胡 勇，吳小勇，鐘南京，徐金瑞

廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528458

大豆硒蛋白構象的光譜法研究

胡 勇，吳小勇*，鐘南京，徐金瑞

廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528458

采用熒光光譜、紫外光譜并結合紅外光譜對比研究了大豆硒蛋白和大豆蛋白的結構區(qū)別，并用熒光相圖法分析了脲誘導下兩種蛋白的去折疊過程?？疾炝藴囟取H值對大豆硒蛋白質(zhì)構象的影響，同時對其乳化穩(wěn)定性能進行了測定。結果表明，與大豆分離蛋白相比，大豆硒蛋白分子中的共價二硫鍵受到破壞，分子內(nèi)氫鍵作用減弱，疏水相互作用增強，蛋白質(zhì)分子發(fā)生伸展。大豆硒蛋白在溶液中只呈現(xiàn)“折疊”和“松散”兩種狀態(tài)，與大豆蛋白相比更容易被水解變性。升高溫度，大豆硒蛋白溶液存在明顯熒光熱猝滅效應，疏水性逐漸增強，蛋白質(zhì)分子趨于折疊。在pH值2.8～8.0的范圍內(nèi)，大豆硒蛋白的Trp殘基主要分布于其分子外部的極性環(huán)境中，并隨pH值變化在等電點兩側呈現(xiàn)不同的構象變化。在酸性環(huán)境中大豆硒蛋白較易發(fā)生從松散到折疊的構象轉變，堿性條件則較有利于大豆硒蛋白以松散的結構存在。此外，基于紫外光譜數(shù)據(jù)分析了大豆硒蛋白乳化特性，結果表明降低溫度有利于增強大豆硒蛋白的乳化性能，但使其穩(wěn)定性能下降。

大豆硒蛋白；構象；光譜

引 言

硒是人體必需的微量元素之一，適當?shù)奈a充對于維護人體健康是非常重要的。許多數(shù)據(jù)表明，改善硒的攝入狀況，對居民長遠的健康有益，特別是可以降低居民罹患癌癥的風險[1]。硒在人體及動物體內(nèi)主要以硒蛋白的形式表現(xiàn)生物學功能。大豆硒蛋白是將大豆蛋白與硒元素有機整合到一起的一種新的蛋白質(zhì)資源，硒元素的加入, 進一步增強了其生物學研究價值[2]。與無機硒相比，富硒蛋白吸收利用率高，生物活性強，具有更好的抗癌、抗腫瘤等藥理作用。如大豆硒蛋白可顯著提高抗氧化酶的活性、促進免疫器官發(fā)育、增強免疫調(diào)節(jié)能力、提高機體抵抗力、具有較高的抗腫瘤活性和一定的治療效果[3-4]。

蛋白質(zhì)的生理活性功能取決于蛋白質(zhì)的結構。蛋白質(zhì)分子來源不同，其生理活性功能也必定有所不同。此外，蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生理活性功能不僅取決于該產(chǎn)品的成分、結構形態(tài)，還取決于它與某些成分或所接觸環(huán)境條件的影響[5-6]。但是，迄今為止關于大豆硒蛋白的研究主要集中在其生產(chǎn)制備、生理功能等相關應用方面，而關于大豆硒蛋白構象的研究則甚少。因此，對大豆硒蛋白構象的相關研究很有必要，這對于尋找和改善大豆硒蛋白功能特性的途徑，進一步提高大豆硒蛋白的應用價值，具有重要的理論和實際意義。本工作結合熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜系統(tǒng)研究了大豆蛋白與大豆硒蛋白的結構區(qū)別，同時考察了濃度、溫度、pH值等對大豆硒蛋白構象的影響，并對其乳化穩(wěn)定性能進行了測定，從而為大豆硒蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)制備、生理活性功能評價等相關研究提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

AFS-920雙道原子熒光光度計(北京吉天儀器有限公司)；RF-5301PC型熒光光譜儀(日本島津公司)、TU-1901紫外-可見分光光度計(北京 普析通用)、CU-600電熱恒溫水浴箱(上海 一恒)、AEY-220型電子分析天平(湘儀天平儀器設備有限公司)、pHS-3C型數(shù)顯pH計(雷磁上海精密科學儀器有限公司)、SC-3610型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

大豆硒蛋白粉(購于上海仙普生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉；檸檬酸；氯化鈉；十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

樣品硒含量測定：參照國標GB/T 5009.93-2003食品中硒的測定，采用氫化物原子熒光光譜法。經(jīng)測定，本研究所用的大豆硒蛋白中的硒含量為31.9 μg·g-1。

溶液構象測定：稱取0.10 g大豆硒蛋白粉于燒杯中，加適量蒸餾水，攪拌均勻，加20 mL pH 8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，磁力攪拌器中速攪拌20 h，玻璃棒轉至100 mL容量瓶，蒸餾水定容。低速離心機離心8 min后，取上清液，置于4 ℃下待用。然后，用移液管準確量取大豆硒蛋白上清液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至刻度，混勻后測定吸收光譜或熒光光譜。

乳化特性測定：取25 mL大豆硒蛋白溶液加入250 mL三角錐形瓶中，加入47.5 mL水，0.25 g氯化鈉，混合均勻后，一邊搖勻一邊加入花生油10 mL，加完后，放置搖床振蕩30 min使其分散成均勻的乳化液，靜置待泡沫大部分消除后，觀察乳化效果。然后從乳化層中取出2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.1% SDBS溶液2 mL，混勻定容。以SDBS溶液作為空白，檢測波長500 nm測其吸光值，并記錄室溫下不同時間樣品的吸光值。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

圖1(a)表示激發(fā)光為290 nm時，0.1 g·L-1的大豆分離蛋白和大豆硒蛋白的熒光發(fā)射光譜。由圖1可以看出，大豆蛋白在344 nm有一個明顯的特征熒光峰，來源于大豆蛋白分子中具有長共軛π→π*躍遷的Trp殘基。另外在323 nm有一個相對較弱的熒光峰。通過測試其他不同溶液體系的熒光實驗，發(fā)現(xiàn)在其在323 nm左右都存在一個相對弱峰，這表明位于323 nm的熒光峰可歸因為水分子的拉曼效應[7]。大豆硒蛋白在341 nm 有一個特征熒光峰，另外在323 nm 左右也存在有一個較弱的熒光峰。可見與大豆蛋白相比，大豆硒蛋白色氨酸的熒光發(fā)射峰發(fā)生一定程度的藍移，熒光發(fā)射強度降低。這可能是因為硒元素代替硫元素以硒代半胱氨酸及硒代蛋氨酸的形式進入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，破壞了多肽鏈內(nèi)半胱氨酸殘基之間的共價二硫鍵(S—S)[8]。

圖1 大豆蛋白與大豆硒蛋白熒光光譜圖

2.2 熒光相圖分析

為了明確大豆硒蛋白與大豆蛋白的結構區(qū)別，用熒光相圖法對這兩種蛋白在脲誘導下的去折疊過程進行了分析。選擇熒光發(fā)射光譜斜率最大的兩波長強度Fλ1和Fλ2作圖。因熒光強度是廣延量，兩個變量滿足下列關系式(1)

Fλ1=aFλ2+b

(1)

在蛋白質(zhì)變構過程中，若式(1)為線性，則變構過程為“二態(tài)模型”；若式(1)表現(xiàn)為多條直線，則變構過程符合“多態(tài)模型”[9]。一般地，λ1和λ2只有分別取處于熒光發(fā)射峰兩個斜面上所獲得的熒光相圖才更精確，并能提供更多的結構變化信息。因此，本文的λ1和λ2分別選取320和365 nm。

由圖2(a)可知，在脲誘導大豆硒蛋白構象變化過程中，F(xiàn)λ1和Fλ2變化呈一條顯著直線，表明在所選濃度范圍，脲誘導大豆硒蛋白構象變遷過程符合“二態(tài)模型”，即溶液中大豆硒蛋白只有“折疊”和“松散”兩種狀態(tài)。由圖2(b)可知，脲誘導大豆蛋白去折疊的熒光相圖由兩條直線組成，這表明大豆蛋白的脲變性過程符合“三態(tài)模型”，即該蛋白從天然態(tài)轉變?yōu)椴糠终郫B中間態(tài)，并最終轉變?yōu)槿フ郫B態(tài)。這說明大豆硒蛋白與大豆蛋白在質(zhì)構上有較大的區(qū)別。與大豆蛋白相比，大豆硒蛋白顯然更容易被水解變性。

圖2 脲誘導大豆硒蛋白(a)和大豆蛋白(b)去折疊過程的熒光相圖

Fig.2 Fluorescence phase diagram for the unfolding of soybean selenoprotein (a) and soy protein(b) induced by urea

2.3 紅外光譜

圖3為大豆硒蛋白(a)與大豆蛋白(b)的紅外光譜圖。大豆蛋白的紅外光譜1 800～1 000 cm-1是其指紋圖譜，反映了一些特定基團的振動，其中在1 700～1 600 cm-1是計算其蛋白二級結構的主要譜帶區(qū)域[10]。從圖2中可以看出，在紅外光譜1 700～1 600 cm-1區(qū)域內(nèi)，兩者的曲線幾乎重合，但吸收強度略有差異，這表明大豆蛋白向大豆硒蛋白轉變過程中，其蛋白二級結構發(fā)生了有少許變化。在紅外光譜1 800～1 100 cm-1和2 850～3 037 cm-1區(qū)域內(nèi)，大豆硒蛋白的紅外光譜吸收率明顯比大豆蛋白的弱，同時也有較大的位移，這表明大豆硒蛋白質(zhì)中分子內(nèi)和分子間的氫鍵減弱。此外，與大豆蛋白相比，大豆硒蛋白在1 742 cm-1處紅外吸收峰消失，再次表明硒元素的引入破壞了多肽鏈內(nèi)半胱氨酸殘基之間的共價二硫鍵。

圖3 大豆硒蛋白(a)與大豆蛋白(b)的紅外光譜圖

2.4 紫外光譜

圖4為大豆蛋白和大豆硒蛋白在200～450 nm的紫外光譜。根據(jù)峰的位置，可以將其分成兩個區(qū)域，即200～250 nm的肽鍵吸收峰區(qū)和250～300 nm的芳香氨基酸殘基吸收峰區(qū)[11]。從紫外光譜可看出，大豆蛋白在240 nm有特征吸收峰，大豆硒蛋白在212 nm有特征吸收峰，這表明可歸屬為色氨酸的熒光發(fā)射峰。增加大豆硒蛋白濃度，光譜形狀變化不大，但212 nm附近的吸收峰發(fā)生紅移，吸收峰增強。吸收峰紅移說明大豆硒蛋白分子微環(huán)境的極性發(fā)生改變；吸收強度增加說明大豆硒蛋白分子中的氫鍵作用減弱，螺旋成分降低，肽鏈發(fā)生伸展。此外，當大豆硒蛋白濃度增加時，在280 nm出現(xiàn)新吸收峰，推測其原因是大豆硒蛋白分子發(fā)生伸展后，該區(qū)域的Tyr殘基更多地暴露于微環(huán)境中。

圖4 大豆蛋白(a)與大豆硒蛋白(b: 0.1g·L-1;c: 0.2g·L-1)紫外光譜圖

2.5 pH的影響

圖5顯示激發(fā)光波長為290 nm時，大豆硒蛋白在不同pH值條件下的熒光發(fā)射光譜強度及最大發(fā)射峰位變化圖。由圖5(b)可知，pH值的變化對大豆硒蛋白熒光光譜強度及其最大發(fā)射峰波長都具有明顯的影響。其中，大豆硒蛋白的λmax分布在334～340 nm范圍內(nèi)見圖5(a)。一般情況下，λmax與Trp殘基所處的微環(huán)境有關，λmax小于330 nm說明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中，λmax大于330 nm說明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[12]。由此可推測，大豆硒蛋白在pH2.8～8范圍內(nèi)，其Trp殘基主要分布于大豆硒蛋白分子外部的極性環(huán)境中。pH值從2.8升至4.6時，隨著pH的增加，Trp的熒光強度逐漸增大，至pH值為4.6左右有最大熒光強度，說明此時Trp殘基位于蛋白質(zhì)的表面。此時λmax發(fā)生藍移，表明在此環(huán)境下Trp殘基位于蛋白質(zhì)中較為疏水的區(qū)域。pH值在4.6～7.2范圍時，隨著pH的增加，Trp的熒光強度逐漸減小，而λmax向長波方向移動，表明原來處于結構內(nèi)部非極性環(huán)境中的Trp殘基轉移到蛋白質(zhì)分子外部，其所處微環(huán)境極性增加。當pH值繼續(xù)升至8.0時，OH-離子進攻Trp殘基中亞氨基的氫，破壞了吲哚環(huán)的共軛性，增加了π→π*躍遷的能量，使大豆硒蛋白λmax再次發(fā)生藍移。從光譜變化趨勢看，在酸性環(huán)境中時，大豆硒蛋白的二級結構不穩(wěn)定，較易發(fā)生從松散到折疊的構象轉變。相對而言，堿性條件則較有利于大豆硒蛋白以松散的結構存在。

圖5 pH值對大豆硒蛋白熒光光譜的影響

2.6 溫度的影響

配制一定濃度大豆硒蛋白溶液，水浴加熱，溫度從20 ℃逐漸升至50 ℃。每隔5 ℃測定體系熒光譜。圖6為溫度對大豆硒蛋白溶液熒光光譜強度的影響。由圖6可以看出，隨著溫度升高，大豆硒蛋白最大熒光發(fā)射峰波長發(fā)生一定的藍移，同時體系熒光強度逐漸降低，且明顯不呈線性關系。這表明隨者溫度升高，大豆硒蛋白溶液不僅存在明顯熒光熱猝滅效應，而且體系的疏水性也逐漸增強，大豆硒蛋白分子趨于折疊。由此推測，溫度升高，熱運動使得大豆硒蛋白疏水核能更多地進入水相，從而使其Trp殘基分子鏈的構象在一定程度上發(fā)生了轉變。

此外，通過使用Origin7.5軟件, 對圖6(a)中數(shù)據(jù)作了擬合。如圖6(b)所示, 得到了大豆硒蛋白最大峰值強度隨溫度變化的擬合曲線。擬合公式為y=589.26-34.58x+1.09x2-0.01x3，其相關系數(shù)r=0.975。

圖6 溫度對大豆硒蛋白熒光光譜(a)及熒光強度(b)的影響

Fig.6 The influence of temperature on the fluorescence spectra (a) and intensity (b) of soybean selenoprotein Curve 1→7, 20, 25,30, 35, 40, 45, 50 (℃)

2.7 乳化特性測定

圖7為20和30 ℃大豆硒蛋白乳化溶液隨時間的變化關系圖。從圖7可以看出，隨著放置時間的延長，大豆硒蛋白乳化溶液的吸光度逐步增強，并且出現(xiàn)明顯轉折點。這表明大豆硒蛋白雖然有一定的乳化性, 但隨著時間的延長，體系中水和油開始慢慢分離出來而失去穩(wěn)定性，其后大豆硒蛋白溶液分子鏈發(fā)生線團-雙螺旋鏈構象轉變而聚集成為凝膠。從圖7中還可看出，溫度較低時，大豆硒蛋白乳化溶液吸光度較低，且出現(xiàn)破乳的時間較早。這表明低溫時大豆硒蛋白乳化性增強，但其穩(wěn)定性下降。

圖7 不同溫度下大豆硒蛋白吸光度隨時間的變化(T1>T2)

3 結 論

大豆硒蛋白與大豆蛋白相比，其分子構象有一定的差異。大豆硒蛋白分子中的氫鍵作用減弱，螺旋成分降低，蛋白質(zhì)分子發(fā)生伸展。在水溶液中, 環(huán)境的酸堿度對大豆硒蛋白的結構有著較大的影響。強酸條件下，H+對大豆硒蛋白的氫鍵和肽鍵均有一定的干擾作用，且會影響大豆硒蛋白Trp殘基酚羥基的電離。相對而言, 堿性條件則更有利大豆硒蛋白結構的穩(wěn)定存在。升高溫度，大豆硒蛋白分子內(nèi)的氫鍵作用破壞，大豆硒蛋白分子趨于折疊，溶液疏水性增強。通過熒光數(shù)據(jù)擬合，得到了熒光強度隨溫度的變化關系。此外，一定條件下大豆硒蛋白乳化性與其穩(wěn)定性呈現(xiàn)負相關。

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(Received May 13, 2015; accepted Sep.18, 2015)

*Corresponding author

Study on the Conformation of Soybean Selenoprotein Solution with Spectroscopy Methods

HU Yong, WU Xiao-yong*, ZHONG Nan-jing, XU Jin-rui

School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China

The structure characteristic of soybean selenoprotein and soy protein isolate (SPI) were investigated with fluorescence, ultraviolet and Fourier transform infrared (FTIR) spectrum.The unfolding process of two proteins was analyzed with fluorescence phase diagram method.The stability of emulsion properties and the influence of concentration, temperature and pH on the conformation of soy selenoproteins were also determined.The results indicated that the covalent disulfide bond of soybean selenoprotein molecules was damaged; the hydrogen bonding become weak; the hydrophobic interactions were enhanced and the protein chain molecules were extended.Soybean selenoprotein displayed only “folding” and “l(fā)oose” state in solution, which illustrated soybean selenoprotein more tend to hydrolysis when compared with soybean protein.With temperature increasing, the fluorescence quenching effect occurred and the hydrophobicity of soy selenoproteins was also gradually increased, which reflected the protein molecules tends to be folded.In the range of pH 2.8～8.0, the Trp residue of soybean selenoprotein was mainly distributed in the polarity of the external environment and presented different conformational change on both sides of the isoelectric point under different pH value.In acidic environment, the soybean selenoprotein was easy to appear conformational transition from loose to fold.But it was conducive for soybean selenoprotein to existence in loose structure in alkaline conditions.In addition, the emulsifying properties of soybean selenoprotein were analyzed based on UV spectral data.Results showed that lower temperature helps to enhancement the emulsification but unfavorable the stability of the soybean selenoprotein.

Soybean selenoprotein; Conformation; Spectroscopy

2015-05-13，

2015-09-18

國家自然科學基金項目(31401521)資助

胡 勇, 1977年生，廣東藥科大學食品科學學院講師 e-mail: lidhyong@126.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: perryfe@163.com

S132

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2874-05