徐水林，馬　偉，馬桂蘭，馬　花，馬衛(wèi)國，喬自林*（.西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州73000）

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蘭州黑白花奶牛耳緣組織細胞系的建立

徐水林1，2，馬偉1，馬桂蘭2，馬花1，馬衛(wèi)國1，喬自林1*
（1.西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；
2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州730010）

摘要：目的：通過耳緣組織細胞的分離培養(yǎng)和保存，在細胞水平上保存蘭州黑白花奶牛的種質(zhì)資源。方法：采用植塊法培養(yǎng)蘭州黑白花奶牛的耳緣組織原代細胞，經(jīng)傳代擴大培養(yǎng)后在液氮中冷凍保存，并對保存的耳緣組織細胞系進行了復蘇活力、形態(tài)、生長特性、微生物和內(nèi)、外源病毒因子檢查。結(jié)果：蘭州黑白花奶牛耳緣組織植塊培養(yǎng)時第4天可見細胞從植塊邊緣生長，第6天消化傳代后生長變快，形態(tài)以上皮型為主。冷凍保存的蘭州黑白花奶牛耳緣細胞系復蘇活力達95%，生長良好，生長曲線呈近“S”型，最大增殖濃度3.36×105/ml，對數(shù)生長期倍增時間為24 h，無菌、支原體和內(nèi)、外源病毒因子檢查為陰性。結(jié)論：成功建立了蘭州黑白花奶牛耳緣組織細胞系，使這一物種的種質(zhì)資源在細胞水平上得以長期保存。

關(guān)鍵詞：蘭州黑白花奶牛；耳緣組織；細胞系

蘭州黑白花奶牛是經(jīng)過四十多年的雜交選育培育出的一種適應于西北地區(qū)環(huán)境條件的乳用牛品種，是甘肅省地方牛品種荷斯坦奶?！拭C類群的重要組成部分，現(xiàn)為以蘭州市花莊奶牛繁殖場為核心的擴繁群為中心以及蘭州市城鄉(xiāng)結(jié)合部的散養(yǎng)分布特征［1，2］。自國家實施自然科技資源共享平臺項目《畜禽種質(zhì)資源收集、整理與保存》和《家養(yǎng)動物種質(zhì)資源平臺》以來，先后有幾百個品種的家養(yǎng)和野生畜禽的種質(zhì)資源在細胞或基因水平上得到了保存，蘭州黑白花奶牛仍以傳統(tǒng)的建立純種群和擴繁群方式，通過品種選育實施原位保存，投入大見效慢，實踐證明，實施體細胞保存投入小保存期長。蘭州黑白花奶牛是經(jīng)長期人工培育形成的甘肅地方品種，在體貌特征、生產(chǎn)性能和適應性等方面已形成了品種特征，其種質(zhì)資源應有多方面的保護措施，為此開展了其耳緣組織的細胞建系工作。

1　材料與方法

1.1材料

蘭州黑白花奶牛耳緣組織采自蘭州花莊奶牛繁殖場出生的新生小牛公母各兩頭。DMEM（Gibco，貨號：02- 5062EJ）、0.2%胰蛋白酶（蘭州百靈生物，批號：20140425）、胎牛血清（蘭州民海生物，批號：20140715，添加比例為10%）、DMSO（ThermoFisher，貨號：20688）、無菌和支原體檢查培養(yǎng)基（北京三藥）、病毒熒光抗體結(jié)合物（VMRD）、病毒檢查用細胞（本室保存）、雞和豚鼠紅細胞等。主要儀器設(shè)備有CO2培養(yǎng)箱（Thermo，3111型）、倒置相差顯微鏡（Olympus，CK40- 32PH型）、熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，IX71型）和液氮罐（樂山東亞）等。

1.2方法

1.2.1原代培養(yǎng)新生小牛剛采集完血液后剪下耳朵，標記個體性別后，放入裝有凍袋的泡沫箱中6 h內(nèi)帶到實驗室。先用純凈水流水反復搓洗表面污垢，在75%酒精中完全浸泡5～10 min。浸泡結(jié)束后在無菌PBS中用眼科鑷反復刮洗，期間不斷更換清洗器皿和PBS使表面徹底消毒。剪棄邊緣部分，留約2 cm大小的組織，剝?nèi)テつw連同軟骨剪成1 mm3大小的組織塊，每間隔2 mm均勻輔在細胞瓶的生長面，反轉(zhuǎn)細胞瓶使生長面朝上加入含血清的培養(yǎng)液，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，過夜后輕輕翻轉(zhuǎn)細胞瓶，使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中，從培養(yǎng)的第3天起觀察細胞的生長情況。原代培養(yǎng)標記為P0代，傳代后按P1、P2……標記。

1.2.2傳代培養(yǎng)和凍存顯微鏡下觀察有較多地組織塊邊緣見細胞長成單層后，用胰蛋白酶消化細胞在原培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)（即傳代比例1∶1）。此后細胞生長成致密單層后按1∶3比例傳代，到培養(yǎng)P3時擴大培養(yǎng)數(shù)量，在該代次對數(shù)生長期末期消化后按1.0× 106/ml左右密度在液氮中（- 196℃）凍存，凍存保護液為10%DMSO+20%胎牛血清+70%DMEM。每個個體的耳緣細胞凍存30支，每支裝量1 ml。

1.2.3細胞鑒定按文獻方法檢查復蘇活力［3］、觀察細胞形態(tài)、繪制生長曲線［4］、檢查無菌和支原體［5］以及致細胞病變病毒、血細胞吸附病毒和特異的病毒因子［6］。

2　結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)

蘭州黑白花奶牛耳緣組織原代培養(yǎng)時在第4天可見部分組織塊的邊緣有細胞長出，多為不規(guī)則形分散生長（如圖1a）。到第6天時大多數(shù)植塊邊緣有成片的單層細胞，以成纖維形細胞為主，細胞相互間隙較大，細胞并不致密（如圖1b）。

2.2傳代培養(yǎng)

對原代培養(yǎng)的細胞首次傳代以后細胞生長速度變快，P1代在48 h成致密單層細胞，此后按1∶3比例傳代時均在72 h成致密單層細胞，細胞間連接緊密，以不規(guī)則成纖維狀細胞為主，也見有規(guī)則扁平的上皮樣細胞，視野中漂浮的死細胞極少（如圖1c），說明細胞活力高長勢好。

圖1　蘭州黑白花奶牛耳緣細胞系形態(tài)圖（a.原代培養(yǎng)第4天；b.原代培養(yǎng)第6天；c.P3，48 h）

2.3細胞凍存

對P3代細胞在液氮中凍存的平均密度為1.24× 106/ml，平均活力為97.5%。

2.4細胞鑒定

2.4.1復蘇活力耳緣細胞平均復蘇活力為95.2%，比凍存前略有下降。

2.4.2細胞形態(tài)復蘇的細胞培養(yǎng)48 h時長成較致密單層，按1∶3比例傳代后72 h長厲致密單層細胞，形態(tài)與凍存前的P3代相似。

2.4.3生長特征蘭州黑白花奶牛耳緣細胞的生長曲線呈“S”型，如圖2所示?？梢钥闯?，前24 h為潛伏期，細胞增殖較慢，說明低密度接種時潛伏期長。48～120 h為對數(shù)生長期，144 h進入平臺期直到216 h才進入衰退期，細胞維持培養(yǎng)時間較長。平均最大增值濃度為3.36×105/ml，群體倍增時間較長為41.8 h，而對數(shù)生長期的倍增時間較短只有24 h。

圖2　蘭州黑白花奶牛耳緣細胞系的生長曲線圖

2.4.4無菌檢查培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基檢查細菌和真菌培養(yǎng)7 d均沒有菌生長。

2.4.5支原體檢查培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基在支原體液體基中培養(yǎng)14 d顏色沒有變化，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d也沒有菌落生長；細胞凍融處理的上清液接種Vero細胞上熒光染色后，只觀察到細胞核有藍色熒光其他部位沒有熒光，如圖3。

圖3　蘭州黑白花奶牛耳緣細胞系支原體熒光法檢查結(jié)果圖（a.陽性對照；b.陰性對照；c.被檢細胞）

2.4.6內(nèi)、外源病毒因子檢查細胞培養(yǎng)直接觀察和血吸附試驗細胞形態(tài)正常，無血細胞吸附現(xiàn)象；細胞凍融處理的上清液接種Vero和MRC- 5細胞培養(yǎng)觀察和血凝試驗的兩種細胞形態(tài)均正常，血凝試驗均為陰性；用熒光抗體結(jié)合物檢查BVDV、REO和BPV，均沒有病毒的特異性熒光產(chǎn)生，說明保存的細胞沒有被內(nèi)、外源病毒污染，如圖4。

圖4　蘭州黑白花奶牛耳緣細胞系病毒檢查結(jié)果

3　結(jié)論

畜禽種質(zhì)資源是以物種為單元的遺傳多樣性資源，是關(guān)系到畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生物多樣性以及人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。動物的體細胞包含物種的全部遺傳信息，構(gòu)建畜禽種質(zhì)資源細胞庫，可實現(xiàn)對種質(zhì)資源的永久保存［7］。蘭州黑白花奶牛是甘肅省優(yōu)良地方品種，用植塊法培養(yǎng)的新生小牛耳緣組織細胞生長良好，沒有細菌、真菌、支原體和內(nèi)、外源病毒污染，使這一重要物種的種質(zhì)資源在細胞水平上得以保存，也為相關(guān)學科研究提供理想的生物材料。

參考文獻：

［1］趙國琳.甘肅省地方畜禽品種資源［M］.蘭州：甘肅科學技術(shù)出版社，2013.

［2］孫連科.蘭州黑白花奶牛泌乳規(guī)律及其分布［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，1988，（06）：7.

［3］喬自林，馮玉萍，李明生，等.蘭州大尾羊耳緣組織成纖維細胞系的建立［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2012，（10）：64-68.

［4］李玲，李雪峰.細胞生物學實驗［M］.長沙：湖南科學技術(shù)出版社，2003.

［5］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典三部2010年版［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典三部2010年版［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［7］中國科學院生物多樣性委員會.生物多樣性（譯）［M］.北京：中國科學技術(shù)出版社，1990.

（編輯：高真貞）

中圖分類號：S826.89

文獻標識碼：B

文章編號：1006- 799X（2016）05- 0065- 03

基金項目：蘭州市科技計劃項目（2006- 2- 59），甘肅省科技支撐項目（144FKCA082）。

作者簡介：徐水林（1983-），男，甘肅臨洮人，工程師，主要從事動物細胞培養(yǎng)技術(shù)研究。

通訊作者：喬自林（1976-），男，甘肅永靖人，高級實驗師，主要從事動物細胞培養(yǎng)技術(shù)研究。