崔國禎，徐燕玲，孫安露，單璐琛，王玉強(qiáng)，李銘源

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠?！?19041;2. 澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門　999078; 3. 暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州　510632)

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丹參素衍生物對斑馬魚促血管新生作用的研究

崔國禎1,2，徐燕玲2，孫安露1，單璐琛3，王玉強(qiáng)3，李銘源2

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海519041;2. 澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門999078; 3. 暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州510632)

摘要：目的觀察丹參素衍生物(ADTM)對斑馬魚胚胎血管新生的影響，并探討其可能作用的信號通路。方法選擇正常血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚和血管生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRI)誘導(dǎo)血管損傷轉(zhuǎn)基因斑馬魚兩種模型，分別給予50、100、200 μmol·L-1的ADTM干預(yù)處理，以0.1%的DMSO為空白對照，分別觀察不同濃度的ADTM對斑馬魚腸下靜脈血管(SIVs)的直徑和內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)以及節(jié)間血管(ISVs)生長的影響，并對VRI和ADTM處理后的斑馬魚做轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。用熒光定量PCR的方法對轉(zhuǎn)錄組測序的4個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果>對于正常轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，ADTM處理后，斑馬魚的SIVs血管直徑明顯增加，內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目輕微增加；在VRI損傷模型中，ADTM表現(xiàn)出修復(fù)ISVs損傷的效果。轉(zhuǎn)錄組分析表明，19個(gè)明顯變化的基因富集在胰島素信號通路。熒光定量PCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中獲得的序列吻合。結(jié)論對于正常和血管損傷的斑馬魚模型，ADTM均有促血管新生的效果，其作用機(jī)制可能與胰島素信號通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：丹參素衍生物；血管新生；血管修復(fù)；斑馬魚；轉(zhuǎn)錄組；胰島素信號通路

川芎和丹參是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的中藥，我們的meta分析研究結(jié)果表明，丹參川芎注射液對心絞痛有良好的治療效果[1]，其中的主要成分丹參素(DSS)和川芎嗪(TMP)是預(yù)防或治療心腦血管疾病的活性物質(zhì)。但是，這些中藥單體療效不強(qiáng)，且作用機(jī)制不明確，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。為了提高丹參素的治療效果，充分發(fā)揮其藥效特色，我們對川芎嗪和丹參素進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾、藥效和作用機(jī)制研究。我們發(fā)現(xiàn)丹參素與活性分子川芎嗪偶聯(lián)修飾后得到的化合物ADTM(Fig 1A)[2]，其化合物的作用與臨床上用的藥物治療效果相似，但具有比臨床的藥物作用范圍更廣闊和毒性小等特點(diǎn)[3]。同時(shí)，本課題組尚未發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADTM在體內(nèi)外對神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的帕金森綜合癥有明顯的保護(hù)作用。其次，利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，找到了該化合物的藥物作用靶點(diǎn)[4-5]。

斑馬魚是一種用來研究器官發(fā)育和疾病模型的常見模式生物之一，具有胚胎透明、可直接觀察內(nèi)部器官、受試品用量少、篩選周期短和實(shí)驗(yàn)操作簡便等獨(dú)特優(yōu)勢。作為小型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物模型，斑馬魚在分子水平上85%與人類相同，心血管系統(tǒng)早期發(fā)育極為相似。48 hpf(受精后小時(shí))背動脈與軸靜脈形成簡單循環(huán)網(wǎng)，72 hpf功能性管脈系統(tǒng)形成，腸下靜脈血管(SIVs)呈現(xiàn)，在促血管新生藥物篩選方面得到廣泛的應(yīng)用[6，7]。本研究用轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究ADTM對血管新生的干預(yù)作用。

1材料與方法

1.1動物

血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fli1:EGFP)和Tg(fli1:nEGFP)購于國際斑馬魚資源中心，斑馬魚按照發(fā)表的方法飼養(yǎng)與繁殖[8]。這兩種轉(zhuǎn)基因斑馬魚分別在血管和血管的內(nèi)皮細(xì)胞核表達(dá)綠色熒光蛋白。

1.2化合物

丹參素衍生物ADTM按照發(fā)表的文章合成(純度>98%)[2]；血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRI)購于Calbiochem公司(貨號：676481)。

1.3動物分組與藥物處理

1.3.1ADTM對正常斑馬魚模型的影響選擇狀態(tài)良好，發(fā)育至48 h受精后的血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fli1:EGFP)胚胎，將其放入28.5℃培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中，每孔12個(gè)胚胎。以0.1%的DMSO為空白對照，以50、100、200 μmol·L-1的ADTM為藥物處理組。藥物作用48 h后，在熒光顯微鏡下觀察不同濃度ADTM對斑馬魚SIVs的影響(Fig 1B)。

1.3.2ADTM對VRI誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚模型的影響選擇狀態(tài)良好、發(fā)育至22 h的血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，將其放入28.5℃培養(yǎng)液的12孔板中，每孔12個(gè)胚胎。預(yù)先加入VRI 300 nmol·L-1，在28.5 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，用培養(yǎng)液洗3遍后，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21 h后(此時(shí)，VRI處理后的斑馬魚，表現(xiàn)為SIV缺失)，分別加入50、100、200 μmol·L-1的ADTM為藥物處理組，以單獨(dú)加0.1% DMSO為空白對照組。培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察藥物對斑馬魚ISVs的影響。

1.3.3觀察方法按照本課題組發(fā)表的方法觀察血管生成情況，并進(jìn)行定量分析[9-10]，用軟件AxiovisionLE 4.1測量隨機(jī)選取的3條斑馬魚的SIVs直徑(Fig 1C)。關(guān)于斑馬魚SIVs內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量的計(jì)算，采用直接計(jì)數(shù)的方法實(shí)現(xiàn)。在VRI誘導(dǎo)血管損傷模型中，我們將從主動脈(DA)或者脊椎主靜脈(PCV)發(fā)芽延伸并連接到背部脊索血管(DLAVs)的ISVs定義為完整血管(intact)，而一些已經(jīng)從DA或者PCV延伸出，但是并無與DLAVs相連的ISVs定義為缺陷型血管(defective)，然后分別對每條斑馬魚的完整型和缺陷型血管進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

Fig 1　Schematic illustration of experimental plan in normal zebrafish

A:Chemical structure of ADTM;B:A schematic illustration of drug treatment in normal zebrafish;C:Lateral view of vascular-specific transgenic zebrafish, the part indicated by dashed line represents SIV.

Fig 2　Effects of ADTM on diameters of zebrafish±s,n=12)

A: embryo treated with 0.1% DMSO at 24 hpf for 48 h;B～D: embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1ADTM, respectively;E:ADTM significantly increased SIVs diameter in a concentration-dependent manner.#P<0.05vscontrol group

1.4提取斑馬魚幼魚的總RNA

藥物處理后，用總RNA抽提試劑盒(RNeasy Mini kit, QIAGEN，德國)進(jìn)行RNA提取，提取藥物處理組(VRI+ADTM)與模型組(VRI)各30條斑馬魚幼魚總RNA。質(zhì)量鑒定合格后，進(jìn)行斑馬魚幼魚轉(zhuǎn)錄組的測定。

1.5斑馬魚轉(zhuǎn)錄組的測定及其分析

參照本課題組前期報(bào)道的方法[11]，對斑馬魚的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析。首先在Illumina Hi-2000基因組分析平臺上進(jìn)行雙端測序；對末端RNA序列進(jìn)行了配對，用Illumina基因組分析儀的fasta格式處理數(shù)據(jù)；用Cuffdiff軟件進(jìn)行差異基因分析；在DAVID數(shù)據(jù)庫中對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋、分析和KEGG pathway顯著性富集分析。

1.6斑馬魚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證斑馬魚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)譜中選取了4個(gè)基因(GSK-3β、BRAF、Sema3ab和IL1B)，按照報(bào)道的方法[11]，用RNA為模版，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈，然后設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR(qPCR)分析。

2結(jié)果

2.1ADTM對正常斑馬魚血管新生的影響

不同濃度藥物處理組斑馬魚胚胎48 h后，SIVs的直徑明顯增加，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(Fig 2)。藥物處理組與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該結(jié)果初步表明ADTM具有促血管生成活性的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血管的最主要的細(xì)胞之一，我們采用內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究ADTM對內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果表明(Fig 3)，不同濃度藥物處理組斑馬魚胚胎48 h后，SIVs內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量微弱增加，藥物處理組與對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2ADTM對VRI誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚模型的恢復(fù)干預(yù)作用

VRI誘導(dǎo)血管損傷轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型實(shí)驗(yàn)(Fig 4)發(fā)現(xiàn)，VRI處理后，ISVs和SIVs以及DLAVs都出現(xiàn)了明顯的缺失。在不同濃度ADTM處理斑馬魚幼魚48 h后，顯示了明顯的修復(fù)ISVs的效果，而且對SIVs區(qū)域也有一定程度上保護(hù)效果，并呈濃度依賴性(Fig 5)。

2.3ADTM對斑馬魚促血管新生信號通路的調(diào)控

為了更深入地了解ADTM在斑馬魚內(nèi)的促進(jìn)血管新生的分子機(jī)制，我們通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)分析經(jīng)過ADTM處理后，斑馬魚體內(nèi)的基因表達(dá)水平的變化。由于血管新生是一個(gè)全身性、整體性的機(jī)體調(diào)節(jié)的過程，所以我們研究斑馬魚整體的基因表達(dá)的變化。本研究中，模型組(VRI組)和藥物處理組(VRI+ADTM)基因表達(dá)庫中，每個(gè)庫有核苷酸序列標(biāo)簽的總數(shù)量為4.6～6.8百萬個(gè)。兩個(gè)庫中的核苷酸序列標(biāo)簽對應(yīng)VEGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)已有注釋的基因大約是2.1～3.2百萬個(gè)(約占整體的46%)。

Fig 3　Effects of ADTM on number of zebrafish SIVs endothelial±s,n=12)

A:embryo treated with 0.1% DMSO at 24 hpf for 48 h;B～D:embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1ADTM, respectively;E:ADTM slightly increased endothelial cells of zebrafish SIVs.

然后，我們通過DEGseq分析，得到兩組之間基因表達(dá)差異有顯著性(P<0.01)的有1 513個(gè)基因。KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，胰島素信號通路富集最為明顯，19個(gè)明顯變化的基因(P<0.01)富集在該通路，結(jié)果見Fig 6，上調(diào)基因：Cb1、CrkⅡ、GRF2、INSR、IRS、P13K、FOXO1、GSK-3β、FBP、PHK、PKA、LAR、SOS、MNK；下調(diào)基因：GK、PEPCK、GYS、PP1、S6。文獻(xiàn)報(bào)道[12]，胰島素激活I(lǐng)RSR、PI3K和GSK-3β等可引起胰島素信號通路的活化，由此確定ADTM激活胰島素信號通路。

Fig 4　Schematic illustration of experimental plan on VRI induced vascular insufficiency in zebrafish

2.4用qPCR的方法對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

對挑選的4個(gè)關(guān)鍵基因(GSK-3β、BRAF、Sema3ab和IL1B)進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(Tab 1)，4個(gè)基因的PCR結(jié)果變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組中獲得的序列完全吻合，說明這4個(gè)基因確實(shí)在斑馬魚體內(nèi)表達(dá)，并且斑馬魚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3討論

血管創(chuàng)傷、缺血性心臟病、傷口愈合緩慢和閉塞性脈管炎等都是臨床常見病，是影響人類健康的重要因素之一，而血管生長不足則是這些疾病共同的重要病理生理基礎(chǔ)。因此，開展促血管新生作用的研究對諸多血管新生不足相關(guān)疾病的防治有著重要意義。我們先前建立的斑馬魚模型，用來評價(jià)藥物對斑馬魚血管生成的作用效果，其中特定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞，允許實(shí)時(shí)觀察血管系統(tǒng)體內(nèi)動態(tài)變化的過程。斑馬魚憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢成為干預(yù)血管新生藥物篩選的理想模型。VRI是一種可以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體1-2的化合物，在抗血管新生和抗癌方面有潛在的開發(fā)價(jià)值[13]。用VRI來模擬血管新生功能缺陷的模型，具有靶點(diǎn)清晰、針對性強(qiáng)等優(yōu)勢[8]。本研究以斑馬魚為模型，探討丹參素衍生物對斑馬魚正常血管新生的干預(yù)作用，以及對VRI損傷血管的修復(fù)效果。研究發(fā)現(xiàn)，ADTM處理48 h后，明顯增加正常斑馬魚的SIVs血管直徑，對VRI誘導(dǎo)的血管損傷有明顯的修復(fù)作用。以上結(jié)果表明，ADTM有促血管新生的作用。其次，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，ADTM的促血管新生作用可能與胰島素信號通路的激活有關(guān)。

Fig 5　Effects of ADTM on VRI induced vascular insufficiency in±s,n=12)

A:Embryo treated with 0.1% DMSO at 48 hpf for 48 h;B: Embryo treated with 300 nmol·L-1VRI at 48 hpf for 48 h;C～E:Embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1ADTM, respectively before VRI exposure;F:ADTM restored VRI-induced vascular insufficiency in zebrafish.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsVRI group

轉(zhuǎn)錄組是特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)是最近發(fā)展起來的利用深度測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析的方法，這種技術(shù)已經(jīng)改變了我們對真核轉(zhuǎn)錄認(rèn)識的程度和復(fù)雜性，與其它技術(shù)相比，RNA-Seq能更準(zhǔn)確地測量哺乳動物轉(zhuǎn)錄水平[14]。我們的研究結(jié)果表明，ADTM的促血管新生作用可能與胰島素信號通路的調(diào)控有關(guān)。近幾年胰島素抵抗綜合征的發(fā)病率和死亡率在不斷增加，其中大部分是由于心血管疾病的影響而增加的風(fēng)險(xiǎn)[15]。文獻(xiàn)報(bào)道表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞是胰島素作用的重要細(xì)胞，胰島素在維持血管內(nèi)皮正常功能中起重要作用。對胰島素耐受或血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂進(jìn)行治療，可以降低心血管疾病的病變和死亡率[16]。因此，ADTM通過激活胰島素信號通路，發(fā)揮促血管新生和血管修復(fù)的效果。

Tab 1　Comparison of fold change in expression of selected genes by transcriptome and qPCR

Fig 6　Analysis of insulin signaling pathway in gene expression profile of ADTM and VRI treated zebrafish

The insulin signaling pathway is overlaid with gene expression color criteria and ratios of gene expression from KEGG pathway: red triangle, significantly upregulated by ADTM(ADTM+VRvsVRI，P<0.01); blue triangle, significantly downregulated by ADTM(ADTM+VRIvsVRI，P<0.01); no triangle, not significantly changed or not detected.

綜上所述，ADTM對正常和血管損傷的斑馬魚模型，均有促血管新生的效果，其作用機(jī)制可能與胰島素信號通路的激活有關(guān)。ADTM表現(xiàn)出心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和促血管新生的藥理學(xué)作用，具有“腦心同治”的功效，其一藥多種功能的作用機(jī)制及其多種功能間是否存在共同的藥物靶點(diǎn)或信號通路，值得進(jìn)一步研究和探索。

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Effect of Danshensu derivative on angiogenesis in zebrafish

CUI Guo-zhen1,2，XU Yan-ling2，SUN An-lu1，SHAN Lu-chen3，WANG Yu-qiang3，LI Ming-yuan2

(1.ZhuhaiKeyLaboratoryofBasicandAppliedResearchinChineseMedicine,DeptofBioengineering,ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,ZhuhaiGuangdong519041,China; 2.StateKeyLaboratoryofQualityResearchinChineseMedicineandInstituteofChineseMedicalSciences,UniversityofMacau,Macao999078,China; 3.InstituteofNewDrugResearch,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

Abstract:AimTo investigate the pro-angiogenic effects of Danshensu derivative ADTM and explore its underlying possible signaling pathway using zebrafish embryos asinvivomodels.MethodsThe angiogenesis activities of ADTM were determined in experimental models of normal and VEGFR tyrosine kinase inhibitor Ⅱ(VRI)-induced vascular defective zebrafish embryos. Embryos were treated with various concentrations(50，100，200 μmol·L-1) of ADTM for indicated time. The diameter and the numbers of endothelial cells of zebrafish SIVs were evaluated, respectively. In VRI model, the number of intact and defective ISVs in each zebrafish embryo was counted. The total RNA of zebrafish embryos was extracted and transcriptional profiling was analyzed by deep sequencing. Quantitative real-time PCR(qPCR) was performed to 4 genes selected from transcriptional profiling to validate the data collected from transcriptome analysis.ResultsADTM significantly increased subintestinal vessels (SIVs) diameter in a concentration-dependent manner in normal zebrafish as well as restored VRI-induced blood vessels defect in VRI-exposed zebrafish. The transcriptome data analysis demonstrated that 19 significantly changed genes were mapped to insulin signaling pathway.The qPCR data are in good agreement with those obtained by deep sequencing and support the consistency between the two methods for determining relative expression levels in the zebrafish model.ConclusionIn zebrafish model, ADTM exhibits the effects of angiogenesis and blood vessel restoration. The underlying mechanism may be involved in the activation of insulin signaling pathway.

Key words:Danshensu derivative; angiogenesis; vascular repair; zebrafish, transcriptome; insulin signaling pathway

收稿日期:2016-01-19,修回日期:2016-02-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460552，81328025)；珠海市優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助和澳門科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(No 078/2011/A3，134/2014/A3)

作者簡介：崔國禎(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail: cgzum@hotmail.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.012

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0795-06

中國圖書分類號：R-332；R322.123；R364.3；R347.8；R394.2

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.024.html

李銘源(1972-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: simonlee@umac.mo