路玉盼,董憲喆,馮　霞,胡　園,鄭小麗,葛曉悅,汪進(jìn)良,劉　屏

(1.山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院,山西 晉中　030600；2.中國人民解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室,北京　100853；3.總參第六十一研究所門診部,北京　100041； 4.中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科,北京　100853)

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血根堿抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的機(jī)制研究

路玉盼1,2,董憲喆2,馮霞3,胡園2,鄭小麗2,葛曉悅2,汪進(jìn)良4,劉屏2

(1.山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院,山西 晉中030600；2.中國人民解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室,北京100853；3.總參第六十一研究所門診部,北京100041； 4.中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科,北京100853)

摘要：目的研究血根堿(Sanguinaria canadensis，SAN)誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡可能的作用機(jī)制。方法MTT法檢測SAN對MCF-7細(xì)胞存活率的影響；激光掃描共聚焦顯微鏡觀察SAN對MCF-7細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的影響；化學(xué)發(fā)光法檢測SAN對MCF-7細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響。結(jié)果SAN能降低MCF-7細(xì)胞存活率；SAN可明顯升高M(jìn)CF-7細(xì)胞內(nèi)ROS含量，升高細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性，而這種作用能被抗氧化劑NAC抑制。結(jié)論以上結(jié)果證明SAN能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，其機(jī)制可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：血根堿；MCF-7；活性氧；caspase；凋亡；乳腺癌；增殖

血根堿(Sanguinaria canadensis，SAN)是一種苯并菲啶類生物堿，主要來源于血根草的根或者罌粟紫堇植物，分布于我國的長江流域、華南、華東地區(qū)。天然的SAN是罌粟科植物受到外界環(huán)境的有害刺激時產(chǎn)生的用于對抗真菌和細(xì)菌病原體等的抗毒素類物質(zhì)，其本身可以被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原為低毒的二氫還原體，使植物本身不受影響。由于其具有抗菌消炎的作用，最初作為牙膏添加劑來降低牙菌斑和牙齦炎的發(fā)生，或者用于空腔消毒清洗，它的獨(dú)特作用已受到國內(nèi)外的高度重視。

近年來，國內(nèi)外的很多研究表明SAN具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，如結(jié)腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、人骨肉瘤以及胃癌等[1-6]。本課題組前期的研究也證明，SAN能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[7]。本研究以氧化應(yīng)激和caspase家族為切入點(diǎn)，探索其抑制MCF-7增殖的機(jī)制。

1材料

1.1細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。

1.2主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，美國Gibco公司；MTT(四氮甲基四唑藍(lán))，美國Sigma公司產(chǎn)品；活性氧檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；caspase-Glo 3檢測試劑盒、caspase- Glo 8檢測試劑盒、caspase-Glo 9檢測試劑盒，美國Promega公司；NAC，美國Sigma公司； caspase-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)，美國Promega公司；caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)，美國BioVision公司；caspase-9 抑制劑(Z-LEHD-FMK·TFA)，美國Sigma公司。

2方法

2.1MTT法檢測SAN對MCF-7的增殖抑制作用

取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，以7×107·L-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的SAN，使其終濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol·L-1，正常對照組加入不完全RPMI 1640?？疾霳AC及caspase抑制劑對細(xì)胞存活率的影響時，在加入5、10 μmol·L-1SAN的同時再分別加入5或10 μmol·L-1的NAC，caspase-3抑制劑 (Ac-DEVD-CHO)、caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)和caspase-9 抑制劑(Z-LEHD-FMK·TFA)組在加入10 μmol·L-1的SAN的同時分別加入上述抑制劑，終濃度分別為1、2、20 μmol·L-1[8]。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后加入終濃度為0.5 mg·L-1的MTT，4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩溶解10 min后，在570 nm處檢測OD值[9]。

2.2SAN對MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，以2×108·L-1的密度接種于Petri皿，每個皿200 μL。CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。然后分別加入終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN，正常對照組加入不完全RPMI 1640，NAC組及Ac-DEVD-CHO、Z-IETD-FMK和Z-LEHD-FMK·TFA組的處理方法同前。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗3次。各組分別加入200 μL終濃度為10 μmol·L-1的ROS特異性熒光探針DCFH-DA。37℃避光孵育35 min。其間每隔3～5 min輕搖混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。將Petri皿置于活細(xì)胞激光掃描共聚焦顯微鏡(UltraView-Vox，美國 PinkerElmer公司)物鏡下方的細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)，設(shè)置溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。在明場光源下調(diào)整焦距，在汞燈下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光探針標(biāo)記情況，并進(jìn)一步調(diào)整焦距。然后將光路轉(zhuǎn)換至左光路，關(guān)閉明場光源，打開激光，設(shè)置激發(fā)波長為488 nm。每組選擇10個視野，檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，由Volocity軟件計算各組熒光強(qiáng)度。

2.3SAN對MCF-7細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至7×107·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。然后分別加入終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN，正常對照組加入不完全RPMI 1640，NAC組同時加入5、10 μmol·L-1的NAC， NAC組及Ac-DEVD-CHO、Z-IETD-FMK和Z-LEHD-FMK·TFA組的處理方法同前，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照caspase-3、-8、-9說明書，先將caspase-Glo底物溶于caspase-Glo緩沖液中，并加入蛋白酶體抑制劑，配制成caspase-Glo試劑，將caspase-Glo試劑加入93孔板中，室溫避光孵育相應(yīng)時間，然后將上清液轉(zhuǎn)移至不透光的96孔白板中，多標(biāo)記微孔板檢測儀(Victor 1420，美國 PinkerElmer公司)選擇luminescence模式，檢測各孔化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，讀數(shù)即代表各組細(xì)胞內(nèi)caspase-3、-8、-9的相對活性。

2.4統(tǒng)計學(xué)分析

3結(jié)果

3.1SAN對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT法檢測不同濃度的SAN作用48 h對MCF-7細(xì)胞增殖情況的影響。如Fig 1所示，SAN在2.5～40 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對MCF-7細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。10 μmol·L-1的SAN作用48 h對MCF-7細(xì)胞的抑制率即接近50%。

Fig 1　Antiproliferation effects of various concentrations of SAN on MCF-7 cells(n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2SAN及NAC對MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

如Fig 2所示，以終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN作用于MCF-7細(xì)胞48 h后，活細(xì)胞激光掃描共聚焦顯微鏡下采集圖片并分析熒光強(qiáng)度(FI)，SAN干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度較正常對照組明顯升高；而在10 μmol·L-1SAN干預(yù)的同時，給予5、10 μmol·L-1的NAC，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯降低，低于10 μmol·L-1SAN單獨(dú)干預(yù)組(P<0.01)。

3.3SAN及NAC對MCF-7細(xì)胞存活率的影響

如Fig 3所示，終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN可明顯降低細(xì)胞存活率(P<0.01)，5、10 μmol·L-1的NAC單獨(dú)使用對細(xì)胞增殖沒有影響；5、10 μmol·L-1的NAC可逆轉(zhuǎn)10 μmol·L-1的SAN對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

3.4SAN對MCF-7細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響

化學(xué)發(fā)光法檢測發(fā)現(xiàn)，終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN作用于MCF-7細(xì)胞后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性與正常對照組相比都有明顯升高(P<0.01)，呈明顯的濃度依賴關(guān)系；5、10 μmol·L-1的NAC可抑制SAN對caspase-3和caspase-9活性的升高作用(P<0.01)，對caspase-8活性未見明顯影響(Fig 4)。

3.5caspase-3、caspase-8、caspase-9抑制劑對MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS含量及細(xì)胞活力的影響

鑒于NAC對caspase-3和caspase-9活性的抑制作用，觀察了caspase-3、caspase-8和caspase-9的抑制劑對細(xì)胞內(nèi)ROS及細(xì)胞增殖的影響。由Fig 5A可見，單用10 μmol·L-1的SAN作用后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS含量較正常對照組明顯升高，細(xì)胞活力明顯下降；caspase-3、caspase-8、caspase-9抑制劑與10 μmol·L-1的SAN同時使用后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS含量較單用SAN沒有明顯的變化；然而，caspase-3和caspase-9的抑制劑雖不能降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，卻能明顯逆轉(zhuǎn)SAN導(dǎo)致的MCF-7細(xì)胞存活率的下降(Fig 5B)。

Fig 2Effects of SAN and NAC on ROS content in MCF-7 cells(n=3)

A: Control; B:SAN 5 μmol·L-1; C: SAN 10 μmol·L-1; D: SAN 10 μmol·L-1+NAC 5 μmol·L-1; E: SAN 10 μmol·L-1+NAC 10 μmol·L-1; F: A semiquantitative assay of fluorescence intensity.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

Fig 3　Effects of SAN and NAC on cell proliferation in MCF-7 cells(n=5)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

4討論

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是呼吸鏈底物端和氧端漏出的電子，沒有參加ATP合成，而在體內(nèi)被氧化產(chǎn)生的一類氧的單電子還原產(chǎn)物[10]，包括氧的一電子還原產(chǎn)物超氧陰離子、二電子還原產(chǎn)物過氧化氫、三電子還原產(chǎn)物羥基自由基以及一氧化氮等[11]。在生物體內(nèi)，氧化與抗氧化處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。ROS是細(xì)胞代謝不可避免的產(chǎn)物，正常情況下，細(xì)胞代謝并釋放低濃度的ROS以促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時生物體內(nèi)有多種清除ROS的酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等。它們可以清除代謝過程中不斷產(chǎn)生的ROS，使得細(xì)胞內(nèi)ROS處于一個相對穩(wěn)定的水平[12]。當(dāng)這種平衡一旦被某些因素打破，使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，就可以通過激活相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至死亡[13]。

caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的一類酶。由于caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發(fā)，即呈級聯(lián)放大效應(yīng)[14]。caspases依賴的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括線粒體途徑和死亡受體途徑。線粒體途徑中caspase-9最為重要，又稱為caspase-9途徑；死亡受體途徑中caspase-8尤其關(guān)鍵，所以又稱為caspase-8途徑[15]，這兩條途徑最終都激活caspase-3。caspase-3是效應(yīng)型半胱天冬蛋白酶 ，可以進(jìn)一步裂解與凋亡相關(guān)的靶蛋白和酶類，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，SAN能夠明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖。采用活細(xì)胞激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SAN可以升高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平；化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAN能升高M(jìn)CF-7細(xì)胞內(nèi)caspase-3、capase-8、caspase-9活性。由此提示SAN抑制MCF-7細(xì)胞增殖與升高細(xì)胞內(nèi)ROS、激活caspases級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，但二者何為因果尚不明確。因此，本文又進(jìn)一步分別研究了ROS抑制劑對caspase-3、capase-8、caspase-9活性和細(xì)胞增殖的影響，以及caspase-3、capase-8、caspase-9的抑制劑對細(xì)胞內(nèi)ROS含量和細(xì)胞增殖情況的影響。結(jié)果顯示，ROS抑制劑NAC能明顯抑制caspase-3和caspase-9的活性，升高細(xì)胞存活率；caspase-3、caspase-9的抑制劑也能明顯升高細(xì)胞的存活率，卻不能降低SAN作用后MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平。由此可初步確定，SAN通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，升高caspase-3活性，抑制MCF-7細(xì)胞增殖。

Fig 4　Effects of SAN on caspase-3 (A)，caspase-8 (B) and caspase-9 (C) activities in MCF-7 cell(n=5)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

Fig 5　Effects of inhibitors of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 on ROS content (A) and cell proliferation (B) in MCF-7 cells(n=5)

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在中國人民解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室腫瘤實(shí)驗(yàn)室完成，感謝劉屏老師、董憲喆老師對本實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計的把握和指導(dǎo)，感謝胡園老師在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方面給予的幫助；感謝汪進(jìn)良教授對本研究的資助，感謝鄭小麗、葛曉悅在細(xì)胞培養(yǎng)、激光共聚焦檢測等實(shí)驗(yàn)技術(shù)上給予的幫助。)

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Sanguinarine inhibits cell proliferation in MCF-7 human mammary adenocarcinoma cells

LU Yu-pan1,2, DONG Xian-zhe2, FENG Xia3, HU Yuan2,ZHENG Xiao-li2, GE Xiao-yue2, WANG Jin-liang4,LIU Ping2

(1.DeptofChineseMedicine,ShanxiUniversityofTCM,JinzhongShanxi030600,China;2,DeptofClinicalPharmacology,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China;3,OutpatientDepartmentofthe61stResearchInstituteofthePLAGeneralStaffHeadquarters,Beijing100041;4,DeptofMedicalOncology,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853)

Abstract:AimTo investigate whether exposure to Sanguinarine(SAN) can inhibit cell proliferation in human mammary adenocarcinoma cells(MCF-7) and the possible mechanism.MethodsWe exposed MCF-7 to anticancer compound SAN, cell viability was assessed by using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) reduction assay. ROS was measured using confocal microscopy, expression of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were calculated using chemiluminescence method.ResultsSAN remarkably inhibited growth of human mammary adenocarcinoma MCF-7 cells by decreasing cell proliferation. ROS release and caspase-3, caspase-8, caspase-9 expression were stimulated by SAN in MCF-7, and these changes were abolished by the antioxidant, N-acetylcysteine(NAC).ConclusionRegulation of caspases expression and release from MCF-7 cells are possibly evoked by SAN through reactive oxygen species.

Key words:SAN；MCF-7；ROS；caspase；apoptosis；mammary adenocarcinoma；proliferation

收稿日期:2016-02-10,修回日期:2016-03-22

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81202965)

作者簡介：路玉盼(1990-)，女，碩士生，研究方向:腫瘤藥理學(xué),E-mail：dongxianzhe@163.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.023

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0858-05

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R329.25；R737.9

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.046.html

劉屏(1956-)，女，博士，研究員，研究方向：腫瘤和神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：liuping301@126.com