邵紅霞　萬長亮（內蒙古精神衛(wèi)生中心呼和浩特010010）

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在線柱切換高效液相色譜法測定人血清中奧氮平、氯氮平和N-去甲氯氮平的濃度

邵紅霞萬長亮（內蒙古精神衛(wèi)生中心呼和浩特010010）

摘要：目的：建立簡單并能同時測定人血清中奧氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平的血藥濃度方法。方法：采用在線柱切換高效液相色譜法，紫外檢測器檢測，血清直接進樣分析血清中奧氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平的濃度。結果：奧氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平均具有良好的專屬性、線性、精密度、回收率和穩(wěn)定性。結論：在線柱切換高效液相色譜法簡單、準確，適用于奧氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平血藥濃度監(jiān)測。此方法可以血清直接進樣分析，省去了煩瑣的預處理，同時保證檢測的準確性。

關鍵詞：奧氮平氯氮平去甲氯氮平高效液相

奧氮平是（clozapine）是臨床常用的傳統(tǒng)非典型抗精神病藥，在體內吸收迅速，具有強大的鎮(zhèn)靜催眠作用。與經(jīng)典抗精神病藥相比極少見錐體外系反應。奧氮平（olanzapine）是在氯氮平的基礎上開發(fā)的一種新型非典型抗精神病藥，具有與氯氮平相似的化學結構和藥理作用。但克服了氯氮平易引起粒細胞缺乏等不良反應［1］。非典型抗精神病藥對精神分裂癥的療效已取得確認，但其藥物代謝動力學特點及嚴重的不良反應，要求應用該類藥物時采取個體化給藥方案［2］。氯氮平和奧氮平均為血藥濃度與藥理作用具有相關性，血藥濃度和靶組織的濃度具有顯著相關且藥動學個體差異大的藥物，需要檢測血藥濃度作為調整給藥方案的客觀依據(jù)。N-去甲氯氮平（N-demethyl clozapine）是氯氮平在人體內的代謝產(chǎn)物，仍然有較強的藥理作用，同時檢測氯氮平和去甲氯氮平更能準確反映血藥濃度與療效的相關性。

氯氮平和奧氮平的血藥濃度監(jiān)測多采用離線前處理后再進行高效液相色譜法監(jiān)測分析［3～4］，但是由于血清前處理過于煩瑣，提取過程中容易乳化，人為干擾因素多，影響檢測結果，本課題采用前處理柱（MAYI-ODS柱）聯(lián)合在線柱切換高效液相色譜法，這種方法一方面省去了煩瑣的預處理，另一方面避免生物樣品在預處理過程中成分改變或損失而影響檢測，使治療藥物監(jiān)測更簡單快捷，結果更準確。

1　材料

1.1試劑與試藥：氯氮平標準品來源于中國藥品生物制品檢定所（批號：6104-71-8），N-去甲氯氮平標準品來源于SIGMA公司（美國，批號O253750），奧氮平標準品來源于多倫多化學研究有限公司（加拿大，批號：100323-200201）。奧氮平片來源于美國禮來公司，氯氮平片來源于江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司。甲醇、乙腈來源于天津化學試劑二廠色譜技術開發(fā)公司，均為色譜純。冰乙酸來源于天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心，正丁胺來源于天津市光復精細化工研究所，均為色譜純。

1.2實驗儀器：日本島津LC-20A高效液相色譜儀，島津AUWIZOD型十萬分之一天平，B600B型醫(yī)用低速離心機（白洋離心機廠），XW-80A型旋渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠），BL6-180型超聲波清洗機（上海比朗儀器有限公司），DH-101型電熱恒溫鼓風干燥箱（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司），GM-0.33II型隔膜真空泵（天津市騰達過濾器件廠）。

2　方法與結果

2.1對照品溶液的制備：精密稱奧氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平對照品分別5.02mg、5.00mg、5.01mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得0.5mg/mL母液。制得母液置于冰箱冷藏備用。

2.2供試品的制備：空白血清的制備，收集正常人（未服藥物）的全血，經(jīng)高速離心機離心，提取血清，得空白血清。精密吸取“2.1”項下各對照品溶液，加甲醇稀釋成梯度濃度，奧氮平梯度濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/mL，氯氮平梯度濃度為1.5、3、6、12、24μg/mL，N-去甲氯氮平梯度濃度為1.5、3、6、12、24μg/ mL。用上述梯度濃度的甲醇溶液加入空白血清，得到含有一定濃度藥物的血清。

2.3色譜條件：本課題采用在線柱切換高效液相色譜法測定人血清中奧氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平的濃度，柱切換高效液相色譜的結構示意圖見圖1，如圖所示當六通閥（6-port valve）如圖1中A圖位置時，用自動進樣器（Auto-sampler）血清直接進樣，由流動相C將樣品導入，流動相D將樣品稀釋后進入MAYI柱（MAYI Column），藥物分子被MAYI柱保留，蛋白質等雜質不被保留而流入廢液，當大部分藥物被保留，而蛋白質等雜質被去除后，切換六通閥（由軟件自動控制），切換后高效液相色譜的結構示意圖見圖1中的B圖，由流動相A和流動相B組成的流動相反相經(jīng)過MAYI柱，將保留在MAYI柱上的藥物洗脫下來，后經(jīng)色譜柱（Column）分離，檢測器（Detecter）檢測。色譜柱為SHIMADZU Shim-pack VP-ODS（150L×4.6，NO.5012023）色譜柱，流動相A為水︰正丁胺︰冰乙酸（v∶v∶v）=200∶3∶1，流速0.5mL/min；流動相B為乙腈，流速0.5mL/min；流動相C為水∶乙腈∶正丁胺∶冰乙酸（v∶v∶v）=200∶10∶1.5∶1.5，流速0.1mL/min；流動相D為水∶乙腈∶正丁胺∶冰乙酸（v∶v∶v）=200∶10∶1.5∶1.5，流速0.8mL/min。600μL血清直接進樣，檢測波長為254nm，切換時間為3min，保留時間：奧氮平保留時間為12.6min，氯氮平保留時間為8.7min，N-去甲氯氮平保留時間為6.7min。色譜圖見圖1。

2.4線性關系：按“2.2”項下制備供試品溶液，得到梯度濃度血清溶液，即奧氮平梯度濃度為4、8、16、32、64ng/mL，氯氮平梯度濃度為75、150、300、600、1200ng/mL，N-去甲氯氮平梯度濃度為75、150、300、600、1200ng/mL。血清600μL直接進樣，記錄色譜圖，測得峰面積。分別以峰面積為縱坐標（Y），以血清藥物濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程和線性相關系數(shù)：N-去甲氯氮平：Y=463.24X-1200.3，R2=0.9992；氯氮平：Y=361.05X-803.04，R2=0.9994；奧氮平：Y=907X-82，R2=0.9998結果表明，奧氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平檢測濃度分別在4～64ng/mL、75～1200ng/mL、75～1200ng/mL范圍內呈良好線性關系。

2.5最低定量限：如以標準曲線最低濃度為最低檢測限，血清中奧氮平、氯氮平和N-去甲氯氮平的最低定量限為2、15、15ng/mL。

2.6系統(tǒng)精密度和準確度：按“2.2”項下制備供試品溶液的三個梯度濃度即奧氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平的血清濃度分別為4、16、64ng/mL，75、300、1200ng/mL，75、300、1200ng/mL。600μL血清進樣，每天測定5次，連續(xù)測定5d，記錄峰面積，考察日內、日間精密度。同法平行制備6份血清濃度梯度考察該方法回收率。結果見表1。結果表明該方法的日內精密度和日間精密度都符合藥典附錄生物樣品定量分析方法驗證指導原則的規(guī)定，變異系數(shù)低于15%，方法回收率結果一致、精密、可重現(xiàn)。

2.7樣品穩(wěn)定性試驗：按“2.2”項下制備供試品溶液，制備奧氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平的血清濃度分別為16、300、300ng/mL的血清溶液，在上述色譜條件下，分別在制備樣品后的0h、1h、2h、4h、8h、24h進行測定，記錄色譜圖，結果如表2，樣品峰面積的RSD分別為7.9%、4.2%、4.5%，說明樣品于血清中24h內穩(wěn)定。

2.8服藥患者血清樣品測定：選取服用奧氮平和氯氮平的患者各一例，晨時未服藥前肘靜脈采血5mL，離心取血清，按“2.2.3”項下色譜條件600μL血清進樣，用外標法計算即得。奧氮平血藥濃度為19.2ng/mL，氯氮平和N-去甲氯氮平血藥濃度分別為375.9ng/mL和258.4ng/mL。

表1　精密度和回收率試驗結果Tab1 Results of precision and recovery test

3　討論

本研究采用Shim-pack MAYI-ODS預處理柱，它是以甲基纖維素涂覆固定的反相前處理柱，使用甲基纖維素修飾多空硅膠，并將其內表面以ODS修飾，外表面涂覆的甲基纖維素可防止蛋白質的吸附，而小分子通過與ODS基團間的疏水作用被內表面保留。柱切換技術連同高效液相色譜已經(jīng)被廣泛應用［5～8］，前處理柱連同柱切換技術，可以實現(xiàn)血漿等生物樣品的直接進樣，免去了樣品人工預處理，預處理一般用乙醚等有機溶劑提取，易發(fā)生乳化現(xiàn)象，影響檢測。本研究中的方法回收率結果偏差較大，可能是因為藥物與血清中蛋白結合率偏高或藥物與柱填料內表面有較低的親和力導致，為獲得高回收率，可以通過優(yōu)化導入溶劑，削弱蛋白與藥物分子間的結合，在線稀釋也是改善回收率的有效方法。本研究采用同一個色譜條件測定奧氮平和氯氮平、N-去甲氯氮平，同一色譜條件測定多種藥物在抗精神病藥物血藥濃度監(jiān)測中十分常見［9～11］，免去了不同藥物更換色譜條件的操作，省去了大量時間。

總之，本研究為氯氮平和奧氮平的血藥濃度監(jiān)測提供了簡單、快捷、準確的方法，為臨床合理用藥、減少不良反應提供依據(jù)，有利于提高精神分裂癥患者的生活質量。

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Simultaneous determination of olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine in plasma by on-line column-switching highperformance liquid chromatography

Shao Hongxia Wan Changliang（Inner Mongolia mental health center，Hohhot 010010，.）

Abstract：Objective：To establish a simple method for determining the concentration of olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine. Method：Simultaneous determination of olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine in plasma by on-line column-switching highperformance liquid chromatography with UV detector，and allows the injection of serum.Results：Olanzapine，clozapine and clozapine N-demethyl have good specificity，linearity，precision，recovery and stability in determination by HPLC.Conclusion：On-line columnswitching high performance liquid chromatography is a simple，accurate method and suitable for olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine concentrations monitoring in plasma. this method allows the injection of serum，eliminating the tedious pretreatment，at the same time ensure the accuracy of detection.

Key words：Olanzapine ClozapineHPLC

中圖分類號：R96

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8351（2016）06-0001-03