王亞，孟雅坤，陳偉蛟，李東輝Δ

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.解放軍第302醫(yī)院，北京 100039)

姜黃對(duì)大鼠脂肪性肝炎的影響及其對(duì)PPAR-γ及IL-6、HMGB1關(guān)系的研究

王亞1，孟雅坤2，陳偉蛟2，李東輝1Δ

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.解放軍第302醫(yī)院，北京 100039)

目的 研究姜黃提取物對(duì)高脂飲食和CCL4聯(lián)合致大鼠脂肪性肝炎治療作用及初步機(jī)制研究。方法 60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、陽性藥組、姜黃低劑量組、中劑量組和高劑量組，模型組飼喂高脂飼料，并且腹腔注射CCL4(oil:CCL4=50:50)；治療組分別給予姜黃提取物低劑量50 mg/kg，中劑量100 mg/kg，高劑量200 mg/kg，陽性藥組給予復(fù)方蛋氨酸膽堿片(東寶肝泰)162 mg/kg。給藥6周后取動(dòng)物血清，酶標(biāo)儀法檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，膽固醇(TC)，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)及肝組織中羥脯氨酸(Hyp)；部分肝組織石蠟包埋后做HE、Masson染色，顯微鏡下觀察肝組織病理切片；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)白細(xì)胞介素6(IL-6)，高遷移率族蛋白1(HMGB1)；RT-PCR檢測(cè)PPAR-γ，做組織PPAR-γ免疫組化病理檢查。結(jié)果 治療組與模型組相比，ALT，AST，Hyp，IL-6，HMGB1水平顯著降低(P<0.05)，PPAR-γ表達(dá)增加。結(jié)論 姜黃提取物可治療由高脂飲食聯(lián)合CCL4致大鼠脂肪性肝炎，治療作用機(jī)制主要可能是通過調(diào)控PPAR-γ信號(hào)通路，促進(jìn)脂質(zhì)代謝；另一方面通過降低IL-6、HMGB1的表達(dá)來減輕炎癥，緩解肝纖維化，從而治療非酒精性脂肪性肝炎。

姜黃提取物；高脂飲食聯(lián)合CCL4；非酒精性脂肪性肝炎；PPAR-γ

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)目前已成為全球范圍內(nèi)最常見的慢性疾病之一，NAFLD會(huì)逐漸發(fā)展為脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH[1])，肝纖維化，肝硬化甚至肝癌，由此可見脂肪性肝炎是疾病發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，故及早的阻斷和治療是防治上述疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。姜科植物姜黃自古以來被藥食兩用，既安全無毒，其病理作用又廣泛。近年來有報(bào)道有降血脂，抗氧化，抗炎，抗腫瘤等作用[2-4]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome prolferator-activated receptor，PPARs)是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核內(nèi)受體，有相關(guān)報(bào)道提示PPAR-γ[5]可由多種脂肪酸及其衍生物激活，在脂肪細(xì)胞分化、糖和脂代謝、胰島素抵抗、炎性反應(yīng)中起重要作用。另一方面，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)在心腦血管、肺臟和肝臟的非感染性炎癥等研究中也尤為關(guān)鍵[6-7]。其中TLR4在肝炎乃至肝纖維化中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。在肝臟中，庫普弗細(xì)胞(kupffer cell)細(xì)胞和星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)都能產(chǎn)生TLR4[8]，同時(shí)TLR4與其高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)[9]識(shí)別后，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，產(chǎn)生大量炎癥因子(interleukin-6，IL-6)等引起炎癥反應(yīng)，促進(jìn)HSC活化，引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終造成脂肪性肝炎從而導(dǎo)致肝纖維化[10]。故本文從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度，以高脂飲食聯(lián)合CCL4誘導(dǎo)大鼠NASH模型[11]，以姜黃提取物進(jìn)行干預(yù)，通過分析PPAR-γ表達(dá)量和HMGB1，IL-6等指標(biāo)進(jìn)一步考察姜黃提取物治療高脂聯(lián)合CCL4致大鼠NASH的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(180±20)g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK-(軍) 2007-004]。飼養(yǎng)于解放軍302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(軍)2002-00500]，自由飲水進(jìn)食，室內(nèi)溫度25 ℃±2 ℃，濕度為60%～80%，12 h照明，12 h黑暗，定期消毒。

1.1.2 藥品與試劑：姜黃提取物(北京綠野藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150117)；東寶甘泰(復(fù)方蛋氨酸膽堿片)[12](吉林精優(yōu)長白山藥業(yè)有限公司，批號(hào)20140203)；四氯化碳(分析純)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130820)；橄欖油(化學(xué)純)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130903；戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號(hào)：57-33-1)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、羥脯氨酸(Hyp)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總RNA抽提取劑Trizol(Ambion); DEPC水(Solarbio)；k1622試劑盒(Thermo Fisher scientific)；sybr green 試劑盒(Applied Biosystems)；氯仿，無水乙醇，異丙醇(北京化工廠)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：SynergyH2全功能微孔板檢測(cè)儀(美國BioTek)；PL602-L電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)； NikonE200光學(xué)顯微鏡(日本尼康)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；愛華 KPJ-1A生物組織攤片烤片機(jī)(天津天利航空有限公司)；DFT-50g手提式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，紫外分光光度計(jì)UV2201(日本島津)；Image J軟件(NIH，美國)。

1.2 方法

1.2.1 造模與樣本采集：大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：正常組、模型組、陽性藥組、姜黃提取物低劑量組(50 mg/kg)，中劑量組(100 mg/kg)以及高劑量組(200 mg/kg),與0.5%羧甲基纖維素鈉混懸后以1 mL/100 g灌胃。正常組給予橄欖油，其他5組腹腔注射CCl4和橄欖油配制的油劑(CCl4:olive oil=50:50)， 2 mL/kg，每周2次，8周后，各組開始按劑量灌胃，每天1次，連續(xù)給藥6周。給藥結(jié)束后，大鼠下腔靜脈取血，進(jìn)行生化指標(biāo)檢查，取大鼠肝臟組織做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，取左葉相同部位制備病理切片。

1.2.2 觀察指標(biāo)：血清ALT，AST，TG，TC，HDL，LDL，IL-6，HMGB1的測(cè)定，及肝組織Hyp的測(cè)定按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。大鼠肝組織4%多聚甲醛固定，石蠟脫水包埋，常規(guī)HE，Masson染色。

1.2.3 RT-PCR測(cè)定PPAR-γ：按Trizol試劑盒提純化操作方法提取肝臟組織總RNA。提取的RNA通過紫外光分光光度計(jì)測(cè)定260，280 nm 的吸光度A，計(jì)算RNA純度和濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL:sybr green預(yù)混液10 μL，PPAR-γ上、下游引物各1μL，cDNA模板4 μL，DEPC水4 μL。使用GAPDH作為內(nèi)參照。引物序列由上海英濰捷基公司提供: PPAR-γ上游5’-GATGACCACTCCCATTCCTTT-3’，下游5’-AAACCTGATGGCATTGTGAGA-3’；內(nèi)參GAPDH上游5’-GGCA-AGTTCAATGGCACAGT-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGA-CTC-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性10 min，95 ℃;變性15 s，95 ℃;退火溫度為60 ℃，退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化指標(biāo)比較 模型組ALT，AST，Hyp的含量較正常組顯著升高(P<0.05)；各治療組與模型組比，ALT，AST，Hyp的含量顯著降低(P<0.05)，且姜黃提取物組與陽性藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明治療效果較好。見表1。

Tab.1 Effects of TE on expression of fibrosis indexes on nonalcoholic steatohepatitis

組別 劑量(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)Hyp(mg/kg)正常組—32 29±0 76130 91±14 450 17±0 05模型組—76 25±8 92??281 56±63 41??0 40±0 06??陽性藥組16241 45±10 11Δ147 64±30 83Δ0 31±0 05Δ低劑量組5040 44±10 61Δ141 80±14 54Δ0 32±0 14Δ中劑量組10038 11±5 56Δ134 64±14 92Δ0 30±0 06Δ高劑量組20037 00±4 88Δ114 22±12 52Δ0 28±0 06Δ

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.2 血清脂質(zhì)指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組TC，TG，HDL，LDL的含量顯著升高(P<0.05)，各治療組與模型組比，TC，TG，LDL降低，HDL升高(P<0.05)，且姜黃提取物組與陽性藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各治療組治療效果較好。

表2 姜黃提取物對(duì)脂肪性肝炎大鼠(高脂+CCL4)血脂水平的影響

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.3 肝組織病理學(xué)變化 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤和脂肪變。模型組纖維條索狀物增生增多，肝小葉紊亂，肝細(xì)胞腫脹且伴有嚴(yán)重的空泡變性，并且匯管區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞部分灶狀壞死。其他給藥組脂肪變程度和炎癥表達(dá)都有不同程度的緩解和下降。見圖1。

圖1 高脂飲食聯(lián)合CCl4脂肪性肝炎模型給藥6周后對(duì)肝組織的影響(HE染色，×200)A：正常組；B：模型組；C：陽性藥組；D：姜黃提取物低劑量組； E. 姜黃提取物中劑量組；F：姜黃提取物高劑量組Fig.1 Effects of nonalcoholic steatohepatitis rats(HFD+CCL4) model of liver tissue after the treatment for 6 weeks on rats (HE staining,×200)A:Normal group; B: Model group; C:Positive group; D:50 mg/kg TE group; E:100 mg/kg TE group;F:200 mg/kg TE group

正常組只在血管周圍可見藍(lán)色膠原纖維。模型組由匯管區(qū)伸出較粗大的膠原纖維條索分割包繞，細(xì)胞索排列紊亂，纖維間隔增厚，假小葉形成，間質(zhì)內(nèi)均可見較明顯的炎性細(xì)胞浸潤。其他給藥組脂肪變程度，肝小葉內(nèi)、肝小葉間膠原纖維間隔減少、變細(xì)，假小葉形成明顯減少。中，高劑量效果優(yōu)于低劑量。見圖2。

圖2 高脂飲食聯(lián)合CCl4脂肪性肝炎模型給藥6周后對(duì)肝組織的影響(Masson染色，×200)A：正常組；B：模型組；C：陽性藥組；D：姜黃提取物低劑量組；E. 姜黃提取物中劑量組；F：姜黃提取物高劑量組Fig.2 Effects of nonalcoholic steatohepatitis rats(HFD+CCL4) model of liver tissue after the treatment for 6 weeks on rats (Masson staining,×200)A:Normal group; B: Model group; C:Positive group; D:50 mg/kg TE group; E:100 mg/kg TE group;F:200 mg/kg TE group

通過Image J軟件進(jìn)行半定量分析。每組選取6個(gè)大鼠的Masson染色切片進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，通過分析視野中染色區(qū)域占總區(qū)域的百分比來評(píng)價(jià)纖維化程度。結(jié)果顯示：模型組與正常組相比膠原面積顯著增加，治療給藥組可抑制纖維的增加，中劑量和高劑量抑制纖維的增加比低劑量顯著。中，高劑量效果優(yōu)于低劑量。見表3。

表3 高脂飲食聯(lián)合CCl4脂肪性肝炎模型給藥6周后對(duì)masson染色后膠原面積的影響±s,n=10)

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.4 大鼠血清IL-6，HMGB1的比較 與正常組相比，模型組IL-6，HMGB1顯著升高(P<0.05)，其他給藥組與模型組相比，IL-6，HMGB1顯著降低(P<0.05)，且中劑量和高劑量組降低程度高于低劑量組；陽性藥組與姜黃提取物組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 高脂聯(lián)合CCL4對(duì)脂肪性肝炎大鼠血清中IL-6，HMGB1的影響

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.5 RT-PCR測(cè)定PPAR-γ的表達(dá) 模型組PPAR-γ表達(dá)量顯著降低，其他給藥組與模型組相比，PPAR-γ表達(dá)量顯著升高，并且中劑量和高劑量組的升高程度高于低劑量組；陽性藥組與姜黃提取物組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 高脂飲食聯(lián)合CCl4脂肪性肝炎模型給藥6周后對(duì)PPAR-γ表達(dá)量的影響*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，與模型組比較，compared with model groupFig. 3 Effects of nonalcoholic steatohepatitis rats(HFD+CCL4) model of PPAR-γ expression after the treatment for 6 weeks on rats

2.6 肝組織PPAR-γ的病理檢查 棕色部分為PPAR-γ表達(dá)，模型組PPAR-γ表達(dá)量較正常組減少，其他給藥組與模型組相比，PPAR-γ表達(dá)量升高，并且中劑量和高劑量組表達(dá)量高于低劑量組；陽性藥組效果與中劑量組相當(dāng)，高劑量組效果優(yōu)于陽性藥。見圖4。

圖4 高脂飲食聯(lián)合CCl4脂肪性肝炎模型給藥6周后對(duì)PPAR-γ表達(dá)量的免疫組化結(jié)果A：正常組；B：模型組；C：陽性藥組；D：姜黃提取物低劑量組； E. 姜黃提取物中劑量組；F：姜黃提取物高劑量組Fig.4 Immunohistochemistry results of nonalcoholic steatohepatitis rats(HFD+CCL4) model of PPAR-γ expression after the treatment for 6 weeks on ratsA:Normal group; B: Model group; C:Positive group; D:50 mg/kg TE group; E:100 mg/kg TE group;F:200 mg/kg TE group

3 討論

隨著現(xiàn)代生活方式及飲食習(xí)慣的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年上升。NAFLD的疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎及肝硬化和肝癌[13]。NAFL進(jìn)展至非酒精性脂肪性肝炎后，將會(huì)有很高的肝硬化和肝癌的發(fā)生率，所以控制NASH的發(fā)展是控制非酒精性脂肪肝進(jìn)程的關(guān)鍵步驟。在我國，許多患者并非只是NAFL，而常伴有炎癥發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)姜科植物姜黃有降血脂，抗氧化，抗炎，抗腫瘤等作用。故本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食聯(lián)合CCL4誘導(dǎo)大鼠NASH模型，以姜黃提取物進(jìn)行干預(yù)，通過分析PPAR-γ表達(dá)量和HMGB1， IL-6等指標(biāo)進(jìn)一步考察姜黃提取物治療高脂飲食聯(lián)合CCL4致大鼠NASH的作用機(jī)制。

PPAR-γ為核受體超家族成員，是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子。PPAR-γ主要表達(dá)于脂肪組織，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，從而調(diào)控某些脂質(zhì)代謝酶的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體能量穩(wěn)定和脂質(zhì)代謝，所以PPAR-γ被學(xué)者認(rèn)為在脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)中有至關(guān)重要的作用[14]。因此當(dāng)模型組給予高脂飲食后，其表達(dá)受抑，可使脂肪在肝臟中氧化減少，脂蛋白合成代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝沉積[15]。模型組大鼠血脂成分TC、TG、HDL-C、LDL-C較正常組明顯升高(P<0.05)，表明模型大鼠體內(nèi)血脂異常，從而證實(shí)了高脂飲食導(dǎo)致的非酒精性脂肪肝可能與PPAR-γ的表達(dá)受抑有關(guān)。姜黃提取物可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，使大鼠體內(nèi)代謝恢復(fù)平衡，增強(qiáng)了PPAR-γ的表達(dá)，發(fā)揮其調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用，最終促進(jìn)肝臟中脂質(zhì)分解。

HMGB1是一種核蛋白，在體內(nèi)的各個(gè)器官廣泛表達(dá)，主要由壞死和凋亡的細(xì)胞被動(dòng)釋放及激活的巨噬細(xì)胞主動(dòng)釋放[16]。HMGB1可與TLR4結(jié)合活化NF-κB信號(hào)通路，最終導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生[17-18]。給予模型大鼠姜黃提取物后，可抑制HMGB1的表達(dá)，降低炎癥因子表達(dá)緩解肝損傷[17,19]，通過文獻(xiàn)分析研究認(rèn)為姜黃提取物可抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的壞死和凋亡，降低HMGB1的被動(dòng)釋放，同時(shí)姜黃提取物可作用于TLR4通路抑制巨噬細(xì)胞活化，減少HMGB1的主動(dòng)釋放[20]，從而抑制IL-6，TNF-α等炎癥因子的分泌。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，采用姜黃提取物可抑制HMGB1，降低IL-6等炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥細(xì)胞浸潤和肝損傷。

本文研究姜黃提取物治療高脂飲食聯(lián)合CCL4誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝炎大鼠模型，給予姜黃提取物干預(yù)。從肝功能指標(biāo)，血脂指標(biāo)及肝纖維化指標(biāo)中觀察到，姜黃提取物組可減輕肝損傷，降低體內(nèi)血脂水平，增強(qiáng)抗氧化能力；RT-PCR結(jié)果提示，姜黃提取物可能通過改善肝臟功能，增加PPAR-γ mRNA表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪代謝。炎癥因子檢測(cè)結(jié)果表明姜黃提取物可顯著降低HMGB1，IL-6，減輕炎癥細(xì)胞浸潤，改善肝纖維化程度，通過以上2方面治療非酒精性脂肪性肝炎。

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(編校：王冬梅)

Effect of turmeric on nonalcoholic steatohepatitis induced by high fat diet combined CCl4and the relationship with PPAR-γ, IL-6 and HMGB1

WANG Ya1, MENG Ya-kun2, Chen Wei-jiao2, LI Dong-hui1Δ

(1.School of Pharmacy, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China; 2.Department of Clinical Laboratory, 302 Military Hospital, Beijing 100039, China)

ObjectiveTo explore the anti-nonalcoholic steatohepatitis effect and its mechanism of the turmeric extract for the nonalcoholic steatohepatitis rat induced by high fat diet(HFD)combined CCl4.Methods60 male SD rats were randomized into 6 groups: normal group, model group, positive group, low dose group, medium dose group, and high dose group .Model group(n=10) rats were fed with HFD and given CCL4(oil:CCL4=50:50), the treatment group included the low dose of turmeric extract(50 mg/kg), medium dose(100 mg/kg), and high dose(200 mg/kg), positive group(Compound Methionine and Choline Bitartrate Tablets) was given 162 mg/kg. After orally administrated by gavage for 6 weeks, serum Alanine transaminase (ALT), Aspertate Aminotransferase (AST) and liver hydroxyproline (Hyp) were detected, and portions of liver tissues were excised and fixed in 4% paraformaldehyde solution, and stained with hematoxylin and eosin. And then liver tissue pathology biopsy were then evaluated by microscope. To investigate the mechanism of turmeric extract on liver steatohepatitis, serum interleukin-6(IL-6), high mobility group protein 1 (HMGB1)by ELISA and PPAR-γ were detected. ResultsCompared with model group, ALT, AST and Hyp, IL-6, HMGB1 levels significantly decreased (P<0.05), and the expression of PPAR-γ significantly elevated in treatment group. ConclusionTurmeric extract can inhibit HFD combined CCl4-induced nonalcoholic steatohepatitis in rats by elevating the expression of PPAR-γ to promote lipid metabolism, on other hand, inflammation is inhibited and liver fibrosis is alleviated by reducing the levels of IL-6, HMGB1.

turmeric extract; high fat diet combined CCL4; nonalcoholic steatohepatitis; PPAR-γ

王亞，女，碩士在讀，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：wya0506@126com；李東輝，通信作者，男，博士，教授，研究方向：電化學(xué)傳感器，E-mail：lidonghuilx@sina.com。

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1005-1678(2016)01-0032-05