楊衛(wèi)國, 花開堯, 金佳利, 房 林

(1. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，上海 200072; 2. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

?

·基礎(chǔ)研究·

RNA干擾下調(diào)YAP基因?qū)谞钕侔┘毎鸗PC-1功能的影響

楊衛(wèi)國1, 花開堯1, 金佳利2, 房 林1

(1. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，上海 200072; 2. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

目的 檢測siRNA沉默Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein，YAP)后的人甲狀腺癌TPC-1細胞功能變化。方法 應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將靶向沉默YAP基因的siRNA序列轉(zhuǎn)染至甲狀腺癌TPC-1細胞，應(yīng)用qRT-PCR、Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后TPC-1細胞YAP基因及蛋白表達，MTT、平板克隆實驗、Transwell小室、劃痕實驗和流式細胞術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染對細胞增殖、侵襲、遷移和細胞周期及凋亡的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA后，YAP mRNA和蛋白表達明顯下降(P<0.05)；TPC-1細胞的增殖、侵襲、遷移能力受到抑制，細胞周期G0/G1阻滯，細胞凋亡未明顯上升。結(jié)論 抑制甲狀腺癌細胞YAP表達可有效降低細胞的增殖、遷移和侵襲能力，改變細胞周期分布，但對細胞凋亡無明顯影響。

甲狀腺腫瘤； Yes相關(guān)蛋白； siRNA； 細胞功能

YAP基因位于Hippo信號通路下游，是一重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子[1]和癌基因，在乳腺、肺、膀胱等癌中高表達[2-3]。研究[4]顯示，YAP基因在甲狀腺乳頭狀癌和未分化癌中高表達且與腫瘤增殖正相關(guān)。近年來，siRNA技術(shù)引起重視[5]。本研究觀察應(yīng)用siRNA敲除YAP基因后甲狀腺癌TPC-1細胞功能的變化，以探討其作為甲狀腺癌基因治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺癌TPC-1細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒購自BD Pharmingen公司；YAP抗體購自Cell Signaling Technology公司。在NCBI上Genbank中檢索YAP基因的全部堿基序列，采用在線RNA干擾設(shè)計軟件并根據(jù)siRNA設(shè)計原則設(shè)計干擾位點，siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。靶向沉默YAP基因的siRNA順義鏈： 5′-GCAUCUUCGACAGUC-UUCUTT-3′；反義鏈為： 5′-AGAAGACUGUCGA-AGAUGCTT-3′。以siRNA NC序列作為與人類基因組序列無任何匹配的陰性對照，siRNA NC順義鏈為： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反義鏈為： 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-TT-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及TPC-1細胞轉(zhuǎn)染 人甲狀腺癌TPC-1細胞培養(yǎng)于含10%澳洲胎牛血清及 100U/ml 雙抗DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4d更換培養(yǎng)基1次。選取活力較好的指數(shù)生長期細胞進行實驗，細胞計數(shù)后以每孔1×105個TPC-1細胞分種于6孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細胞密度達40%～50%后，應(yīng)用陽離子脂質(zhì)載體LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染入TPC-1細胞，每孔siRNA終濃度為 50nmol/L，同時轉(zhuǎn)染siRNA NC作為陰性對照，而未做任何處理組細胞作為空白對照組。

1.2.2 qRT-PCR檢測 總RNA提取試劑(TRIzol reagent)提取各實驗組TPC-1細胞總RNA，紫外分光光度計準(zhǔn)確定量。將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA后進行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃變性30s，57℃退火 1min，72℃延伸 1min，循環(huán)30次，最后72℃溫育10min。qRT-PCR引物YAP基因順義鏈為： 5′-ACCCACAGCTCAG-CATCTTCG-3′，反義鏈為： 5′-TGGCTTGTTCCC-ATCCATCAG-3′；β-actin基因順義鏈為： 5′-CGT-CTTCCCCTC CATCGT-3′，反義鏈為： 5′-GAAG-GTGTGGTGCCAGATTT-3′。

1.2.3 Western印跡法檢測 轉(zhuǎn)染后72h收集細胞，用RIPA細胞裂解液裂解TPC-1細胞并全程于低溫下提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每孔加蛋白樣品20μg，用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，按1∶800稀釋一抗孵育，于4℃冰箱放置過夜。TBST洗膜三次，每次約 10min，按1∶1 500稀釋二抗孵育50min，TBST再次洗膜3次，每次約10min。上機操作，通過Odyssey熒光成像系統(tǒng)掃描并進行蛋白條帶灰度分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測 實驗取對數(shù)生長期的TPC-1細胞，按2000個/孔接種于96孔板，每孔200μl，邊緣加200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h待細胞貼壁完全后轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染濃度為50nmol/L。轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)4d，檢測時間點分別為24、48、72和96h。每個檢測時間點待側(cè)孔每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl DMSO，均勻振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇 490nm 波長，測定各孔吸光度值(D490)，記錄結(jié)果并繪制細胞生長曲線。

1.2.5 克隆形成實驗 將各實驗組細胞消化，重懸后計數(shù)，按500個/孔接種于6孔板，十字形晃動使細胞在培養(yǎng)基中分散均勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10d，期間換全培養(yǎng)基一次。當(dāng)觀察發(fā)現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，棄上清液，PBS浸洗2次，95%乙醇固定10min后用0.1%結(jié)晶紫染色10min，蒸餾水沖洗3次，風(fēng)干后在顯微鏡下選取具有代表性的視野拍照。

1.2.6 劃痕試驗 取指數(shù)生長期狀態(tài)良好的TPC-1細胞，按1×105個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12h待細胞貼壁牢固后轉(zhuǎn)染siRNA，將全培養(yǎng)基換為含2%澳洲胎牛血清的DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細胞長滿6孔板后，用槍頭在細胞表面筆直劃一條直線，PBS清洗2次去除脫落細胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12、24h后鏡下觀察各組劃痕的愈合情況，顯微鏡下選取具有代表性的視野拍照。

1.2.7 Transwell侵襲實驗 將已轉(zhuǎn)染的狀態(tài)良好的TPC-1細胞消化后離心，細胞計數(shù)后加入一定量的培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml，取 0.2ml 接種于Transwell小室內(nèi)，將小室置于24孔板內(nèi)，上室為含2%滅活血清的培養(yǎng)基，下室為含15%滅活血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用消毒棉簽緩慢擦除上層小室內(nèi)細胞，95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，蒸餾水浸洗3次，風(fēng)干后熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照。

1.2.8 細胞周期和凋亡測定 將已轉(zhuǎn)染的狀態(tài)良好TPC-1細胞消化后離心，一部分用預(yù)冷的PBS洗滌3次后離心，加入預(yù)冷的70%乙醇固定過夜，再次離心并洗滌后用含RNase及碘化丙啶(PI)的染色液室溫下避光孵育30min，流式細胞儀分析細胞周期。另一部分加500μl的結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加1μl Annexin V-PI熒光染料充分混勻，室溫下避光孵育20min，1h內(nèi)進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR和Western印跡法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后YAP基因和蛋白的表達

qRT-PCR和Western印跡法結(jié)果顯示，與NC組和空白對照組相比，siRNA處理組TPC-1細胞的YAP mRNA和YAP蛋白表達均受到顯著抑制(P<0.05)，見圖1。

2.2 MTT檢測和平板克隆實驗檢測siRNA轉(zhuǎn)染后細胞增殖、遷移和侵襲能力的變化

MTT測定和平板克隆實驗顯示： 隨時間延長，空白組與NC組細胞增殖能力和克隆數(shù)無差異，YAP-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力和克隆數(shù)則明顯減緩或減少(P<0.05)，見圖2；劃痕和侵襲實驗顯示： 與空白對照組和NC組比較，siRNA-YAP組細胞愈合速度較慢，Transwell小室下層細胞數(shù)減少(均P<0.05)，見圖3；表明siRNA沉默YAP基因可抑制TPC-1細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA后的甲狀腺癌TPC-1細胞YAP mRNA和蛋白表達Fig.1 Relative expression of YAP mRNAand protein in TPC-1 thyroid cancer cells after transfected with siRNA demonstrated by qRT-PCR and Western blottingA： qRT-PCR；B： Western印跡法

圖2 MTT和平板克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA后TPC-1細胞增殖能力Fig.2 Proliferation of TPC-1 cells demonstrated by MTT assay and colony formation assayA： MTT；B： 平板克隆形成實驗

圖3 劃痕試驗和Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA后TPC-1細胞遷移、侵襲能力Fig.3 The migration and invasion of TPC-1 cellsdemonstrated by Cell scratch assay and Transwell assayA： 劃痕試驗；B： Transwell侵襲實驗

2.3 流式細胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染后細胞周期的變化

與空白對照組(53.60±0.73)%和NC組(55.27±2.10)%相比，siRNA-YAP組G0/G1期細胞數(shù)(64.40±1.69)%明顯上升(P<0.01)，S期和G2/M期細胞明顯下降，但細胞凋亡率則無差異，表明siRNA沉默YAP可使TPC-1細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，但對細胞凋亡無影響(表1)。流式細胞儀檢測所示，siRNA干擾YAP基因后TPC-1細胞周期受到明顯影響，見圖4。

表1 流式細胞儀檢測blank、NC、siRNA組TPC-1細胞周期分布

Tab.1 Cell cycle distribution detected by Flow cytometry in TPC-1 cell line (%)

組別G0/G1G2MSBlank53.60±0.7330.40±1.1016.00±1.00NC55.27±2.1029.00±1.0015.73±1.00siRNA64.40±1.6924.00±1.0011.60±1.00

圖4 流式細胞儀檢測的TPC-1細胞周期分布和凋亡Fig.4 Cell cycle distribution and apoptosis in TPC-1 cells shown by flow cytometryA： 細胞周期分布；B： 凋亡；圖B中右下象限AnnexinV(+)PI(-)代表早期凋亡細胞，右上象限AnnexinV(+)PI(+)代表晚期凋亡細胞或死亡細胞

3 討 論

甲狀腺癌的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果。利用siRNA沉默相關(guān)關(guān)鍵基因治療惡性腫瘤已取得一定的進展[6]。

Hippo通路最早在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，主要通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡調(diào)控器官發(fā)育，近年不少研究表明與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)[7]。YAP作為Hippo通路的主要效應(yīng)因子，其上游的轉(zhuǎn)錄因子如Mast1/2、Ww45、Lats1/2、Mob1等通過磷酸化和促進細胞質(zhì)/細胞核轉(zhuǎn)位對YAP起負性調(diào)節(jié)作用。這些調(diào)控因子的表達缺失能使YAP過表達，導(dǎo)致其下游的轉(zhuǎn)錄因子cyclinE、DIAP1、TEAD1、TEAD2等表達增加，從而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[8]。研究[9-12]報道，YAP基因在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌等過表達。Tschaharganeh等[13]證實，肝癌細胞YAP能上調(diào)Notch信號通路的配體Jagged-1(Jag-1)、激活Notch信號通路，從而調(diào)控肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲。

本實驗通過siRNA下調(diào)甲狀腺癌TPC-1細胞YAP表達，以觀察細胞功能的變化。轉(zhuǎn)染siRNA-YAP后，mRNA和蛋白水平Y(jié)AP表達均被顯著抑制；隨著YAP下調(diào)，TPC-1細胞的增殖、遷移、侵襲也均受到抑制，細胞周期阻滯在G1期，但對細胞凋亡無明顯作用。本實驗只是應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)的YAP特異性siRNA的甲狀腺癌細胞瞬時轉(zhuǎn)染，對基因抑制狀態(tài)不穩(wěn)定；且實驗只在甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1中進行驗證，也未進行體內(nèi)實驗，因此相關(guān)的研究有待進一步進行。

綜上所述，siRNA能特異性沉默人甲狀腺癌TPC-1細胞YAP基因，下調(diào)其mRNA及蛋白表達水平，抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，為甲狀腺癌的基因治療提供了新的實驗依據(jù)。

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Effect of RNA interference targeting YAP gene on thyroid cancer TPC-1 cells

YANGWei-guo1,HUAKai-yao1,JINJia-li2,FANGLin1

(1. Dept. of Breast and Thyroid Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China;2. Medical College, Tongji University， Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the effect of small interfering RNA (siRNA) targeting Yes associated protein (YAP) gene on thyroid cancer TPC-1 cells. Methods siRNA targeting YAP gene was transfected in thyroid cancer TPC-1 cells with LipofectamineTM2000. qRT-PCR and Western blotting were conducted to determine YAP suppression at mRNA and protein levels by siRNA. MTT assay, colony formation assay, Transwell migration assay wound healing assay and flow cytometry were used to study the effects of siRNA on cell proliferation, migration, cell cycle and apoptosis, respectively. Results Expression of YAP was suppressed after interference of YAP siRNA (P<0.05), proliferation, migration and invasion of TPC-1 cells were inhibited; cells were arrested at G0/G1phase, but cellular apoptosis rate was not significantly changed. Conclusion The results indicate that YAP gene exerts a vital role in biological behaviors of thyroid cancer TPC-1 cells.

thyroid cancer; Yes associated protein; siRNA; cellular function

10.16118/j.1008-0392.2016.01.006

2015-10-12

國家自然科學(xué)基金(81272240)

楊衛(wèi)國(1981—)，男，碩士研究生.E-mail： changning021@163.com

房 林.E-mail： fanglin_f@126.com

R 736.1

A

1008-0392(2016)01-0028-05