孫建國(guó)　李運(yùn)華　王曉彬　李振

摘 要：通過(guò)單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以蘋(píng)果渣為發(fā)酵基質(zhì)，開(kāi)展發(fā)酵制備生物腐植酸工藝研究。研究結(jié)果表明：復(fù)合微生物菌劑接種量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%，發(fā)酵時(shí)間20～25 d，黃腐酸含量達(dá)22%，活菌含量5.6億/g，為生物腐植酸規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：蘋(píng)果渣；黃腐酸

中圖分類號(hào)：TQ92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-8937（2016）02-0166-03

生物腐植酸（黃腐酸）是由富含纖維素、木質(zhì)素的植物殘?bào)w及輔助材料，經(jīng)多種微生物在一定條件下發(fā)酵轉(zhuǎn)化而成。產(chǎn)品活性成分多，含有大量功能菌劑，具有改良土壤、增進(jìn)肥效、調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)、提高作物抗逆性和改善作物品質(zhì)等特點(diǎn)。該研究以蘋(píng)果渣為原料，進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃腐酸的工藝研究，為其規(guī)?；幹锰峁┘夹g(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 發(fā)酵基質(zhì)

以蘋(píng)果渣為發(fā)酵基質(zhì)，來(lái)自果汁加工廠。蘋(píng)果渣中主要成分含量，見(jiàn)表1。

1.1.2 接種劑

是由木霉M21、放線菌F07、地衣芽孢桿菌X33、酵母菌J05組成的復(fù)合生物菌劑，有效活菌數(shù)≥100億/g，亳州市恒順生態(tài)科技有限公司提供。

1.1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，721分光光度計(jì)，光學(xué)顯微鏡，真空干燥箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 生物菌劑接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)處理，兩次重復(fù)。T0為對(duì)照處理，處理T1、T2、T3生物菌劑接種量分別為3%、5%、7%。各處理物料含水率50%，尿素添加量2%。

1.2.2 尿素添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)處理，兩次重復(fù)。T0為對(duì)照處理，處理T1、T2、T3尿素添加量分別為1%、2%、3%。各處理物料含水率50%，生物菌劑接種量3%。

1.2.3 物料含水率對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)處理，兩次重復(fù)，處理T1、T2、T3、T4物料含水率分別為40%、50%、60%、70%。各處理生物菌劑接種量3%，尿素添加量2%。

1.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)處理，兩次重復(fù)。

T1：發(fā)酵時(shí)間15 d；

T2：發(fā)酵時(shí)間20 d；

T3：發(fā)酵時(shí)間25 d；

T4發(fā)酵時(shí)間30 d。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 含水率、有效活菌數(shù)的測(cè)定

含水率、有效活菌數(shù)按照NY/T798-2004復(fù)合微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。

1.3.2 溫度測(cè)定

在堆肥中心下層、中層和上層放置3支溫度計(jì)，于每天上午9：00和下午16：00記錄堆體溫度，取其算術(shù)平均值。

1.3.3 黃腐酸含量測(cè)定

稱取0.2 g試樣于250 ml錐形瓶中，加入70 ml水，于瓶口插上小玻璃漏斗，置于沸水浴中加熱溶解30 min，并經(jīng)常攪動(dòng)，取出錐形瓶，冷卻后將溶液及殘?jiān)哭D(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用中速濾紙過(guò)濾，棄去最初的部分濾液。

而后，準(zhǔn)確吸取上述濾液5 ml于250 ml錐心瓶中，加入C（K2Cr2O7）=4.8 mol/l重鉻酸鉀溶液5 ml，緩慢加入濃硫酸15 ml，于沸水浴中加熱氧化30 min。

最后，將氧化后的溶液從水浴上取下，冷卻至室溫，加入70 ml水，3滴鄰菲羅琳指示劑，用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由橙色經(jīng)綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榇u紅色為終點(diǎn)。按下式計(jì)算出黃腐酸含量：

式中：V0為滴定空白試管所消耗的硫酸亞鐵體積，ml；

V為滴定樣品試管所消耗的硫酸亞鐵體積，ml；

N為硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/l；

0.003為碳的毫克重量，g；

a為樣品溶液滴定的體積，ml；

b為滴定時(shí)所吸取的樣品溶液的體積，ml；

G為配制樣品溶液時(shí)所加入的樣品質(zhì)量，g；

C為黃腐酸的含碳比（一般取為0.5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物菌劑接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

2.1.1 發(fā)酵過(guò)程溫度與黃腐酸含量變化

生物菌劑接種量對(duì)發(fā)酵溫度的變化，如圖1所示，從數(shù)據(jù)變化可以看出，各處理溫度變化均高于對(duì)照。隨著菌劑接種量的增加，溫度增幅最大，T1、T2、T3處理最高溫度分別為46.5 ℃、48.2 ℃、50 ℃，處理T3發(fā)酵溫度增幅最大。不同生物菌劑接種量黃腐酸含量變化，如圖2所示，處理T1、T2、T3發(fā)酵后黃腐酸含量均高于對(duì)照，分別為15%、18.4%、19.2%，處理T3黃腐酸含量最高。

2.1.2 發(fā)酵前后有效活菌數(shù)變化

生物菌劑接種量對(duì)發(fā)酵前后有效活菌數(shù)的影響，見(jiàn)表2，從表發(fā)酵前后有效活菌數(shù)變化，反映隨著菌劑接種量增加，菌株利用物料速度加快，活菌數(shù)增幅更快更多，物料分解效率越高。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，隨著菌劑接種量增加，菌劑生長(zhǎng)加快，物料營(yíng)養(yǎng)很快被消耗，產(chǎn)熱促進(jìn)溫度上升，提升物料的分解效率，促使黃腐酸含量與有效活菌數(shù)快速增長(zhǎng)。但是，處理T2、T3間數(shù)據(jù)差異不顯著，考慮到成本因素，菌劑最佳接種量5%～7%。

2.2 尿素添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程溫度與黃腐酸含量變化

有機(jī)物料發(fā)酵CN比一般在20～30較為合適，蘋(píng)果渣CN比52，有機(jī)碳含量較高，氮含量不足，影響菌劑生長(zhǎng)，不利于物料發(fā)酵。通過(guò)添加尿素，增加氮含量，降低CN比，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程。處理T1、T2、T3的CN比分別為34、25、20。尿素添加量對(duì)發(fā)酵溫度的變化如圖3所示，不同尿素添加量黃腐酸含量的變化如圖4所示，通過(guò)圖3、圖4數(shù)據(jù)變化可以看出，隨著尿素含量增加，溫度增幅愈大，黃腐酸含量增長(zhǎng)越多。其中，處理T2、T3效果最佳。

2.2.2 發(fā)酵前后有效活菌數(shù)變化

尿素添加量對(duì)發(fā)酵前后有效活菌數(shù)的影響，見(jiàn)表3，從表數(shù)據(jù)可以看出，隨著尿素添加量的增加，活菌數(shù)增長(zhǎng)迅速，合適的CN比可以促進(jìn)菌株迅速繁殖，加快發(fā)酵進(jìn)程。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，物料發(fā)酵較適CN比20-30，即尿素添加量2%～3%，物料發(fā)酵進(jìn)程加快，黃腐酸與活菌數(shù)含量最高。

2.3 物料含水率對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

2.3.1 發(fā)酵過(guò)程溫度變化

無(wú)聊含水率對(duì)發(fā)酵溫度的變化如圖5所示，觀察圖5各處理發(fā)酵溫度變化，處理T1、T2最高溫度分別為49.5 ℃、49 ℃，說(shuō)明40%、50%含水率比較有利物料發(fā)酵。處理T3、T4溫度增幅小，原因是含水率過(guò)高，不利于氧氣供給，影響了菌種生長(zhǎng)，物料分解率下降，產(chǎn)熱少。

2.3.2 發(fā)酵過(guò)程黃腐酸含量與活菌數(shù)變化

無(wú)聊含水率對(duì)黃腐酸含量的影響，如圖6所示，看圖6黃腐酸含量變化，各處理黃腐酸含量分別為16%、16.4%、13.8%、10.2%，處理T1、T2黃腐酸含量最高。發(fā)酵前后的活菌數(shù)變化，見(jiàn)表4，處理T1、T2發(fā)酵后活菌數(shù)最高，分別為4.18億/g、4.25億/g。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物發(fā)酵腐植酸較適含水率40%、50%，其中50%含水率的黃腐酸含量提前4～5d達(dá)到最高值，物料最佳含水率50%。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蘋(píng)果渣制備生物腐植酸發(fā)酵參數(shù)為：復(fù)合生物菌劑添加量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%。采用上述工藝參數(shù)，研究不同發(fā)酵時(shí)間黃腐酸與活菌含量變化。

2.4.1 發(fā)酵過(guò)程溫度變化

有機(jī)物料發(fā)酵分為發(fā)熱、中高溫與降溫、腐熟保肥階段。發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵溫度的變化，如圖7所示，各處理發(fā)酵最高溫度約50℃，無(wú)明顯區(qū)別，處理圖T1、T2因發(fā)酵時(shí)間短，缺少降溫階段的腐解。

2.4.2 發(fā)酵過(guò)程黃腐酸含量變化

從溫度變化來(lái)看，第11～17 d是發(fā)酵中高溫階段，從發(fā)酵18 d后，進(jìn)入降溫腐熟保肥階段，即腐植酸累積階段。發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃腐酸含量的影響，如圖8所示，發(fā)酵時(shí)間20 d，黃腐酸含量達(dá)到最高22%。

2.4.3 發(fā)酵前后活菌數(shù)變化

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵前后有效活菌數(shù)的影響，見(jiàn)表5，發(fā)酵15 d，物料活菌數(shù)低于發(fā)酵20、25、30 d，后三者活菌數(shù)差異不顯著。

綜上所述，發(fā)酵13天，物料溫度達(dá)到最高，發(fā)酵18天后進(jìn)入降溫腐熟保肥階段，即腐植酸累積期，考慮到肥效、黃腐酸與活菌含量因素，最佳發(fā)酵時(shí)間20～25 d。

3 結(jié) 語(yǔ)

利用蘋(píng)果渣發(fā)酵制取生物腐植酸，是一個(gè)極其復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程。微生物的生長(zhǎng)繁殖速度，直接決定了物料腐解程度，從而影響生物腐植酸生成的數(shù)量與質(zhì)量。因此，選擇創(chuàng)造最佳的微生物生長(zhǎng)環(huán)境，探求最優(yōu)生長(zhǎng)因子，是影響發(fā)酵好壞的重要因素。研究結(jié)果表明，發(fā)酵制備生物腐植酸工藝參數(shù)為：復(fù)合微生物菌劑接種量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%，發(fā)酵時(shí)間20～25 d，黃腐酸含量達(dá)22%，活菌含量5.6億/g。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈玉龍，曹文華.發(fā)酵法黃腐酸復(fù)混肥的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[J].化工礦物與加 工，2004，（2）.

[2] 司小明.發(fā)酵黃腐酸的分離提取及其對(duì)植物生理的影響[D].西安：西北 大學(xué)，2005.

[3] 陳松，丁立孝，張莉，等.發(fā)酵蘋(píng)果渣生產(chǎn)蛋白飼料的混合菌種篩選[J].食 品與發(fā)酵工業(yè)，2008，（2）.