內(nèi)煮沸10～15 min后，冷卻除去奶皮（用6層消毒紗布過(guò)濾）。奶粉稀釋液要沸煮滅菌，冷卻后，用6層消毒紗布過(guò)濾除去奶皮。稀釋液用前20 min置于37～38℃水浴鍋中預(yù)熱備用。

3.2 稀釋倍數(shù)

根據(jù)精液密度及活率確定適宜的稀釋倍數(shù)，一般≤4倍。精液稀釋后，精子數(shù)≥5×1010個(gè)·mL-1。

3.3 精液稀釋方法

精液應(yīng)采用等溫稀釋，稀釋液的溫度以精液溫度來(lái)調(diào)節(jié)，二者溫差≤1℃。稀釋時(shí)，將稀釋液沿量杯內(nèi)壁緩慢加入到精液中，并使用玻璃棒混合均勻。

4 馬細(xì)管凍精制作技術(shù)

馬細(xì)管凍精制作的步驟為活力評(píng)定參見(jiàn)精液品質(zhì)檢查，對(duì)達(dá)不到要求的精液廢棄，對(duì)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的繼續(xù)以下操作；鮮精過(guò)濾，將采集達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的馬匹精液用消毒過(guò)的紗布過(guò)濾存于燒杯中；稀釋，稀釋液按照3.1準(zhǔn)備，如果精液較稀，以1?1進(jìn)行稀釋，如果較稠以1?1.5進(jìn)行稀釋；離心，將稀釋后的精液封裝到離心管中，以轉(zhuǎn)速1 500～2 000 r· min-1離心20 min，然后抽取上清廢棄，僅留下層精子，集中以待二次稀釋；二次稀釋，稀釋液由基礎(chǔ)液+保護(hù)液組成，在18～25℃（與精子等溫）等比例稀釋；裝管平衡，將二次稀釋過(guò)的精液在顯微鏡下檢查精子活力，對(duì)活力達(dá)不到要求的廢棄，對(duì)達(dá)標(biāo)的裝入細(xì)管，放入冰箱中2～5℃平衡60 min，讓精子、稀釋液和保護(hù)液充分混合；冷凍，將平衡后的細(xì)管至于零下90～105℃中冷凍3 min，然后至于-140℃冷凍6 min，整個(gè)冷凍過(guò)程控制在9 min以內(nèi)；保存，將細(xì)管精液按照編號(hào)至于液氮罐中，定期檢查細(xì)管精液的損壞和液氮的消耗；解凍最佳溫度為42℃，解凍時(shí)間為8 s。

（新疆塔城地區(qū)畜牧科技研究推廣中心，周軍）