邵寶珠, 唐其鳳, 曹麗麗(沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司, 沈陽(yáng) 110027)

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BALB/c小鼠不同體質(zhì)量范圍對(duì)重組人促紅素注射液體內(nèi)活性測(cè)定的影響

邵寶珠, 唐其鳳, 曹麗麗
(沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司, 沈陽(yáng) 110027)

[摘要]目的 以《中國(guó)藥典》的促紅素各論為基礎(chǔ)，探討在重組人促紅素(rhEPO)體內(nèi)活性測(cè)定時(shí)，6～8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠, 不同體質(zhì)量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果變異率的影響。方法 按小鼠體質(zhì)量分為14～22 g、18～20 g、15～20 g和16～18 g組，測(cè)定不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值穩(wěn)定性、線(xiàn)性和重復(fù)性的影響。結(jié)果 使用體質(zhì)量16～18 g、18～20 g小鼠測(cè)定的結(jié)果變異率低。結(jié)論 rhEPO體內(nèi)活性測(cè)定應(yīng)選用6～8周齡、體質(zhì)量16～20 g的BALB/c小鼠。

[關(guān)鍵詞]BALB/c小鼠; 重組人促紅素(rhEPO); 體內(nèi)生物學(xué)活性; 體質(zhì)量

人促紅素(hEPO)是一種肽類(lèi)激素，能夠刺激體內(nèi)的紅細(xì)胞增多。主要產(chǎn)生于腎臟，分泌后進(jìn)入人血液中，作用于骨髓中的紅祖細(xì)胞，使其加速分化，刺激網(wǎng)織紅細(xì)胞生成和成熟紅細(xì)胞釋放。重組人促紅素(rhEPO)是利用基因工程技術(shù)，將hEPO轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的糖蛋白，由165個(gè)氨基酸組成，用于治療慢性腎功能衰竭和癌癥化療所產(chǎn)生的貧血[1]。rhEPO也是最早用于臨床的基因工程藥物之一。

《中國(guó)藥典》和《歐洲藥典》明確規(guī)定了對(duì)rhEPO體內(nèi)生物學(xué)活性的檢測(cè)方法。兩者均采用網(wǎng)織紅細(xì)胞法，該方法是給小鼠皮下注射一定劑量的rhEPO，利用rhEPO刺激網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的作用，使其網(wǎng)織紅細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的百分含量增加，即在一定范圍內(nèi)rhEPO物質(zhì)的量與體內(nèi)網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分含量成正比。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)雙平行線(xiàn)法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出樣品的體內(nèi)生物學(xué)活性?！稓W洲藥典》規(guī)定使用8周齡雌性B6D2F1小鼠，每劑量組8只[2];《中國(guó)藥典》規(guī)定使用6～8周齡雌性BALB/c小鼠，每劑量組至少4只[3]，均沒(méi)有明確規(guī)定小鼠的體質(zhì)量。此方法使用具有正常紅細(xì)胞生成能力的小鼠，其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)促紅素臨床藥效反應(yīng)有更直接響應(yīng)，動(dòng)物容易獲得，且遺傳性狀穩(wěn)定。但是動(dòng)物試驗(yàn)有其天然缺陷即變異率高，為降低變異率，《歐洲藥典》和《中國(guó)藥典》明確了小鼠周齡和小鼠品系，十幾年的運(yùn)行證實(shí)該方法有效。本研究目的是以此為基礎(chǔ)，探索控制小鼠體質(zhì)量范圍降低變異率，擬采用《中國(guó)藥典》規(guī)定的6～8周齡雌性BALB/c小鼠，測(cè)定不同體質(zhì)量范圍對(duì)rhEPO體內(nèi)生物學(xué)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠， 6～8周齡，912只，沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心生產(chǎn)[SCXK(遼)2013-0002]。

1.2 藥品、試劑與儀器

rhEPO注射液(CHO細(xì)胞), 4 000IU/支, 沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)。工作標(biāo)準(zhǔn)品, 770 IU/mL,沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司自制。BSA購(gòu)自澳大利亞Bovogen公司; 氯化鈉購(gòu)自天津海光藥業(yè)有限公司。EDTA-2K購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。熒光染料、Cell-pack稀釋液、Cell-clean清洗液購(gòu)自Sysmex公司。樣品稀釋液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水。抗凝劑為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% EDTA-2K的生理鹽水。R-500全自動(dòng)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自日本Sysmex公司。電子天平(最大稱(chēng)量200 g，分辨率0.01 mg)、電子分析天平(AP250D，0.000 1 mg)購(gòu)自成都巿新津事豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值穩(wěn)定性的影響選擇SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠24只，隨機(jī)分為14～22 g、18～20 g、15～20 g、16～18 g 4組, 每組6只,將供試品稀釋至80 IU/mL，注射劑量0.5 mL/只，分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h從小鼠尾靜脈采血10 mL置于含有1% EDTA-2K的50 mL生理鹽水F套管中充分混勻，將抗凝血用R-500全自動(dòng)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)紅細(xì)胞總數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞總數(shù)并計(jì)算網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)對(duì)紅細(xì)胞總數(shù)的比值(Ret%)。

1.3.2 不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值線(xiàn)性關(guān)系的影響168只小鼠隨機(jī)分為14～22 g、18～20 g、15～20 g、16～18 g組, 每組42只, 將供試品稀釋至2.5 IU/mL、5 IU/mL、10 IU/mL、20 IU/mL、40 IU/mL、80 IU/mL、160 IU/mL，每劑量組注射6只，注射劑量0.5 mL/只，注射后96 h從小鼠眼眶后靜脈叢采血3～4滴，置于含有1% EDTA-2K的200 mL生理鹽水F套管中充分混勻，其余按1.3.1操作。

1.3.3 不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO體內(nèi)生物學(xué)活性重復(fù)性的影響 72只小鼠隨機(jī)分為14～22 g、18～20 g、15～20 g 、16～18 g組，每組18只，按照雙平行線(xiàn)法的實(shí)驗(yàn)要求和特點(diǎn)，設(shè)定3個(gè)注射劑量組，將樣品和工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至80 IU/mL、40 IU/mL、20 IU/mL, 于小鼠的腹側(cè)皮下注射, 其余按1.3.1操作。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)9次，計(jì)算相對(duì)偏差(RSD)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)/平均值()×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值穩(wěn)定性的影響

0～72 h的Ret%隨時(shí)間延長(zhǎng)穩(wěn)步升高，72 h達(dá)到最高并維持至96 h，120 h的Ret%值明顯下降，72～96 h小鼠體質(zhì)量范圍18～20 g組、16～18 g組的反應(yīng)值比較穩(wěn)定(表1)。

2.2 不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值線(xiàn)性的影響

結(jié)果表明，小鼠體質(zhì)量18～20 g組、16～18 g組的線(xiàn)性較好(表2)。

表1 小鼠不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值穩(wěn)定性的影響 Ret%

表2 小鼠不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO反應(yīng)值線(xiàn)性的影響 Ret%

2.3 小鼠不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定重復(fù)性的影響

結(jié)果表明，小鼠體質(zhì)量18～20 g組重復(fù)性最好，16～18 g組重復(fù)較好，15～20 g組重復(fù)性一般，隨機(jī)組(14～22 g)重復(fù)性較差(表3)。

3 討論

rhEPO為糖蛋白, 糖鏈的完整性直接影響rhEPO分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性和活性[4]，對(duì)失去或部分失去糖鏈的rhEPO分子即使在體外生物學(xué)活性很高，但體內(nèi)生物學(xué)活性也不會(huì)很高。因此，體內(nèi)生物活性測(cè)定是rhEPO注射液監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵指標(biāo)之一?！稓W洲藥典》、《中國(guó)藥典》規(guī)定檢測(cè)rhEPO體內(nèi)生物學(xué)活性使用小鼠的品系、周齡和數(shù)量，未規(guī)定動(dòng)物的體質(zhì)量。本研究表明, 6～8周齡BALB/c雌性小鼠, 體質(zhì)量范圍隨機(jī)組14～22 g對(duì)rhEPO反應(yīng)值的穩(wěn)定性、線(xiàn)性(變異率為51.5%)以及重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(17%)均不如其它3個(gè)組別的數(shù)據(jù)穩(wěn)定, 且復(fù)測(cè)率高。體質(zhì)量范圍在16～18 g、18～20 g測(cè)定的結(jié)果最為穩(wěn)定，重復(fù)性好，復(fù)測(cè)率低。

表3 小鼠不同體質(zhì)量對(duì)rhEPO體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定重復(fù)性的影響

在控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物周齡和體質(zhì)量后，本研究未進(jìn)行不同品系的研究。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，控制體質(zhì)量范圍可以減低變異率。我們認(rèn)為在《中國(guó)藥典》和《歐洲藥典》促紅素體內(nèi)活性測(cè)試方法的基礎(chǔ)上，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量范圍的進(jìn)行適當(dāng)控制，以降低試驗(yàn)的變異率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周勇, 王箐舟. 重組人紅細(xì)胞生成素質(zhì)量控制體系研究[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2007, 20(8):586-587.

[2] 《歐洲藥典》7.0版[S]. 01/2008:1316.

[3] 《中國(guó)藥典》2010版.三部各論: 重組人促紅素注射液[S]. [4] 周勇, 王箐舟. 重組人促紅素體內(nèi)、體外生物學(xué)活性差異成因分析[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2008, 21(2):136-138.

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q95-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1674-5817(2016)03-0216-03

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.012

[收稿日期]2015-08-24

[作者簡(jiǎn)介]邵寶珠(1979-), 男, 碩士, 工程師, 研究方向: 生物制藥工程。E-mail: Shaobaozhu@3sbio.com

[通信作者]唐其鳳, 女, 工程師, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail:Tangqifeng@3sbio.com