王海波，劉延軍，陳樹偉，武文龍，李鳳臣

(解放軍第107醫(yī)院 胃腸外科，山東 煙臺 264002)

β-catenin在胃癌中的表達(dá)及其機(jī)制

王海波Δ，劉延軍，陳樹偉，武文龍，李鳳臣

(解放軍第107醫(yī)院 胃腸外科，山東 煙臺 264002)

目的 探討Wnt信號通路中心調(diào)控分子β-catenin在胃癌中的表達(dá)及其在胃癌發(fā)病中的作用機(jī)制。方法 利用shRNA病毒沉默BGC-823胃癌細(xì)胞株中的β-catenin的表達(dá)，利用空載病毒感染細(xì)胞株作為對照組，實(shí)時熒光定量PCR及Western blot檢測病毒沉默效果，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株注入裸鼠頸部構(gòu)建裸鼠胃癌模型，每周檢測2組裸鼠皮下腫瘤生長情況并測量記錄皮下瘤塊直徑。成瘤裸鼠模型飼養(yǎng)8w后分離完整皮下瘤塊，統(tǒng)計瘤塊數(shù)量及瘤塊重量。Western blot檢測2組裸鼠皮下瘤塊中Wnt信號通路相關(guān)分子DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)變化。結(jié)果 β-catenin沉默后的BGC-823胃癌細(xì)胞株注射裸鼠，其皮下瘤塊的數(shù)量、直徑以及重量均較對照空載病毒轉(zhuǎn)染的BGC-823胃癌細(xì)胞株注射的裸鼠少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且β-catenin沉默組裸鼠，其瘤塊中DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)水平較對照組裸鼠顯著降低(P<0.05)。 結(jié)論 β-catenin通過上調(diào)DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，因此β-catenin在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其可能作為評估胃癌預(yù)后的診斷指標(biāo)。

β-catenin；胃癌；Wnt信號通路；BGC-823胃癌細(xì)胞株

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，尤其是在廣大的農(nóng)村地區(qū)，由于飲食衛(wèi)生等因素的影響，胃癌全球每年新發(fā)病例已增至150萬[1- 2]。雖然流行病學(xué)調(diào)查顯示胃癌的發(fā)病和感染幽門螺桿菌[3-4]、霉菌毒素[5]和亞硝酸鹽的攝入量、吸煙等因素有關(guān)[6-8]，但由于胃癌的病因較復(fù)雜，因此目前胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。同時由于胃癌早期無明顯癥狀，周圍血液供應(yīng)以及淋巴分布豐富，導(dǎo)致胃癌較容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這些綜合導(dǎo)致其預(yù)后差，病死率高[9]。因此，探究胃癌的發(fā)病機(jī)制以及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)機(jī)制，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是胃癌研究的重點(diǎn)[9-10]。Wnt信號通路下游核心分子β-catenin在眾多腫瘤的發(fā)病以及癌細(xì)胞的增殖侵襲轉(zhuǎn)移中具有一定的促進(jìn)作用[11]，如結(jié)直腸癌[12]，乳腺癌以及肝癌[13]，因此Wnt信號通路下游核心分子β-catenin成為許多腫瘤化療藥物的靶位點(diǎn)[14-15]。但是對于β-catenin在胃癌中的作用目前尚不可知，本研究旨在探究β-catenin在胃癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基和TRIzol購自Thermo公司；G418、青霉素、鏈霉素、Trypsin-EDTA購自上海煊翎有限公司；胎牛血清、DKK1抗體、c-myc抗體、CyclinD1抗體以及actin抗體購自上海銀海圣生物科技有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；實(shí)時熒光定量PCR熒光染料SYBR Green Supermix購自美國BIO-RAD公司；β-catenin、actin實(shí)時熒光定量PCR引物均由上海杰李公司合成，引物序列如下：β-catenin Forward：ACTTGCACTCCTGCTAGCATGCT；β-catenin Reverse：ACCCTGTGAACCTGTACTGACCT；actin Forward：ACTCACTGG-CAACCTGTACTGC；actin Reverse：TGACCTGTGAAATGTCTGT-GGAC。

β-catenin shRNA病毒購自Ambion公司，且經(jīng)上海生工公司測序鑒定。BGC-823胃癌細(xì)胞株購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞研究所。8周齡Balb/c雄性裸鼠12只(合格證號：滬動 20160382 284952)購買于南京模式動物醫(yī)學(xué)中心。

1.2 方法 2014年1月～2015年1月在解放軍第107醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成本研究。

1.2.1 BGC-823胃癌細(xì)胞株培養(yǎng)：BGC-823胃癌細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，DMEM培養(yǎng)基中添加有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞密度約70%時用Trypsin-EDTA消化2 mins左右以1:3比例傳代。

1.2.2 沉默BGC-823胃癌細(xì)胞株中β-catenin的表達(dá)：純化并測量β-catenin shRNA病毒濃度，計算病毒的使用量(加入的病毒量范圍在 MOI=35)，感染實(shí)驗(yàn)分為2組，一組是直接添加β-catenin shRNA病毒作為實(shí)驗(yàn)組，一組添加等滴度的對照病毒載體作為對照組，感染6h后換液。

1.2.3 檢測病毒沉默效果及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選：轉(zhuǎn)染24 h后，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，分別進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR及Western blot(灰度值采用Image J計算，n=3)檢測β-catenin干擾情況。用含有篩選濃度G418(500 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)感染后細(xì)胞約2 w，并利用稀釋法挑選穩(wěn)定低表達(dá)β-catenin的單克隆細(xì)胞株，將單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)于含有300 mg/L G418的DMEM培養(yǎng)基中，擴(kuò)增穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.2.4 MTT法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株體外增殖能力：將2株穩(wěn)轉(zhuǎn)株接種于96孔板中，,每孔2×103個細(xì)胞，分別于細(xì)胞培養(yǎng)的12、24、48、72 h加20 μL用PBS配制5 mg/mL MTT溶液(上海煊翎有限公司，貨號M0793)，避光繼續(xù)孵育4 h后每孔加入100 μL DMSO充分溶解結(jié)晶物，在酶聯(lián)免疫檢測儀(深圳雷杜, Multiskan MK3)570 nm處測量各孔的吸光值，計算細(xì)胞相對數(shù)量的變化。

1.2.5 裸鼠的飼養(yǎng)及裸鼠胃癌模型的構(gòu)建：裸鼠飼養(yǎng)于SPF級層流室中，溫度為28 ℃，相對濕度應(yīng)保持在40%～60%，每小時需要通風(fēng)換氣約15次，每日維持10 h光照，12 h明暗周期。取擴(kuò)增后的穩(wěn)轉(zhuǎn)株以及對照細(xì)胞株，將2珠細(xì)胞制作成108/mL的單細(xì)胞懸液，每只裸鼠1 mL皮下注射，每組6只，每周觀察裸鼠皮下成瘤情況記錄。

1.2.6 檢測2組裸鼠皮下腫瘤生長情況并記錄：使用游標(biāo)卡尺(上海首豐精密儀器有限公司，型號573-10)每周檢測2組裸鼠皮下腫瘤生長情況并測量記錄皮下瘤塊的直徑，連續(xù)監(jiān)測8 w，8 w后麻醉(4%水合氯醛，0.1 mL/20 g，腹腔注射)裸鼠，分離完整皮下瘤塊，統(tǒng)計瘤塊數(shù)量并使用精密天平(上海馳唐精密儀器，型號FA2204S)稱量瘤塊重量。將取下的皮下瘤塊凍于-80 ℃，以備后續(xù)的檢測。

1.2.7 Western blot檢測2組裸鼠皮下瘤塊中Wnt信號通路相關(guān)分子的表達(dá)：將取下的皮下瘤塊用組織研磨機(jī)磨碎，提取瘤塊總蛋白，然后BCA法測量蛋白濃度，蛋白樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、膠片的壓片檢測、凝膠圖象分析瘤塊中DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 BGC-823胃癌細(xì)胞株中β-catenin的沉默效果 為了鑒定siRNA慢病毒的沉默效果，利用Real-time PCR和Western blot分別檢測BGC-823胃癌細(xì)胞株中β-catenin的表達(dá)，圖1顯示沉默組較對照組mRNA以及蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，這表明siRNA慢病毒沉默β-catenin表達(dá)效果顯著。見圖1。

圖1 BGC-823胃癌細(xì)胞株中β-catenin的沉默效果*P<0.05，與對照組相比Fig.1 The silence effect of β-catenino in BGC-823gastric *P<0.05，compared with control group

2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 為檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株體外增殖能力，利用 MTT法探究2組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株細(xì)胞存活率變化，發(fā)現(xiàn)在沉默60 h后2組的細(xì)胞存活率存在明顯差異，在570 nm處對照組和沉默組的吸光度分別為(0.19±0.02) vs(0.09±0.03)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這表明β-catenin可能參與細(xì)胞增殖的調(diào)控。見圖2。

圖2 2組穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞增殖能力檢測±s)*P<0.05，與對照組相比Fig.2 The proliferation ability of the two stabilizing expression *P<0.05，compared with control group

2.3 裸鼠皮下腫瘤生長變化 裸鼠皮下腫瘤生長情況每周檢測2組裸鼠皮下腫瘤生長情況，其中對照組小鼠即轉(zhuǎn)染空載體病毒的BGC-823胃癌細(xì)胞株注射小鼠，4 w后其腋下成瘤率為100%(8/8)，實(shí)驗(yàn)組小鼠即轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒的BGC-823胃癌細(xì)胞株注射小鼠，其成瘤率為25%(2/8)，連續(xù)檢測8 w并記錄皮下瘤塊的直徑，如圖3所示，對照組小鼠皮下腫瘤塊直徑大于沉默組小鼠腫瘤塊直徑，于荷瘤第6 w 2組間差異顯著增加[(1.22±0.91)vs (0.67±0.07)cm]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這表明對照組小鼠腫瘤塊的生長速度明顯快于實(shí)驗(yàn)組小鼠，這提示β-catenin可能對胃癌腫瘤的生長具有一定的促進(jìn)作用。

圖3 裸鼠胃癌腫瘤模型皮下腫瘤體積±s)*P<0.05，與對照組相比Fig.3 The tumor volume of subcutaneous tumor in stomach tumor model of*P<0.05，compared with control group

2.4 2組裸鼠腫瘤模型瘤塊的生長結(jié)果 計數(shù)每只小鼠取下的皮下瘤塊并于微量電子秤中稱量，記錄并統(tǒng)計2組小鼠腫瘤塊的數(shù)量和質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠瘤塊數(shù)(3.25±0.75)個/只，而沉默組小鼠瘤塊數(shù)(0.76±0.34)個/只，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對比2組瘤塊的重量可發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠瘤塊重約(12.25±1.29) mg/只，而沉默組小鼠瘤重約(4.19±0.86)mg/只，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這進(jìn)一步表明β-catenin對胃癌腫瘤的生長具有一定的促進(jìn)作用。

2.5 Western blot檢測2組裸鼠皮下瘤塊中Wnt信號通路相關(guān)分子的表達(dá)將取下的皮下瘤塊提取總蛋白，Western blot檢測2組裸鼠皮下瘤塊中Wnt信號通路相關(guān)分子DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)變化。如圖4所示，β-catenin沉默后不僅胃癌瘤塊數(shù)量和重量下降，瘤塊直徑較小，而且瘤塊中DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)均較對照組小鼠瘤塊的相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.381±0.021 vs 0.913±0.011), (0.323±0.014vs 1.001±0.017)，(0.425±0.034 vs 0.981±0.026),2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 β-catenin對胃癌瘤塊組織中DKK1、c-myc 和CyclinD1表達(dá)的影響*P<0.05，與對照組相比Fig.4 Effect of β-catenin on protein levels of DKK1, c-myc and CyclinD1*P<0.05，compared with control group

3 討論

胃癌影響患者的飲食，導(dǎo)致患者消瘦以及免疫力下降，成為治療的難點(diǎn)之一[16]，雖然目前手術(shù)治療仍為胃癌治療的主要措施，但是由于術(shù)后眾多的并發(fā)癥如出血、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等[17-18]，尋找積極有效的胃癌治療靶分子勢在必行，亦成為研究的熱點(diǎn)[19]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的胃癌治療靶位點(diǎn)有miRNA-301a，VEGF受體，PTEN等[20]。在許多癌癥組織基因的表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的重要負(fù)性調(diào)控因子AXIN多發(fā)生缺失突變，Wnt信號通路的異常激活，如Wnt信號通路在結(jié)腸癌中異常激活促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)。但是目前對于胃癌組織中異常激活的Wnt信號通路其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，因此本課題組探究 Wnt信號通路與胃癌的機(jī)制關(guān)聯(lián)。

Wnt信號通路是以啟動這一信號通路的Wnt蛋白命名的，其包括經(jīng)典的 Wnt 信號通路即Wnt-β-catenin通路和非經(jīng)典的 Wnt 通路即Wnt-Ca2+或Wnt-NK 通路。激活的Wnt蛋白結(jié)合結(jié)合細(xì)胞受體激活胞內(nèi)一系列蛋白，其中下游較為核心的蛋白為β-catenin包括由140個氨基酸組成的N端結(jié)構(gòu)域和反式激活域的C端結(jié)構(gòu)域。在胞漿中β-catenin與細(xì)胞骨架蛋白不斷結(jié)合與解離，通過調(diào)控細(xì)胞骨架介導(dǎo)細(xì)胞的遷移，這在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中具有一定的促進(jìn)作用[21]。作為轉(zhuǎn)錄因子，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚積并轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，與淋巴樣增強(qiáng)結(jié)合因子(lymphoid enhancer-binding factor 1, LEF1)、c-myc以及cyclinD1基因啟動子區(qū)域結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子Tcf/LEF家族，上調(diào)c-myc和cyclin D1基因的表達(dá)[22]，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲[23]。此外β-catenin還參與上皮細(xì)胞間質(zhì)化[24]以及細(xì)胞的氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞的異型性[25]。它扮演著一個重要的調(diào)控細(xì)胞的粘附、遷移、變形以及細(xì)胞增殖、分化等過程的核心分子[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白沉默后的BGC-823胃癌細(xì)胞株注射的裸鼠，其皮下瘤塊的數(shù)量、直徑以及重量均較對照空載體病毒感染的BGC-823胃癌細(xì)胞株注射的裸鼠少(P<0.05)，這表明β-catenin在胃癌細(xì)胞毒增殖、胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，且在β-catenin沉默組裸鼠的瘤塊組織中DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)水平較對照組裸鼠顯著降低(P<0.05)，這表明β-catenin可上調(diào)DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，因此β-catenin作為一個癌基因，其可能在胃癌預(yù)后的評估診斷中具有重要價值。

綜上所述，胃癌組織中異常激活的Wnt信號通路促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)移，β-catenin通過上調(diào)DKK1、c-myc、CyclinD1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，因此β-catenin在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其可能作為評估胃癌預(yù)后的診斷指標(biāo)，在胃癌的診療中具有重要的臨床價值。

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(編校：王儼儼)

Expression of β-catenin in gastric cancer and its mechanism

WANG Hai-boΔ, LIU Yan-jun, CHEN Shu-wei, WU Wen-long, LI Feng-chen

(Department of Gastrointestinal Surgery, No.107 Hospital of PLA, Yantai 264002, China)

ObjectiveTo study the expression of β - catenin, key molecular of Wnt signaling pathway in gastric cancer and its mechnism.MethodsUsing shRNA virus to silence the expression of β - catenin in BGC - 823 gastric cancer cell lines and using virus without shRNA as the control group.The silence effect of shRNA virus were detected by real-time quantitative flouorescence PCR and Western blot,then transfected into nude mice to construct gastric cancer nude mice model.The subcutaneous tumor growth situation(measure tumor diameter) were detected in two groups of nude mice model every week.After 8 weeks number and weight of subcutaneous tumor were recorded.The DKK1, c-myc and CyclinD1 related to Wnt signaling pathways in subcutaneous tumor in two groups of nude mice were detected by Western blot.ResultsAfter silence of β-catenin in BGC - 823 gastric cancer cell lines, the number, diameter and weight of the subcutaneous tumor block in β-catenin were less than empty carrier control group, with statistically significant difference(P<0.05).The expression of DKK1, c - myc, CyclinD1 levels significantly reduced in β-catenin silent group of nude mice than control group (P<0.05).Conclusionβ-catenin upregulates the expressions of DKK1, c - myc, CyclinD1 to promote gastric cancer cell proliferation, hence β - catenin plays an important role in the process of gastric cancer and it may be valuable diagnosis index in the prognosis of gastric cancer.

β-catenin; gastric cancer; Wnt signaling pathway; BGC-823 gastric cancer cell lines

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.10

王海波，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：胃腸疾病，wang13145362398@163.com。

R735.2

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