張小濤，侯宏衛(wèi)，陳 歡，劉 勇，王 安，胡清源

（1.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州 450001；2.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院應(yīng)用技術(shù)研究所，合肥 230088）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的苯并[a]芘

張小濤1,2，侯宏衛(wèi)1*，陳 歡1，劉 勇2，王 安2，胡清源1,2

（1.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州 450001；2.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院應(yīng)用技術(shù)研究所，合肥 230088）

為準(zhǔn)確、快速地測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的含量，建立了液相色譜-大氣壓光電離-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的方法。方法對(duì)助劑流速、萃取溶劑、煙支數(shù)和色譜質(zhì)譜測(cè)定的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)甲苯流速為80 μL/min，環(huán)己烷作為萃取溶劑，Agilent PAH（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）作為色譜柱，95%的乙腈和5%的水為流動(dòng)相，色譜柱溫度為40 ℃，方法檢出限為0.15 ng/mL，苯并[a]芘回收率100%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，分析時(shí)間為6 min，與現(xiàn)行的GC-MS測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比大大縮短了分析時(shí)間。該方法具有靈敏度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可以顯著地提高分析的通量。

主流煙氣；苯并[a]芘；大氣壓光電離；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

苯并[a]芘{B[a]P}在環(huán)境中占所有多環(huán)芳烴1%～20%，可通過(guò)皮膚、呼吸道、消化道等被人體吸收，在體內(nèi)的代謝活化產(chǎn)物能引起肝、皮膚、肺等部位的腫瘤，對(duì)生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)都具有一定毒性[1]。卷煙主流煙氣中B[a]P的含量為5～40 ng/支煙[2-3]，霍夫曼名單也將其列入其中[4]，準(zhǔn)確檢測(cè)其含量對(duì)于吸煙危害性評(píng)價(jià)具有較為重要的意義。目前，卷煙主流煙氣中B[a]P的測(cè)定方法主要有：液相色譜法（HPLC）[5-6]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS或者GC-MS/MS）[7-12]。其中高效液相色譜-熒光檢測(cè)法最為常見(jiàn)（HPLC-FL），熒光檢測(cè)器具有較高的靈敏度，其檢出限可以達(dá)到ng級(jí)別，但是HPLC-FL檢測(cè)方法的運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)，且較多的方法未應(yīng)用內(nèi)標(biāo)，結(jié)果受前處理過(guò)程的影響比較大。GC/MS由于分離效果及色譜重現(xiàn)性好被廣范應(yīng)用于卷煙主流煙氣中B[a]P分析，GB/T21130—2007[13]就是采用GC/MS測(cè)定卷煙主流煙氣中的B[a]P；但是，GB/T 21130—2007方法的前處理比較復(fù)雜，且分析時(shí)間比較長(zhǎng)（約1 h）。最近，液相色譜-大氣壓光電離離子源-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-APPI-MS/MS）被用于復(fù)雜體系中多環(huán)芳烴的分析[14-17]。APPI使用紫外線對(duì)樣品進(jìn)行電離，適合于低極性化合物的電離，尤其是在引入摻雜劑后可以大幅度提高B[a]P的電離效率，進(jìn)而提高靈敏度。如Ding等[14]建立了LCAPPI-MS/MS測(cè)定卷煙主流煙氣中的10種致癌性的多環(huán)芳烴的方法，方法靈敏度高、專(zhuān)一性強(qiáng)，這說(shuō)明LC-APPI-MS/MS適用于卷煙主流煙氣中B[a]P的分離和分析，但是其需要采用兩根色譜柱才能實(shí)現(xiàn)對(duì)10種多環(huán)芳烴的分離，Hypersil多環(huán)芳烴色譜柱（Thermo Fisher公司）分離其中的6個(gè)目標(biāo)物；Xterra C18色譜柱（Waters公司）分離另外4個(gè)目標(biāo)物。另外由于卷煙性質(zhì)（煙絲質(zhì)量、抽吸口數(shù)等）的差異，一支煙的結(jié)果不能很好的代表整個(gè)卷煙樣品。

本試驗(yàn)針對(duì)卷煙主流煙氣中的B[a]P，利用LCAPPI-MS/MS，以d12-B[a]P作為內(nèi)標(biāo)，建立高靈敏度、高通量的LC-APPI-MS/MS分析卷煙主流煙氣中B[a]P的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

B[a]P標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、氘代B[a]P（d12-BaP，純度≥98%），購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；硅膠柱（500 mg，3 mL），購(gòu)自Agilent公司；乙腈和環(huán)己烷（色譜純）購(gòu)自美國(guó)TEDIA有限公司，試驗(yàn)中所用的水為去離子水。

安捷倫1200快速液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配備有自動(dòng)進(jìn)樣器 G1367D，二元溶劑泵G1312B，柱溫箱 G1316B。API 5500三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司），配有光電離離子源（APPI），數(shù)據(jù)采集與處理在Analyst 1.5.1軟件上實(shí)現(xiàn)。L-2130泵（日本日立高新技術(shù)公司）和SM450直線式吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean公司）。

1.2 樣品處理

樣品平衡：樣品卷煙在溫度為（22±1）℃和相對(duì)濕度為（60±2）%條件下平衡48 h；卷煙樣品抽吸按GB/T 19609[18]的規(guī)定收集2支卷煙的總粒相物。

將劍橋?yàn)V片放入25 mL三角瓶中，加入20 μL的1 μg/mL的苯并[a]芘氘代內(nèi)標(biāo)，再加入10 mL環(huán)己烷，振蕩萃取60 min。萃取液經(jīng)硅膠柱固相萃取，然后用6 mL環(huán)己烷洗脫，收集濾液和洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，復(fù)溶于1 mL的乙腈，待測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg的B[a]P和d12-B[a]P固體于兩個(gè)10 mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度，分別得到1 mg/mL的B[a]P和d12-B[a]P儲(chǔ)備液。然后用儲(chǔ)備液稀釋配制不同濃度的B[a]P標(biāo)準(zhǔn)溶液和工作溶液。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent PAH色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：水，乙腈；色譜柱溫度為40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。摻雜劑：甲苯，流速為80 μL/min；洗脫條件：乙腈：水，95：5（V/V），流速為300 μL/min，分析時(shí)間為6 min。

質(zhì)譜條件：光電離離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描方式；電噴霧電壓：700 V；霧化氣：75 psi；氣簾氣：15 psi；輔助加熱氣：50 psi；溫度：600 ℃；射入電壓：10 V；碰撞能：9 eV；去簇電壓：110 V；駐留時(shí)間：50 ms。內(nèi)標(biāo)離子對(duì)，265.2～263.1，B[a]P定性離子對(duì)，253.2～251.1，定量離子對(duì)：253.2～252.1。整個(gè)分析過(guò)程由Applied Biosystems Analyst 1.5.1 軟件來(lái)控制。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

配對(duì)樣品t檢驗(yàn)采用IBM SPSS Statistic 20.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 助劑流速的優(yōu)化

在APPI源使用過(guò)程中，往往需要使用助劑來(lái)提高離子化效率，助劑作為光電離的媒介，主要通過(guò)交換電荷或質(zhì)子轉(zhuǎn)移幫助待測(cè)物形成離子[19-20]。先前研究表明助劑的流速對(duì)分析靈敏度有很大的影響[21]，因此考察了甲苯的流速（40，60，80和100 μL/min）對(duì)B[a]P測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，甲苯的流速對(duì)B[a]P測(cè)定結(jié)果有顯著影響，當(dāng)甲苯流速為80 μL/min時(shí)，B[a]P的響應(yīng)最高，因此最終選擇了80 μL/min作為甲苯的流速。

圖1 甲苯流速對(duì)離子化效率的影響Fig. 1 The influence of flow rate of toluene on ionization efficiency

2.2 流動(dòng)相的選擇

Syage等[22]研究結(jié)果表明，流動(dòng)相對(duì)于B[a]P的離子化效率存在一定影響，因此本試驗(yàn)對(duì)甲醇和水（V甲醇:V水=95:5）、乙腈和水（V乙腈:V水=95:5）作為流動(dòng)相時(shí)B[a]P的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。正如文獻(xiàn)報(bào)道的，對(duì)于質(zhì)譜而言，使用甲醇作為流動(dòng)相可以增加B[a]P的離子化效率，但是當(dāng)樣品中B[a]P的含量增高時(shí)，色譜峰形展寬，分析時(shí)間明顯延長(zhǎng)（圖2a）?？紤]到主流煙氣樣品比較復(fù)雜，為了改善峰形和縮短分析時(shí)間、減少有機(jī)溶劑消耗，本試驗(yàn)最終選擇乙腈和水作為流動(dòng)相，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[13]，典型的色譜圖如圖2b所示。

2.3 萃取溶劑的選擇

圖2 不同流動(dòng)相B[a]P的提取離子圖（a，V甲醇:V水=95:5；b，V乙腈:V水=95:5）Fig. 2 The extract ion chromatogram of B[a]P （a Methanol and water were used as mobile phase. b Acetonitrile and water were used as mobile phase）

目前文獻(xiàn)報(bào)道的用于萃取卷煙主流煙氣中 B[a]P的溶劑有甲醇[5]、乙腈[14]、二氯甲烷[16]、環(huán)己烷[6]等?？紤]到所使用的流動(dòng)相為乙腈和水，因此本試驗(yàn)對(duì)乙腈和環(huán)己烷兩種有機(jī)溶劑進(jìn)行了比較。以3R4F卷煙作為試驗(yàn)卷煙，按照GB/T 19609的方法捕集2支煙的總粒相物，分別用乙腈和環(huán)己烷萃取、凈化和檢測(cè)，其結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)環(huán)己烷的萃取效率明顯高于乙腈。此外，由于乙腈的極性比較強(qiáng)，在萃取出B[a]P的同時(shí)也會(huì)把一些極性物質(zhì)萃取出來(lái)，因此會(huì)干擾后面的色譜分離；而環(huán)己烷提取B[a]P的效率比較高[2]，且干擾比較少。因此本試驗(yàn)選擇了環(huán)己烷作為萃取溶劑。

圖3 不同萃取溶劑對(duì)B[a]P的萃取效率Fig. 3 The extraction effect of different solvents on B[a]P

2.4 煙支數(shù)的選擇

采用劍橋?yàn)V片分別收集了2支和5支參比卷煙（中國(guó)煙草總公司自制）的總粒相物，分別進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，并對(duì)測(cè)試的結(jié)果進(jìn)行了比較分析，其平均值分別為7.24和7.37 ng/支，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.39%和7.19%，這說(shuō)明2支煙和5支煙粒相物分析的結(jié)果差異很小，為了減少樣品制備的時(shí)間和減少有機(jī)溶劑的消耗，最終選擇了2支煙。

2.5 線性方程和檢出限

吸取2，5，10，20，40和60 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和振蕩萃取液固相萃取后的樣品各2 μL，注入LC-APPI-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。B[a]P的線性回歸方程為y=0.187x+0.0105，線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9993。利用信噪比的方法計(jì)算方法的定量限和檢出限，目標(biāo)峰十倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，三倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限。B[a]P的定量限和檢出限分別為0.50 ng/mL和0.15 ng/mL，B[a]P的保留時(shí)間為3.02 min。

2.6 方法的回收率和重復(fù)性

采取樣本加標(biāo)的方法獲得方法的加標(biāo)回收率，總共選取了3個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定5次，得到的方法的回收率和重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表1。B[a]P的回收率在100%～107%，RSD小于10%，證明方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性結(jié)果較好。

表 1 B[a]P的回收率和重復(fù)性Table 1 The recovery and repeatability of B[a]P

2.7 方法應(yīng)用

利用建立的LC-APPI-MS/MS方法測(cè)定了12個(gè)國(guó)產(chǎn)卷煙樣品主流煙氣中B[a]P的釋放量，結(jié)果見(jiàn)表2。另外，對(duì)本方法測(cè)試結(jié)果和國(guó)標(biāo)測(cè)試方法的結(jié)果進(jìn)行了配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，sig值大于0.05，說(shuō)明兩種方法測(cè)定結(jié)果相差不大，符合定量分析要求。

表2 GB/T 21130—2007規(guī)定的GC/MS與本方法的比較Table 2 Method comparison with the GC-MS method of GB/T 21130-2007

3 討 論

B[a]P是存在于卷煙主流煙氣中的對(duì)人體具有致癌或致畸作用的污染物質(zhì)，因此快速測(cè)定煙氣中的B[a]P對(duì)卷煙質(zhì)量監(jiān)控和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有十分重要的意義。本研究針對(duì)卷煙主流煙氣粒相物中B[a]P，優(yōu)化了甲苯流速、煙支使用數(shù)目，建立了LCAPPI-MS/MS測(cè)定主流煙氣中B[a]P的高靈敏和高選擇性的方法。

卷煙煙氣總粒相物中B[a]P的測(cè)定方法[13]采用的是轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)，共捕集20支煙的總粒相物，Ding等[14]報(bào)道的方法中采用一支煙的粒相物來(lái)測(cè)定10種多環(huán)芳烴，但由于卷煙自身性質(zhì)的差異，1支煙的結(jié)果不能很好的代表卷煙樣品。本研究采用2支煙可以減少有機(jī)溶劑的使用量和提高分析通量。標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21130—2007規(guī)定的GC/MS測(cè)定卷煙主流煙氣中B[a]P的方法分析一個(gè)樣本需要大概50 min，而本研究建立的LC-APPI-MS/MS方法分析1個(gè)樣本只需要6 min，大大提高了分析的通量。

本方法具有高的檢測(cè)靈敏度，方法檢測(cè)限為0.15 ng/mL，GB/T 21130—2007規(guī)定的GC/MS方法的檢測(cè)限為1.44 ng/mL[13]，與GC-MS方法相比其檢測(cè)靈敏度提高了約10倍。此外利用建立的LCAPPI-MS/MS方法和GB/T 21130—2007規(guī)定的GC/MS法分別測(cè)定了12個(gè)國(guó)產(chǎn)卷煙樣品主流煙氣B[a]P并進(jìn)行了配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，sig值大于0.05，說(shuō)明兩種方法的測(cè)定結(jié)果相差不大，LC-APPIMS/MS方法可以滿足煙氣中B[a]P的檢測(cè)要求。

建立的LC-APPI-MS/MS測(cè)定卷煙主流煙氣中B[a]P的方法具有較好的選擇性與較高的準(zhǔn)確性，大氣壓光電離離子源的應(yīng)用提高了B[a]P的離子化效率，從而提高方法的靈敏度，可用于卷煙主流煙氣中B[a]P的快速測(cè)定。

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Determination of Benzo[a]pyrene in Mainstream Cigarette Smoke by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiaotao1,2, HOU Hongwei1*, CHEN Huan1, LIU Yong2, WANG An2, HU Qingyuan1,2

(1. China National Tobacco Quality Supervision & Test Centre, Zhengzhou 450001, China; 2. Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, CAS, Hefei 230088, China)

In order to accurately and rapidly determine B[a]P content in mainstream cigarette smoke, a liquid chromatographyatmospheric pressure photoionization-tandem mass spectrometry (LC-APPI-MS/MS) for determination B[a]P in mainstream cigarette smoke was developed and validated. The flow rate of toluene, extraction solvent, number of cigarette and the conditions of liquid chromatography and mass spectrometry were optimized. The results indicated that when the flow rate of toluene was 80 μL/min, cyclohexane was used as extraction solvent, chromatographic separation was achieved by using an Agilent PAH column (100 mm×2.1 mm, 3.5 μm) at 40 ℃, and 95% acetonitrile and 5% water was selected as the mobile phase, the detection limit of the method was 0.15 ng/mL, the recovery of B[a]P was 100%-107%, the relative standard deviation was less than 10%, and the analysis time was 6 min. Compared with the existing GC-MS method for the determination of B[a]P in mainstream cigarette smoke, this method shortened the analysis time. The proposed method has the advantages of high sensitivity and short analysis time etc., which can significantly improve the throughput.

mainstream cigarette smoke; benzo[a]pyrene; APPI; LC-MS/MS

TS41+1

1007-5119（2016）06-0077-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.014

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于代謝組學(xué)的頭頸癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及其與煙氣苯并芘的關(guān)系研究”（21277174）

張小濤（1988-），男，博士研究生，主要從事吸煙與健康、生物標(biāo)志物研究工作。E-mail：zhangxiaotao9209@163.com *通信作者，E-mail：qsfctc@163.com

2016-04-11

2016-07-31