馬殿旭, 劉 剛, 歐全宏, 于海超, 李會(huì)梅，劉 艷

云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院, 云南 昆明 650500

乳菇和紅菇的紅外光譜及其二維相關(guān)紅外光譜的分析與鑒別

馬殿旭, 劉 剛*, 歐全宏, 于海超, 李會(huì)梅，劉 艷

云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院, 云南 昆明 650500

采用傅里葉變換紅外光譜原始譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜以及二維相關(guān)譜的三級(jí)鑒定方法，對(duì)紅菇屬和乳菇屬六種蘑菇進(jìn)行了鑒別分析。六種樣品的原始光譜吸收峰非常相似，主要為蛋白質(zhì)和碳水化合物的吸收組成，但在各樣品吸收峰強(qiáng)度、峰形和峰位上仍有微小差異。對(duì)其進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)分析，在二階導(dǎo)數(shù)譜中，1 800～1 400和1 200～800 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰強(qiáng)度、位置、峰形狀顯示出明顯差異。二維相關(guān)紅外光譜提高了光譜的分辨率； 對(duì)六種蘑菇樣品進(jìn)行二維相關(guān)紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)在1 690～1 420 cm-1范圍內(nèi)，三種乳菇出現(xiàn)了3個(gè)明顯的自動(dòng)峰，另外三種紅菇出現(xiàn)了4個(gè)自動(dòng)峰，而且自動(dòng)峰和交叉峰位置、強(qiáng)度均不同； 在1 110～920 cm-1二維光譜范圍內(nèi)，六種蘑菇的自動(dòng)峰和交叉峰的數(shù)量、位置和強(qiáng)度也都不同； 說明不同樣品中蛋白質(zhì)和糖類化合物的顯著不同。結(jié)果表明： 應(yīng)用紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)譜和二維相關(guān)紅外光譜三級(jí)鑒定的技術(shù)可以快速有效地分析和鑒別辣乳菇、絨白乳菇、香乳菇、稀褶紅菇、變綠紅菇和近似酒紅菇。該多級(jí)鑒定的方法對(duì)于分類鑒別蘑菇是一種快速、準(zhǔn)確、有效的方法。

乳菇屬； 紅菇屬； 蘑菇； 傅里葉變換紅外光譜； 二維相關(guān)紅外光譜

引 言

紅菇科隸屬于真菌系擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)，其有2個(gè)重要的屬，紅菇屬(Russula)和乳菇屬(Lactarius)[1]。紅菇科的種類大多是世界廣布種，分布在溫帶地區(qū)，常生于林中地上，通常與松屬、冷杉屬以及殼斗目等植物形成外生菌根，成為林木生長不可缺少的因子[2]。該科除了許多種類可供食用、或藥食兼用外，有的種類還對(duì)腫瘤具有抑制作用[3]，是篩選、提取抗癌藥物的重要對(duì)象之一，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。選取了紅菇科中的辣乳菇、絨白乳菇、香乳菇、稀褶紅菇、變綠紅菇和近似酒紅菇進(jìn)行研究。

紅菇科菌種類多，其中也包含較多毒蘑菇，因此快速準(zhǔn)確地鑒別菌屬對(duì)自然資源的開發(fā)、利用、保護(hù)和物種多樣性研究等有重要意義。但目前對(duì)該菌屬的鑒別研究更多是通過外觀、形態(tài)和特征來區(qū)分，存在一定的主觀性。而傅里葉變換紅外光譜技術(shù)具有不破壞真菌樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)，能定性或定量的反映出真菌的組成物質(zhì)，具有用量少操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。二維相關(guān)紅外光譜引入了外界微擾，將光譜信號(hào)擴(kuò)展到第二維上以提高光譜分辨率。其在中草藥檢驗(yàn)鑒別、食物品質(zhì)檢測、分子結(jié)構(gòu)變化等的技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)獲得了很好的應(yīng)用： 如Choong等[4]用紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜對(duì)商業(yè)產(chǎn)品靈芝的檢驗(yàn)； Popescu等[5]采用二維相關(guān)紅外光譜對(duì)真菌降解椴木的過程進(jìn)行了研究； Lei等[6]用傅里葉紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜對(duì)奶粉中的結(jié)晶乳糖含量進(jìn)行了分析檢測； Tian等[7]利用二維相關(guān)紅外光譜對(duì)戊二醛鏈接的膠原蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。我們采用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜技術(shù)的指紋鑒定方法對(duì)紅菇科的六種不同蘑菇進(jìn)行鑒別研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與測試條件

紅外光譜儀為Perkin Elmer公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀，裝備DTGS探測器，測定范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次。變溫附件為EUROTHERM 3216型溫控儀，測試溫度范圍50～120 ℃。

1.2 樣品制備和光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

六種野生蘑菇均采自云南大理蒼山。將六種樣品烘干保存待測，實(shí)驗(yàn)時(shí)將樣品放入瑪瑙研缽中磨為細(xì)粉，再加入適量的溴化鉀攪磨均勻，然后壓片待測。使用紅外光譜數(shù)據(jù)處理軟件(OMNIC 8.0)對(duì)所采集的紅外光譜進(jìn)行基線校正、5點(diǎn)平滑、歸一化預(yù)處理，利用 Origin 8.5軟件進(jìn)行原始、二階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)處理。并采用清華大學(xué)分析中心設(shè)計(jì)的二維相關(guān)分析軟件進(jìn)行二維相關(guān)光譜處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 六種乳菇和紅菇的紅外光譜特征

圖1 六種不同乳菇和紅菇的FTIR光譜

2.2 六種乳菇和紅菇的二階導(dǎo)數(shù)光譜特征

六種紅菇和乳菇的原始光譜差異不大，而二階導(dǎo)數(shù)光譜具有更高的分辨率，能夠顯示更多的分子信息[8]。選取1 800～1 400和1 200～800 cm-1范圍的紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理(圖2，圖3)，選用Savitsky-Golay方法。從圖看出它們之間的主要區(qū)別如下： 圖2中六種樣品在1 744，1 650，1 544和1 454 cm-1附近二階導(dǎo)數(shù)譜差異明顯。在1 744 cm-1處香乳菇、稀褶紅菇、變綠紅菇和近似酒紅菇均出現(xiàn)了吸收峰，其中稀褶紅菇和近似酒紅菇吸收強(qiáng)度最強(qiáng)，而辣乳菇和絨白乳菇未出現(xiàn)； 在1 650 cm-1附近絨白乳菇、稀褶紅菇和變綠紅菇出現(xiàn)了兩個(gè)中等強(qiáng)度的吸收峰，而辣乳菇出現(xiàn)三個(gè)微弱的吸收峰，香乳菇和近似酒紅菇均出現(xiàn)一個(gè)相對(duì)強(qiáng)的吸收峰，并且吸收峰的形狀和強(qiáng)度有較大差別，說明它們所含的氨基酸多肽類化合物是不一致的； 1550 cm-1附近香乳菇出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰，其他樣品均出現(xiàn)了一個(gè)明顯的吸收峰； 1 454 cm-1附近樣品的吸收峰峰形和峰強(qiáng)度均有明顯差別，在1 468 cm-1處稀褶紅菇和近似酒紅菇出現(xiàn)了肩峰，而且稀褶紅菇、變綠紅菇和近似酒紅菇的峰形較為相似。

圖2 六種不同乳菇和紅菇1 800～1 400 cm-1內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)光譜

Fig.2 Second derivative infrared spectra of six different species of lactarius and russula mushrooms in 1 800～1 400 cm-1

a: Lactarius piperratus;b: Lactarius vellereus;

c: Lactarius camphoratus;d: Russula nigricans;

e: Russula virescens;f: Russula cf.vinosa

圖3 六種不同乳菇和紅菇1 200～1 800 cm-1內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)光譜

Fig.3 Second derivative infrared spectra of six different species of lactarius and russula mushrooms in 1 200～800 cm-1

a: Lactarius piperratus;b: Lactarius vellereus;

c: Lactarius camphoratus;d: Russula nigricans;

e: Russula virescens;f: Russula cf.vinosa

圖4 六種不同乳菇和紅菇1 420～1 690 cm-1內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

圖5 六種不同乳菇和紅菇1 110～920 cm-1內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

在二階導(dǎo)數(shù)譜1 200～800 cm-1范圍內(nèi)(圖3)，1 085 cm-1吸收峰附近除近似酒紅菇外的樣品均出現(xiàn)了1 095 cm-1的吸收峰。在1 045 cm-1附近香乳菇和近似酒紅菇只出現(xiàn)一個(gè)峰，而其他樣品均出現(xiàn)兩個(gè)峰； 在953 cm-1處香乳菇和變綠紅菇吸收峰相對(duì)較強(qiáng)，辣乳菇和稀褶紅菇吸收峰較弱，而絨白乳菇和近似酒紅菇吸收峰近消失； 890 cm-1處近似酒紅菇的吸收峰最弱，且辣乳菇的吸收峰平移了5個(gè)波數(shù)，在885 cm-1處； 這些差異說明六種樣品本身所含的糖苷類化合物有差異，因此從二階導(dǎo)數(shù)譜圖差異中可以對(duì)紅菇和乳菇進(jìn)行區(qū)分。

2.3 六種乳菇和紅菇的二維相關(guān)紅外光譜特征

二維相關(guān)紅外光譜分析是利用不同的外界微擾，研究體系各組分有關(guān)基團(tuán)分子振動(dòng)行為的差異，簡化含有許多重疊峰的復(fù)雜光譜，闡明官能團(tuán)之間的各種相互作用，從而可獲得一維紅外及其導(dǎo)數(shù)譜所不能獲得的許多信息，提高了圖譜分辨率[8-11]。對(duì)樣品的紅外光譜進(jìn)行二維相關(guān)紅外光譜處理，得到1 420～1 690和920～1 110 cm-1的二維相關(guān)紅外同步光譜如圖4和圖5所示，2D-IR光譜表明： 六種樣品的自動(dòng)峰和交叉峰差異很大。圖中等高線所形成的紅色相關(guān)強(qiáng)度峰為正相關(guān)峰，等高線所形成的藍(lán)色相關(guān)強(qiáng)度峰為負(fù)相關(guān)峰。按照二維相關(guān)光譜理論，同步譜是關(guān)于主對(duì)角線對(duì)稱的譜圖，處于主對(duì)角線位置上的峰，是動(dòng)態(tài)紅外光譜信號(hào)自身相關(guān)而得到，稱為自動(dòng)峰，自動(dòng)峰總是正峰，它們代表了樣品中各化學(xué)基團(tuán)對(duì)熱微擾的敏感程度，對(duì)熱微擾越敏感，自動(dòng)峰強(qiáng)度越強(qiáng)[9]。位于非主對(duì)角線位置處的峰稱為交叉峰，交叉峰的出現(xiàn)說明在官能團(tuán)之間可能存在著分子內(nèi)或分子間的相互作用，表示兩個(gè)相應(yīng)頻率的光譜強(qiáng)度變化的相似性，當(dāng)兩個(gè)獨(dú)立波數(shù)處的動(dòng)態(tài)紅外信號(hào)彼此相關(guān)或者負(fù)相關(guān)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)交叉峰，交叉峰有正峰和負(fù)峰之分，當(dāng)兩個(gè)不同官能團(tuán)在溫度變化過程中振動(dòng)方向一致時(shí)，出現(xiàn)一對(duì)正交叉峰； 如果兩個(gè)不同官能團(tuán)在溫度變化過程中振動(dòng)方向相反，則出現(xiàn)一對(duì)負(fù)交叉峰[10-14]。

圖4為六種紅菇和乳菇在1 420～1 690 cm-1范圍的二維相關(guān)光譜，在辣乳菇、絨白乳菇和香乳菇的二維相關(guān)光譜中出現(xiàn)明顯的3個(gè)自動(dòng)峰，辣乳菇在1 649，1 550和1 468 cm-1處，其中1 649 cm-1的自動(dòng)峰最強(qiáng)； 絨白乳菇和香乳菇出現(xiàn)在1 649，1 556，1 460 cm-1處，其中絨白乳菇在1 649和1 460 cm-1處的自動(dòng)峰最強(qiáng)，而香乳菇最強(qiáng)的自動(dòng)峰在1 460 cm-1處。各自動(dòng)峰之間形成了正交叉峰，其辣乳菇明顯的正交叉峰是(1 468, 1 649 cm-1)和(1 550, 1 649 cm-1)； 而絨白乳菇和香乳菇正交叉峰都在(1 460, 1 649 cm-1)，(1 556, 1 649 cm-1)和(1 460, 1 556 cm-1)處，絨白乳菇交叉峰(1 460, 1 649 cm-1)最強(qiáng)。在稀褶紅菇、變綠紅菇和近似酒紅菇中出現(xiàn)了四個(gè)自動(dòng)峰，分別都在1 649，1 619，1 556和1 460 cm-1處，在稀褶紅菇中1 649和1 556 cm-1自動(dòng)峰最強(qiáng)，1 619 cm-1最弱，變綠紅菇中1 649和1 460 cm-1最強(qiáng)，1 619 cm-1最弱，而近似酒紅菇中最強(qiáng)的自動(dòng)峰出現(xiàn)在1 556 cm-1處，1 460和1 649 cm-1都相對(duì)較弱，1 619 cm-1幾乎消失； 在稀褶紅菇和變綠紅菇中都出現(xiàn)了六個(gè)明顯正交叉峰(1 460, 1 649 cm-1)，(1 460, 1 619 cm-1)，(1 556, 1 649 cm-1)，(1 556, 1 619 cm-1)，(1 460, 1 556 cm-1)和(1 649, 1 619 cm-1)，且強(qiáng)弱存在明顯差異； 而近似酒紅菇中只出現(xiàn)三個(gè)正交叉峰(1 460, 1 649 cm-1)，(1 556, 1 649 cm-1)和(1 460, 1 556 cm-1)，其強(qiáng)度都相對(duì)較弱。因此六種紅菇和乳菇不僅在自動(dòng)峰上的強(qiáng)度存在明顯的差別，而且在交叉峰中正交叉峰的強(qiáng)度、位置都存在顯著的區(qū)別。

在920～1 110 cm-1范圍內(nèi)，如圖5，辣乳菇二維相關(guān)光譜中出現(xiàn)了4個(gè)明顯的自動(dòng)峰，分別是1 080，1 018，948，929 cm-1，其中1 018 cm-1處的自動(dòng)峰最強(qiáng)，948和929 cm-1相對(duì)較弱。絨白乳菇、香乳菇、變綠紅菇和稀褶紅菇均出現(xiàn)3個(gè)自動(dòng)峰，絨白乳菇和稀褶紅菇出現(xiàn)在1 089，1 029，929 cm-1處，其最強(qiáng)自動(dòng)峰均出現(xiàn)在1 089 cm-1處，稀褶紅菇自動(dòng)峰1 029 cm-1明顯強(qiáng)于絨白乳菇； 香乳菇和變綠紅菇則出現(xiàn)在1 089，1 019，929 cm-1處，其自動(dòng)峰1 089 cm-1最強(qiáng)，1 019和929 cm-1次之，但自動(dòng)峰1 019 cm-1變綠紅菇明顯強(qiáng)于香乳菇。近似酒紅菇出現(xiàn)了2個(gè)相對(duì)較強(qiáng)自動(dòng)峰，分別是1 080和1 039 cm-1。各自動(dòng)峰之間相互形成了正交叉峰。但是1 069 cm-1處和各自動(dòng)峰形成負(fù)交叉峰，說明對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是沿著相反方向振動(dòng)變化。由以上分析可知，自動(dòng)峰的位置、數(shù)目、相對(duì)峰強(qiáng)度和交叉峰的正負(fù)均有很大的差異，說明四者的糖苷類基團(tuán)對(duì)溫度的敏感程度是不一致的，進(jìn)一步證明了六種樣品本身所含的糖類化合物的不同。所以根據(jù)樣品自動(dòng)峰的數(shù)目、位置和交叉峰正負(fù)的差異能夠?qū)崿F(xiàn)這六種蘑菇的鑒別。

3 結(jié) 論

利用紅外光譜技術(shù)結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜和二維相關(guān)紅外光譜技術(shù)對(duì)六種乳菇和紅菇樣品進(jìn)行三級(jí)鑒定分析。結(jié)果表明： 六種乳菇和紅菇中主要成分為蛋白質(zhì)和碳水化合物，以碳水化合物居多； 二階導(dǎo)數(shù)譜和二維相關(guān)紅外光譜提高光譜分辨率，使六種樣品的差異更突出，樣品能夠得到準(zhǔn)確鑒別； 并利用此多級(jí)鑒定的方法可對(duì)其中所含有成分進(jìn)行定性和相對(duì)含量分析。而高分辨率的二階導(dǎo)數(shù)譜和二維相關(guān)紅外光譜可以很好地區(qū)分一維紅外光譜較相似的樣品。

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(Received Apr. 10, 2015; accepted Aug. 20, 2015)

*Corresponding author

Discrimination of Lactarius and Russula Mushrooms with FTIR and Two-Dimensional Correlation Infrared Spectroscopy

MA Dian-xu, LIU Gang*, OU Quan-hong, YU Hai-chao, LI Hui-mei, LIU Yan

School of Physics and Electronic Information, Yunnan Normal University, Kunming 650500, China

Tri-step infrared spectroscopy method of Fourier transform infrared spectroscopy, second derivative infrared spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy was firstly used to discriminate six species of mushrooms belonging to the genus Lactarius and Russula. The absorption bands of the original spectrum were very similar, which were composed by protein and polysaccharides, but tiny differences were observed at the position, shape and absorption intensities of peaks. Second derivative infrared spectroscopy technology was applied to study 6 species of the samples, there were obvious differences in the range of 1 800～1 400 and 1 200～800 cm-1. Two-dimensional correlation infrared spectroscopy can improve the resolution of spectra. Therefore two-dimensional correlation infrared spectroscopy was used to study 6 kinds of mushrooms. The results showed that there are three auto-peaks in the Lactarius, four in the Russula and significant differences in the number, intensity of auto-peaks and cross peaks were observed in the range of 1 690～1 420 cm-1. In addition, the peaks quantity, position, intensity of auto-peaks and cross peaks were different in the range of 1 110～920 cm-1. It demonstrates that tri-step infrared spectroscopy technology of Fourier transform infrared spectroscopy, second derivative infrared spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy is a rapid and effective method for discriminating Lactarius and Russula.

Lactarius; Russula; Mushroom; FTIR; Two-dimensional correlation infrared spectroscopy (2D-IR)

2015-04-10，

2015-08-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960179)和云南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持項(xiàng)目資助

馬殿旭, 1991年生, 云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院碩士研究生 e-mail: 465615292@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: gliu66@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)07-2104-07