朱智德++蔣林++羅宇東++陳洪濤

[摘要] 目的 開展六味葛藍降脂片的遺傳毒性和急性毒性試驗，以評價其作為保健食品的毒理學安全性。 方法 根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部2003年版）食品安全性毒理學評價程序和檢驗方法的要求，進行急性經(jīng)口LD50測定，通過小鼠精子畸形試驗、小鼠骨髓微核試驗及Ames試驗評價其遺傳毒性。 結(jié)果 六味葛藍降脂片的急性經(jīng)口LD50>30 g/kg；3項遺傳毒性試驗結(jié)果均為陰性。 結(jié)論 在本試驗條件下，六味葛藍降脂片急性經(jīng)口毒性屬無毒級，未見遺傳毒性作用。

[關(guān)鍵詞] 六味葛藍降脂片；急性毒性；遺傳毒性

[中圖分類號] R965.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）04（c）-0004-04

Study on the acute and genetic toxicities of Liuwei Gelan lipid-lowering tablets in mice

ZHU Zhi-de1 JIANG Lin2 LUO Yu-dong1，3 CHEN Hong-tao1，3

1.Pharmaceutical Factory，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Adult Education College，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China；3.Key Laboratory，Generic Technology Development of Chinese Medicine Preparation in Guangxi Universities，Nanning 530001，China

[Abstract] Objective To determine the acute oral toxicity and genetic toxicity of Liuwei Gelan lipid-lowering tablets. Methods The acute oral LD50 test was performed，and the genetic toxicity was evaluated by mouse sperm abnormality test，bone marrow micronucleus test and Ames test according to the requirements of the《health food inspection and evaluation of technical specifications》（formerly the Ministry of health in 2003 Edition） food safety toxicology evaluation procedures and test methods. Results The acute oral LD50 of Liuwei Gelan lipid-lowering tablets was greater than 30 g/kg.The genetic toxicity indicated by Ames test，micronucleus test of polychromatic erythrocytes in bone marrow and sperm shape abnormality test in mice was negative. Conclusion In our experimental condition，the acute toxicity of Liuwei Gelan lipid-lowering tablet is classified as non_toxic.Genetic toxicity is not found.

[Key words] Liuwei Gelan lipid-lowering tablets；Acute toxicity；Genetic toxicity

高脂血癥為臨床上的多發(fā)病及常見病，是引發(fā)脂肪肝、心腦血管疾病的重要病因之一。西藥降脂療效確切，但對人體的肝、腎等器官損害較大，因此臨床應用范圍受到一定限制。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治高脂血癥及心腦血管疾病等方面有著獨特的優(yōu)勢[1-11]，中藥治療高脂血癥副作用小，復發(fā)率低，具有廣譜且多層次、多靶點、多途徑降脂的優(yōu)勢，研究并開發(fā)降脂中藥及保健食品具有廣闊的市場空間。六味葛藍降脂片為廣西中醫(yī)藥大學制藥廠擬開發(fā)的具有輔助降血脂功效的保健食品。前期功效學試驗研究[12-13]表明，六味葛藍降脂片具有調(diào)節(jié)血脂、預防動脈硬化、保護肝臟、緩解體重增長的功效。為評價產(chǎn)品的安全性，根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部2003年版）的要求，現(xiàn)進行六味葛藍降脂片的急性經(jīng)口毒性及遺傳毒性作用試驗。

1 材料與方法

1.1 樣品和受試菌株

六味葛藍降脂片由廣西中醫(yī)藥大學制藥廠生產(chǎn)，為棕褐色的片劑，產(chǎn)品批號：20130301，每片含生藥量7 g，按成人口服推薦用量（2片/次，2次/d）計算，折合劑量為100.0 mg/kg體質(zhì)量，試驗前加無菌蒸餾水配制成相應的劑量；試驗菌株和肝微粒體酶（S9）由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提供，試驗前經(jīng)鑒定合格后使用。

1.2 主要儀器

SW-CJ-2D超凈工作臺（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、RE501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）、JY501電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、XFS-280壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、101-1恒溫電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 動物來源

昆明種小鼠，清潔級，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK桂2014-0002。

1.4 試驗方法

參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部2003年版）食品安全性毒理學評價程序和檢驗方法以及相關(guān)文獻的方法進行試驗[14-21]。

1.4.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗 采用一次最大耐受量給予的方法，選擇昆明種清潔小鼠20只（體質(zhì)量18～22 g），雌雄各半，取受試樣品配制成500 mg/ml濃度溶液給小鼠灌胃（0.40 ml/20 g體質(zhì)量），每間隔4 h灌胃1次，灌胃3次，累積劑量達30 000 mg/kg體質(zhì)量。試驗前小鼠禁食（16 h）不禁水，灌胃后每周稱量小鼠體重1次，連續(xù)觀察14 d，記錄動物的中毒癥狀及死亡情況，試驗結(jié)束后處死動物并進行大體解剖觀察，評價被檢物的急性毒性強弱。

1.4.2 Ames試驗 采用平板摻入法，分加入多氯聯(lián)苯誘導的大鼠S9及不加入S9兩種情況。受試品用蒸餾水配制成濃度為0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 mg/ml的溶液，采用四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102進行試驗。將0.10 ml受試物溶液、0.10 ml試驗菌株和0.50 ml S9混合液（當需要代謝活化時）混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中，37℃下培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，同時設(shè)溶劑對照（用蒸餾水替代樣品）、自發(fā)回變對照（不加樣品，空白對照）和陽性突變劑對照，以直接計數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌落數(shù)的多少而進行結(jié)果評定。試驗設(shè)8、40、200、1000、5000 μg/皿5個試驗劑量，每個劑量做3個平行皿。試驗在同樣條件下重復做2次。如在背景生長良好條件下，受試回變菌落數(shù)增加1倍以上，即回變菌落數(shù)≥2×空白對照數(shù)，并有劑量反應關(guān)系即可認為該受試物為誘變陽性。

1.4.3 小鼠骨髓細胞微核試驗 采用30 h給受試物法，即2次給受試物間隔24 h，第2次給受試物后6 h，頸椎脫臼處死動物。取昆明種小鼠50只（體質(zhì)量25～30 g），雌雄各半，將其隨機分成陰性對照（蒸餾水）、陽性對照（40 mg/kg體質(zhì)量）劑量的環(huán)磷酰胺]和3個受試物劑量組（2500、5000、10 000 mg/kg體質(zhì)量），每組10只小鼠。各組小鼠按相應劑量（0.40 ml/20 g體質(zhì)量）灌胃，兩次給藥間隔24 h，第2次給藥后6 h頸椎脫臼處死動物，取胸骨用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，放入甲醇中固定，Giemsa應用液中染色，用光學顯微鏡觀察并對微核進行計數(shù)，每只小鼠計數(shù)1000個嗜多染紅細胞（PCE），并以含微核的PCE千分率計算微核率，同時計算PCE（每只小鼠計數(shù)200個）與成熟紅細胞的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布進行數(shù)據(jù)處理，試驗組與對照組相比，試驗結(jié)果微核率有明顯的劑量反應關(guān)系并有統(tǒng)計學意義時，即可確認為陽性結(jié)果。

1.4.4 小鼠精子畸形試驗 選擇50只6～8周齡的昆明種雄性小鼠（體質(zhì)量25～35 g），將其隨機分成陽性對照（40 mg/kg體質(zhì)量）劑量的環(huán)磷酰胺]、陰性對照（蒸餾水）和3個受試物劑量組（2500、5000、10 000 mg/kg體質(zhì)量），每組10只小鼠。各組小鼠按相應劑量（0.40 ml/20 g體質(zhì)量）灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)5 d，最后1次灌胃后第30天處死小鼠，取出兩側(cè)附睪的精子，用甲醇固定5 min，1%伊紅染色1 h，在光學顯微鏡下計算精子畸形率（每只小鼠檢查1000個完整的精子），用χ2檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，評價精子畸形陽性的標準是畸形率至少為陰性對照組的倍量或差異有統(tǒng)計學意義，并有劑量反應關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，小鼠骨髓微核試驗數(shù)據(jù)采用泊松分布均數(shù)比較法，精子畸形試驗數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 六味葛藍降脂片對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果

以30 000 mg/kg體質(zhì)量的樣品劑量（最大給藥量）灌胃小鼠后，小鼠生長情況良好，未見有中毒癥狀，體重也未見異常，14 d觀察期動物無死亡。試驗結(jié)束動物解剖的大體觀察，主要臟器如心、肝、脾、胃、腎、肺、腸等未見明顯異常（表1）。樣品急性經(jīng)口毒性根據(jù)我國《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的評價標準，屬無毒級。

2.2 六味葛藍降脂片Ames試驗結(jié)果

無論加入S9與不加入S9，對于四種試驗菌株TA97、TA98、TA100、TA102，受試物的各劑量組回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)比較，均沒有增加1倍以上，也無劑量反應關(guān)系（表2、表3），表明該受試物為誘變陰性。

陽性對照：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2-氨基芴（劑量為10 μg/皿）；TA97-S9、TA102-S9采用敵克松（劑量為50 μg/皿）；TA100-S9采用疊氮鈉（劑量為1.5 μg/皿）；TA102+S9采用1，8-二羥基蒽醌（劑量為50 μg/皿）；TA98-S9采用柔毛霉素（劑量為6 μg/皿）。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

受試物各劑量組骨髓細胞微核率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），陰性對照組的骨髓細胞微核率顯著低于環(huán)磷酰胺陽性對照組（P<0.01）。各組的PCE/NCE比值也處于正常的范圍內(nèi)，小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陰性（表4）。

2.4 小鼠精子畸形試驗

受試樣品的陽性對照組與陰性對照組比較，小鼠的精子畸形率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；樣品各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表5），表明該樣品對小鼠精子畸形試驗的結(jié)果為陰性。

3 討論

六味葛藍降脂片的主要成分為絞股藍、火麻仁、決明子、葛根、沙棘等藥食同源藥材，根據(jù)中醫(yī)藥君、臣、佐、使理論，方中的絞股藍、火麻仁為君藥，絞股藍益氣養(yǎng)陰，益脾補虛，而火麻仁潤腸通便，用于血虛津虧，腸燥便秘；決明子為臣藥，能平肝、清熱明目，潤腸通便；佐以葛根解肌退熱，升陽透疹，生津止渴，沙棘消食化滯，活血散瘀；荷葉升發(fā)清陽，化除濕濁；諸品配合，諸癥兼顧，相得益彰，共奏益氣健脾，升發(fā)清陽，除濕化痰，降濁消脂之功。本品通過調(diào)節(jié)機體的代謝功能，從而達到多靶點、多環(huán)節(jié)整體協(xié)調(diào)降血脂的功能。本實驗考察了六味葛藍降脂片對小鼠的急性毒性及遺傳毒性作用，試驗結(jié)果表明，該產(chǎn)品的三項遺傳毒性試驗（小鼠精子畸形試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、Ames試驗）均為陰性，急性經(jīng)口毒性試驗根據(jù)我國《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的評價標準屬無毒級，表明六味葛藍降脂片是一種服用安全的保健食品。

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（收稿日期：2015-12-15 本文編輯：王紅雙）