夏桂玲，胥亞楠，楊龍，李雋，何炯紅，鄧娜，田龍海，田銀

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血管緊張素受體1型-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路對肥大乳鼠心房肌細胞瞬時外向鉀電流離子通道重構(gòu)的調(diào)控作用

夏桂玲，胥亞楠，楊龍，李雋，何炯紅，鄧娜，田龍海，田銀

摘要

目的： 探討血管緊張素受體1型（AT1）-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin；CaN）信號通路對肥大乳鼠心房肌細胞瞬時外向鉀電流（Ito）離子通道重構(gòu)的調(diào)控作用。

方法：分離1天齡乳大鼠心房肌細胞，培養(yǎng)24 h分組：①對照組：不予牽張刺激；②牽張組：牽張增加12%硅膠模面積，培養(yǎng)24 h；③替米沙坦組：替米沙坦 1 μmol/L干預(yù)1 h，繼之牽張24 h；④環(huán)孢素A（CsA）組：CsA 0.25 μg/ml干預(yù)1 h，繼之牽張24 h。定量分析牽張組與對照組細胞蛋白/DNA比值、心房鈉尿肽（ANP） mRNA表達鑒定細胞肥大。全細胞膜片鉗技術(shù)檢測細胞Ito的變化。蛋白免疫印跡法檢測Ito離子通道α亞單位Kv4.3和CaNA亞基的蛋白表達。

結(jié)果：牽張組較對照組，Ito電流密度顯著降低；Kv4.3蛋白表達下調(diào)、促進CaNA蛋白表達；與牽張組比較，替米沙坦組和CSA組明顯抑制牽張刺激上述反應(yīng)。

結(jié)論：AT1-CaN信號通路參與調(diào)控肥大乳鼠心房肌細Ito離子通道重構(gòu)。

關(guān)鍵詞 受體, 血管緊張素, 1型； 離子通道；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶

資助項目：國家自然科學(xué)基金（81260040；81060018）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字 （2012）2239號]

Objective: To explore the role of angiotensin receptor type I (AT1)-calcineurin (CaN) signaling pathway in transient outward potassium ion channel (Ito) remolding in hypertrophic atrial myocytes of neonatal rats.

Methods: 1 day old neonatal rats’ atrial myocytes were isolated and the cells were divided into 4 groups:①Control group, normal cells were cultured for 24 h, ②Stretching group, the cells were cultured for 24 h with mechanical stretching to induce hypertrophy, ③Telmisartan group, the cells were treated by telmisartan at 1 μmol/L for 1 h, then cultured for 24 h and ④Cyclosporin-A (CsA) group, the cells were treated by CsA at 0.25 μg/ml for 1 h, then cultured for 24 h. The ratios of protein/DNA in myocytes were compared between Control group and Stretching group, cell hypertrophy was defined by mRNA expression of atrial natriuretic peptide (ANP). Ito changes were detected by whole-cell patch clamping technique, proteins expressions of Kv4.3 and CaN A subunit were examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, Stretching group showed obviously decreased Ito density and Kv4.3 protein expression, while increased CaN A protein expression; Compared with Stretching group, the above effects were reduced in Telmisartan group and CsA group.

Conclusion: AT1-CaN signaling pathway was involved in the regulation of Ito channel remodeling in hypertrophic atrialmyocytes of neonatal rats.

Key words Receptors, angiotensin type I; Ion channels; Signaling transduction; remodeling; Calcineurin

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:398.)

心房重構(gòu)在心房顫動（房顫）發(fā)生、發(fā)展及維持中起著重要作用，其主要包括心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)[1]。心房肌細胞離子通道重構(gòu)是心房電重構(gòu)的基礎(chǔ)之一。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（ CaN）在牽張刺激致心房肌細胞肥大的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，在房顫患者心房肌組織表達增加、活性增強[2]；并參與心肌細胞多種離子通道基因表達的調(diào)控[3]。血管緊張素受體1型（AT1）可通過激活CaN促進心房肥大[4]；同時，對于編碼瞬時外向鉀電流（Ito）離子通道α亞單位的Kv4.2基因，AT1特異性阻斷劑氯沙坦能對牽張引起的該基因表達產(chǎn)生抑制作用，并可改變Ito的大小[5]。但在肥大乳鼠心房肌細胞，AT1是否通過激活CaN參與心房電重構(gòu)的調(diào)節(jié)？目前尚少有確切證據(jù)。本研究通過心房肌細胞牽張刺激肥大模型，探討肥大乳鼠心房肌細胞Ito離子通道重構(gòu)以及AT1-CaN信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

主要試劑、溶液：（1）杜氏改良高糖培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS；特優(yōu)級）和0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco公司。II型膠原酶（Invitrogen公司，美國），辣根過氧化酶羊抗兔IgG和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗兔IgG購于美國Santa Cruz公司。封閉專用脫脂奶粉（普利萊公司，中國），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，南京Biobox公司），硅膠膜（SMI公司，美國），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美國），二喹啉甲酸（BCA）法蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司），鼠源Kv 4.3抗體（abcam公司，美國），鼠源CaNA亞基（CaNA）抗體（upstate公司，美國），鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（上?？党缮锕荆?。替米沙坦（Telmisartan）、環(huán)孢素A （Cyclosporin-A，CsA），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）、4-氨基吡啶（4-AP）、兔抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白抗體（α-SCA）和聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）購自于美國Sigma公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。（2）記錄鉀電流的細胞外液（mmol/L）：NaCl 136，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 1.0，NaH2PO40.33，CaCl2·2H2O，N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）10.0，一水葡萄糖（Glucose·H2O）10.0，pH用NaOH調(diào)至7.4。記錄Ito時，在細胞外液中加入0.3 mmol/L 氯化鎘（CdCl2）和0.5 mmol/L 氯化鋇（BaCl2）分別阻斷L-型鈣電流和內(nèi)向整流鉀電流。（3）記錄Ito電極內(nèi)液（mmol/L）：KCl 140，MgCl2·6H2O 1.0，HEPES 10.0，乙二胺四乙酸（EGTA） 5.0，三磷酸腺苷二鈉（Na2·ATP）5.0，pH用KOH調(diào)至7.2。

動物與儀器：1天齡SD乳大鼠由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供，雌雄不限，許可證號[SCXK（粵）2011-0029]；倒置顯微鏡（德國 ZEISS AXIO型）；電極拉制儀 （日本Narishige PP830型）；膜片鉗放大器（Axopatch700B）及附件均為美國Axon公司生產(chǎn)；電泳儀（BG-Power 600i）；酶標(biāo)儀（Mode1450型）。

乳鼠心房肌細胞分離與培養(yǎng)：分離乳鼠心房并剪碎。以含胰酶與II型膠原酶的混合消化液消化6～7 min。取上層細胞懸液，予含10% FBS的DMEM中和酶液。重復(fù)消化、取液和中和酶液過程，直至組織塊完全消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀加適量10% FBS-DMEM，制成細胞懸液。采用差速貼壁與Brdu結(jié)合，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中純化培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液洗去未貼壁細胞，換含5%血清培養(yǎng)基進行下一步實驗[6, 7]。

心房肌細胞免疫熒光染色鑒定：細胞爬片培養(yǎng)48 h，4 %的多聚甲醛室溫固定60 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3遍，每次5 min。5% 牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min 后，加一抗兔抗大鼠α-SCA抗體（1:50 稀釋） 4 ℃過夜，PBS洗3遍，每次5 min。加二抗羊抗兔IgG-FITC （1:100 稀釋），37 ℃60 min。PBS洗3遍，復(fù)染細胞核，加入封片劑封片后，于熒光顯微鏡下觀察并攝片。以乳鼠心臟成纖維細胞作為陰性對照[6, 7]。

牽張刺激細胞肥大模型構(gòu)建：采用靜態(tài)等雙軸牽張裝置對心房肌細胞施加定量的力學(xué)拉伸[8]。牽張裝置底部裝有富有彈性的硅膠膜，細胞培養(yǎng)于硅膠膜上。轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)裝置即從各個方向同步對硅膠膜產(chǎn)生牽拉，從而對粘附于硅膠膜上的細胞產(chǎn)生機械力牽張。該牽張裝置的設(shè)計為旋轉(zhuǎn)一周對應(yīng)于硅膠膜面積增加8%，增加12%以上即能導(dǎo)致細胞肥大，出現(xiàn)細胞表面積增加、細胞的蛋白/DNA比值增大等改變[4, 8]。心房肌細胞培養(yǎng)24 h，給予12%硅膠膜面積牽張刺激24 h，收集細胞，提取蛋白質(zhì)和DNA，定量計算二者比值。

細胞干預(yù)分組：細胞培養(yǎng)于牽張裝置24 h，更換5%FBS-DMEM培養(yǎng)基分組。（1）對照組：不予牽張刺激；（2）牽張組：牽張增加12%硅膠膜面積培養(yǎng)24 h。（3）替米沙坦組：替米沙坦 1 μmol/L干預(yù)1h，繼之牽張24h；（4）CsA組：CsA 0.25 μg/ml干預(yù)1 h，繼之牽張24 h。

心房肌細胞Ito測定：待牽張和干預(yù)結(jié)束后，以預(yù)溫的0.125%胰酶消化心房肌細胞，制成單細胞懸液。于直徑35 mm 培養(yǎng)皿中調(diào)整細胞數(shù)約為1×102，37℃ 95% CO2培養(yǎng)2～3h使細胞貼壁。選擇立體感強，大小適中的細胞進行實驗。玻璃微電極充灌電極液后電阻為2～4MΩ。施加負壓使電極與細胞表面形成1GΩ以上高阻抗封接。破膜，給予慢電容補償，形成全細胞記錄。設(shè)置鉗制電壓為-50 mV，給予指令電位從-40～+60 mV，梯度10 mV，波寬300 ms，頻率0.2 Hz的刺激，記錄Ito。5 mmol/L的4-氨基吡啶能阻斷該電流，證實該電流為Ito。為避免細胞大小所造成的誤差即采用電流密度分析，電流密度=電流強度/電容（pA/ pF）。電流信號經(jīng)銀/氯化銀電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 700B放大器放大通過轉(zhuǎn)換板，并存儲于計算機硬盤中。實驗過程由pCLAMP10.0軟件程序刺激發(fā)放和信號采集。

蛋白免疫印跡檢測：提取細胞總蛋白、定量。采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）法分離不同分子量蛋白，繼之以半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉TBS-T液封閉1 h。加用4 ℃封閉液稀釋的抗體，4 ℃孵育過夜。洗滌后加二抗室溫孵育1 h，繼之洗滌后加增強化學(xué)發(fā)光液，曝光。以AlphaEaseFC 軟件采集圖像并量化分析光密度值。以目的蛋白光密度值與相應(yīng)的GAPDH光密度值的比值為校正值用于比較分析。鼠源一抗包括Kv4.3抗體（1:500）、CaNA亞基（1:1 000）和GAPDH抗體（1:2 000）；二抗為兔抗小鼠IgG（1:2000）。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用pCLAMP 10.0軟件進行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，運用SigmaPlot軟件繪制離子通道電流密度—電壓曲線。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù) 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

乳鼠心房肌細胞的鑒定（圖1）：由乳鼠心房組織分離、純化培養(yǎng)的細胞，以兔抗大鼠95% α-SCA抗體免疫熒光染色呈陽性，而成纖維細胞為陰性，支持前者為乳鼠心房肌細胞。

圖1 乳鼠心房肌細胞α-橫紋肌肌動蛋白抗體免疫熒光染色陽性（×200）

牽張有效性鑒定：結(jié)果顯示牽張刺激導(dǎo)致心房肌細胞蛋白/DNA比值增大，相對比值為1.35:1 （P＜0.05，n=3），該結(jié)果顯示牽張刺激構(gòu)建心房肌細胞肥大模型成功[4, 8]。替米沙坦、CsA干預(yù)顯著抑制牽張導(dǎo)致的心房肌細胞蛋白/DNA比值改變（與牽張組比較相對值分別為0.96 vs 1.35，0.89 vs 1.35，皆P＜0.05，n=3）。

各組心房肌細胞瞬時外向鉀電流密度的比較（表1、圖2）：Ito出現(xiàn)于-20mV，電流強度隨著去極化強度的增加而增大，于+60mV達到最大，顯示出Ito具有明顯的電壓和時間依賴性。在+20 mV～+60 mV，牽張組Ito電流密度皆顯著小于對照組（P＜0.01）。替米沙坦組與牽張組比較，在+30 mV～+60 mV，Ito電流密度顯著增大（P＜0.01）。CsA組與牽張組比較，在+40 mV～+60 mV，Ito電流密度增大（P＜0.05）。

表1 不同刺激電位條件下乳鼠心房肌細胞瞬時外向鉀電流密度（pA/pF）比較（n=9，±s）

表1 不同刺激電位條件下乳鼠心房肌細胞瞬時外向鉀電流密度（pA/pF）比較（n=9，±s）

注：pA/pF：電流強度/電容。與對照組相比*P＜0.01；與牽張組相比△P＜0.05△△P＜0.01

+20 mV　 +30 mV　 +40 mV　+50 mV　+60 mV對照組　2.10±0.83　 4.15±1.07　 6.82±1.68　 8.56±1.88　 12.11±1.96牽張組　0.80±0.37*0.98±0.60*　1.17±0.56*　1.52±0.83*　1.57±0.44*替米沙坦組　1.70±0.99　 2.62±1.02△△3.87±1.01△△4.91±1.02△△6.62±1.21△△環(huán)孢素A組　0.94±0.40　 1.42±0.73　 2.04±0.66△　2.88±0.98△　4.27±0.78△

替米沙坦、環(huán)孢素A抑制牽張刺激對CaNA和Kv4.3蛋白表達的影響：與對照組比較，牽張組細胞CaNA蛋白表達上調(diào)，反映CaN活性增強；該組Kv4.3蛋白表達下調(diào)；與牽張組比較，替米沙坦組、CsA組干預(yù)顯著抑制牽張導(dǎo)致的CaNA蛋白表達上調(diào)和Kv4.3蛋白表達下調(diào)（圖3）。該結(jié)果顯示，牽張刺激可通過激活A(yù)T1，進而增強CaN活性，下調(diào)Kv4.3蛋白表達。

圖3 替米沙坦、環(huán)孢素A抑制牽張刺激對CaNA和Kv4.3蛋白表達的影響

3 討論

研究表明，隨著心房壓力負荷增加，發(fā)生房顫的風(fēng)險性也將隨之增加42%[9]。心房肌持續(xù)高負荷導(dǎo)致心肌細胞一系列病理生理改變，引起并促進心房重構(gòu)。離子通道重構(gòu)在心房重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[10]。

CaN信號是參與心肌細胞離子通道重構(gòu)的重要信號之一[3, 11]，其參與調(diào)控心房重構(gòu)并受AT1信號的調(diào)節(jié)[2]。臨床研究和動物實驗研究皆顯示血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）和AT1阻斷劑（ARB）能夠抑制心房重構(gòu)和房顫的發(fā)生[12, 13]。在細胞學(xué)研究中證實，AT1和CaN均參與多種心肌細胞離子通道表達的調(diào)控[5, 12]。并且，Saygili等[14]發(fā)現(xiàn)，牽張刺激導(dǎo)致乳鼠心房肌細胞肥大，通過激活A(yù)T1進而激活CaN參與調(diào)解基質(zhì)蛋白金屬酶的表達；氯沙坦和CsA均能阻斷牽張刺激的上述作用。但迄今，少見AT1通過CaN通路調(diào)控心肌離子通道表達的研究。

近年來，國外一些學(xué)者，在對乳大鼠心房肌細胞快速起搏模型和房顫患者的研究中[15, 16]發(fā)現(xiàn)Ito減小，Kv4.3蛋白下調(diào)，但并未進一步闡述電生理改變的機制。本實驗通過牽張刺激構(gòu)建心房肌細胞肥大模型，模擬心房肌細胞壓力負荷增大病理生理現(xiàn)象，結(jié)果顯示牽張組Ito從+20mV鉗制電位開始顯著減小，CaN蛋白上調(diào)，Kv4.3蛋白下調(diào)。并進一步通過給予AT1受體阻滯劑替米沙坦、CaN阻滯劑CsA分組干預(yù)，分別阻斷AT1-CaN信號通路各級聯(lián)。結(jié)果表明，無論是替米沙坦還是CsA干預(yù)，皆明顯抑制牽張刺激導(dǎo)致的上述效應(yīng)。Kv4.2和Kv4.3是編碼Ito離子通道α亞單位的主要基因。Kv4.2主要在心室表達；Kv4.3在人類心房肌上有著豐富表達，是心房肌細胞Ito離子通道的分子基礎(chǔ)。Ito是一種電壓依賴性的離子流，其電流的大小決定了動作電位（AP） 1相的電位幅度和時程。Ito減小有利于心房多發(fā)子波的折返，這可能即是促使房顫持續(xù)存在的機制之一[1]。

本研究結(jié)果顯示，在牽張刺激導(dǎo)致的肥大乳大鼠心房肌細胞，Ito密度減低，構(gòu)成Ito離子通道α亞單位的Kv4.3蛋白表達下調(diào)；CaN蛋白表達上調(diào)；給予AT1阻斷劑替米沙坦和CaN抑制劑CsA皆明顯抑制牽張刺激導(dǎo)致的上述效應(yīng)。此結(jié)果說明，在肥大心房肌細胞，AT1可以通過CaN信號來調(diào)控心肌離子通道的表達和離子通道功能。本研究結(jié)論為臨床AT1阻滯劑防治心房重構(gòu)和房顫提供一定的理論依據(jù)，這與臨床研究顯示應(yīng)用AT1阻滯劑能降低房顫發(fā)生率相符合[17-19]。本研究證明了CaN作為AT1受體下游信號參與肥大心房肌細胞離子通道重構(gòu)調(diào)控；該結(jié)論可能為臨床房顫的防治提供新的思路，即CaN信號有可能作為房顫防治的干預(yù)靶點。

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（編輯:曹洪紅）

Regulation of AT1-calcineurin Signaling Pathway on Transient Outward Potassium Ion Channel Remolding in Hypertrophic Atrial Myocytes of Neonatal Rats

XIA Gui-ling, XU Ya-nan, YANG Long, LI Jun, HE Jiong-hong, DENG Na, TIAN Long-hai, TIAN Yin.
Department of Cardiology, The People’s Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang (550002), Guizhou, China
Corresponding Author: YANG Long, Email: yanglong1001@163.com

Abstract

作者單位：550002 貴州省貴陽市，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 貴州省人民醫(yī)院 心內(nèi)科（夏桂玲、楊龍、李雋、何炯紅、鄧娜、田龍海、田銀）；北京小湯山醫(yī)院 康復(fù)科（胥亞楠）

作者簡介：夏桂玲 碩士研究生 主要研究方向為心律失常 Email: 358099293@qq.com 通訊作者：楊龍 Email: yanglong1001@163.com

中圖分類號：R541

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）04-0398-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016. 04.020

收稿日期:（ 2015-06-27）