曹曉菲,豐圣偉,宋新偉,徐　滌

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，海洋生命學院，山東青島　266003)

小球藻(Chlorella vulgaris)抗銨品系的紫外誘變選育*

曹曉菲,豐圣偉,宋新偉,徐滌**

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，海洋生命學院，山東青島266003)

摘要：【目的】獲得耐受高銨濃度的優(yōu)良養(yǎng)殖小球藻(Chlorella vulgaris)品系，可以有效防止其在養(yǎng)殖過程中被輪蟲，纖毛蟲等污染生物吞食。 【方法】首先對小球藻進行紫外線誘變，然后用高濃度NH4HCO3作為篩選壓力對其進行篩選?！窘Y果】篩選到具有生長優(yōu)勢的小球藻突變株B4和C6，培養(yǎng)12 d，在NH4HCO3濃度為800 mg/L、1 000 mg/L、1 200 mg/L條件下， B4和C6的生物量比出發(fā)藻株分別提高41.18%和9.54%，32.64%和29.41%，37.74%和22.85%； 對比出發(fā)藻株,B4和C6的最大光能轉化效率有顯著提高?！窘Y論】突變株B4和C6在高銨培養(yǎng)條件下更能顯示生長優(yōu)勢，且它們的生長優(yōu)勢可能來自光合效率的提高。

關鍵詞：小球藻紫外誘變抗高銨光能轉化效率

0引言

【研究意義】小球藻(Chlorella vulgaris)為單細胞綠藻，其生長速度快，能利用光能自養(yǎng)也能在異養(yǎng)條件下生長繁殖[1]。小球藻蛋白含量可高達50%以上，而且其必需氨基酸組成符合聯(lián)合國糧農組織的標準[2]。除了蛋白質以外，小球藻還含有豐富的維生素(VA、VB12、VC)、礦物質和脂肪酸[3]。同時，豐富的葉綠素、有生物活性的糖蛋白以及生長因子，使得小球藻除了具有豐富的營養(yǎng)價值外還具有多種醫(yī)療功能，小球藻也成為理想的健康食品，具有較高的經(jīng)濟價值和培養(yǎng)價值[4]。但是,淡水小球藻在開放的養(yǎng)殖環(huán)境中易受到輪蟲、纖毛蟲等原生動物及其他微型藻類的影響,故小球藻生物污染的防治成為其規(guī)?；B(yǎng)殖所面臨的主要問題之一[5]?！厩叭搜芯窟M展】據(jù)報道，在開放式培養(yǎng)過程中,大約4～5 d 培養(yǎng)液中就會出現(xiàn)吞食小球藻的輪蟲,嚴重的還可能導致整個培養(yǎng)的失敗[6-7]。目前用于抑制或殺滅敵害生物的藥物有化學藥品和中草藥兩大類[8],但往往敵害生物對藥物的耐受力優(yōu)于培養(yǎng)的藻細胞,因此效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn),輪蟲對于培養(yǎng)基中的銨濃度較敏感，例如文獻[9]報道，當培養(yǎng)基中碳銨濃度為250 mg/L時,24 h內輪蟲數(shù)量就可下降到0。相反，小球藻對銨氮濃度的耐受性較高。因此通過誘變和高銨濃度篩選的方式選育抗高銨濃度的小球藻品系是實現(xiàn)小球藻安全高產的簡便而有效的途徑。紫外誘變育種是使用最早的物理誘變方法，紫外照射可引起DNA與蛋白質的交聯(lián)、DNA鏈的斷裂以及嘧啶二聚體的形成,因其操作簡便、干凈、快捷，在工業(yè)微生物和農業(yè)植物中得到廣泛的應用[10]。將紫外誘變與人工選擇相結合即可培育出滿足實際生產需求的各種優(yōu)良品種，例如付峰等[11]利用紫外誘變對龍須菜的果孢子進行誘變并篩選得到優(yōu)勢的突變株；葉麗等[12]對三角褐指藻進行紫外誘變，并獲得脂肪酸優(yōu)于出發(fā)藻株的突變體?！颈狙芯壳腥朦c】通過誘變和高銨濃度篩選的方式選育抗高銨濃度的小球藻品系鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過紫外線照射誘變小球藻(C.vulgaris)，再以高濃度的NH4HCO3作為篩選壓力篩選具有生長優(yōu)勢的突變藻株，為小球藻的大規(guī)模健康養(yǎng)殖提供科學參考。

1材料與方法

1.1藻種

小球藻(Chlorella vulgaris,Val)為中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室保存的養(yǎng)殖品種。

1.2培養(yǎng)基

小球藻的培養(yǎng)基為改良的BBM培養(yǎng)基[13]：NH4HCO3400 mg/L,CaCl2·H2O 25 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，K2HPO475 mg/L，KH2PO4175 mg/L，NaCl 25 mg/L,FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3BO31.142 mg/L，Disodium EDTA 5.0 mg/L,KOH 3.1 mg/L,ZnSO4·7H2O 1.764 mg/L,MnCl2·4H2O 0.288 g/L，CuSO4·5H2O 0.314 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.098 mg/L，MoO30.142 mg/L。

1.3培養(yǎng)條件

光源為日光燈，光照強度為60 μmol · m- 2· s- 1，光暗周期為12 h/12 h，培養(yǎng)溫度為(23±1)℃。小球藻培養(yǎng)時統(tǒng)一使用250 mL三角瓶，每瓶培養(yǎng)基的體積為100 mL。實驗開始時取對數(shù)生長期的小球藻預培養(yǎng)液，按0.5×106個/mL接種，每天搖瓶3次。

1.4誘變方法及有效劑量

1.4.1誘變方法

取對數(shù)生長期的小球藻液10 mL，轉速為5 000 r/min,離心5 min，棄上清，用新鮮配制的培養(yǎng)液重新懸浮。血球計數(shù)板計數(shù)后梯度稀釋，吸取200 μL藻液涂布在固體培養(yǎng)基上，將涂布的藻細胞個數(shù)控制在約300個/平板，30 W紫外燈距離20 cm處照射。照射時間設為10 s、20 s、40 s、60 s及80 s 5個組，每種劑量做3個重復，以未照射的藻種作為對照組。紫外誘變后避光培養(yǎng)12 h，之后于同上條件培養(yǎng)。

1.4.2致死率計算

12 d后對平板上長出的藻落進行計數(shù)，按下面公式計算致死率：致死率=(1-誘變組藻落數(shù)/對照組藻落數(shù))×100%。根據(jù)照射時間和致死率確定適宜的誘變時間。

1.5具生長優(yōu)勢藻株的篩選

小球藻出發(fā)藻株Val培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用血球計數(shù)板進行計數(shù)，取約300個細胞涂布于含有1 200 mg/L NH4HCO3的BBM培養(yǎng)基平板。根據(jù)預誘變確定的最佳紫外照射時間，對平板上的藻落進行誘變。照射后分別將長出的單藻落，采用平板劃線法轉移至同上BBM固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第12天，從平板上挑取4株長勢最旺盛的藻株進行單克隆培養(yǎng)，然后分別在400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、1 200 mg/L 5個不同的NH4HCO3濃度下測量其生長曲線。

1.6生長曲線的測定

將篩選出的4個突變藻株和出發(fā)藻株Val按相同的起始密度(0.5×105個/mL)分別接種于NH4HCO3濃度為400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、1 200 mg/L的液體培養(yǎng)基中，每個濃度設置3個平行樣，連續(xù)培養(yǎng)12 d。每2 d取藻液測OD680，繪制生長曲線。

1.7小球藻油脂積累的觀察

以出發(fā)藻株Val為對照，觀察培養(yǎng)過程中抗高銨小球藻藻株的油脂積累情況，實驗步驟如下[14]：分別吸取培養(yǎng)至第2天、4天、6天、8天、10天、12天的小球藻藻液1.0～1.5 mL于離心管中，10 000 r/min離心30 s，倒去上清，加入370 μL BBM新鮮培養(yǎng)液使微藻細胞重懸，再加入125 μL DMSO和1 μL尼羅紅儲備液(1 mg尼羅紅粉末溶解于4 mL DMSO)，顛倒混勻。用鋁箔紙包好離心管以避光，37℃溫育15 min。熒光顯微鏡觀察，使用激發(fā)光波長為443 nm，尼羅紅染色后中性脂發(fā)射峰在570 nm附近(黃色-橙色)。

1.8最大光合速率的測定

使用Dual-PAM-100(Walz，德國)測量出發(fā)藻株和突變藻株培養(yǎng)至第12天的光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的最大光能轉化效率(Fv/Fm)。

2結果與分析

2.1紫外誘變時間

將小球藻進行梯度稀釋后涂布到BBM固體培養(yǎng)基上，在紫外燈下進行誘變處理，經(jīng)誘變處理后小球藻的形態(tài)發(fā)生變化，照射時間越長，其細胞的顏色越淺，死亡后的小球藻細胞內空間消失，原生質體的結構發(fā)散。圖1為培養(yǎng)至第12天時不同紫外照射時間組的致死率，可以看出，紫外照射對小球藻有明顯的致死效應，紫外照射時間為10 s時其致死率為41.7%，隨著小球藻暴露在紫外燈下時間的延長，致死率也隨之增加，當時間增至60 s時，致死率為85.8%，而當紫外照射時間增加到80 s時，其致死率已經(jīng)高達95.3%。當紫外誘變的致死率在80%～90%時為最佳誘變劑量，因此本實驗選擇紫外照射60 s對小球藻出發(fā)藻株進行誘變處理。

圖1不同紫外照射時間下小球藻的致死率

Fig.1The mortality of Chlorella at different exposure time to UV

2.2小球藻抗銨藻株的篩選

經(jīng)紫外線誘變和高銨(1 200 mg/L的NH4HCO3)的篩選，選擇培養(yǎng)基上長出的零星藻落即為初步的抗高銨小球藻藻株。我們選擇4個藻落體積較大的克隆作為候選藻株，代表其生長迅速。這4個藻株分別為B4、C6、C7和D2。

2.3抗銨小球藻的生長曲線

如圖2所示,突變株C7和D2在各個NH4HCO3濃度中其細胞密度均小于出發(fā)藻株，而B4和C6的終細胞密度除了NH4HCO3濃度為600 mg/L時稍低于出發(fā)藻株，在其他的濃度NH4HCO3培養(yǎng)基均大于出發(fā)藻株。與出發(fā)藻株相比，當NH4HCO3為400 mg/L時，B4的生物量增長3.31%，C6的生物量增長14.79%。當NH4HCO3為800 mg/L時，B4的生物量增長41.18%，C6的生物量增長9.54%。當NH4HCO3為1 000 mg/L時，B4的生物量增長32.64%，C6的生物量增長29.41%。當NH4HCO3為1 200 mg/L時，B4的生物量增長37.74%，C6的生物量增長22.85%。而且在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中NH4HCO3濃度大于600 mg/L時，出發(fā)藻株和突變株C7和D2的藻液會出現(xiàn)貼壁和沉淀狀態(tài)，而突變株B4和C6始終藻液均勻，無貼壁現(xiàn)象，說明突變株B4和C6為理想的抗高銨并具生長優(yōu)勢的誘變藻株。

圖2不同NH4HCO3濃度下出發(fā)株及各誘變株的生長狀況比較

Fig.2Comparison of growing speed of original and mutated strains under different concentration of NH4HCO3

2.4藻株的油脂積累

尼羅紅染色劑是一種親脂性的惡嗪類熒光染料,能進入細胞與胞內中性脂結合并發(fā)出熒光檢測信號,其強度與細胞的中性脂含量呈線性關系[15]，因此我們利用尼羅紅染色對微藻油脂的積累量進行即時的顯微觀察。一般來說，藻類對油脂的積累是對外界脅迫的一種響應，當微藻生長受到限制時就會出現(xiàn)這種儲存物的積累。從圖3看出，在含有不同濃度的NH4HCO3的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第12天，無論誘變株B4和C6,還是對照組出發(fā)株都沒有油滴出現(xiàn)，說明它們都保持在旺盛的生長狀態(tài)，沒有受到限制。

圖3培養(yǎng)至第12天小球藻細胞內的油脂積累情況

Fig.3Nile red fluorescent observation of lipid accumulation for Chlorella vulgaris strains after being cultivated for 12 days

2.5出發(fā)藻株和誘變藻株最大光合速率比較

如圖4所示，誘變藻株B4和C6的最大光能轉化效率隨著培養(yǎng)基中NH4HCO3濃度的升高都明顯高于出發(fā)藻株， 其中NH4HCO3濃度為1 200 mg/L時的差異最大，P值分別為0.000997和0.008766，均小于0.01，差異顯著。

圖4第12天小球藻突變株和出發(fā)株的光能轉化效率

Fig.4Fv/Fmof original and mutated Chlorella strains at day 12th

3結論

選育生長速度快、蛋白含量高、抗生物污染的小球藻藻種一直是小球藻大規(guī)模生產技術的重點，本文通過紫外誘變篩選得到的小球藻突變株B4和C6，在高NH4HCO3濃度中均能保持較快的生長速率，當NH4HCO3濃度為800 mg/L、1 000 mg/L、1 200 mg/L時,其最終生物量比出發(fā)藻株分別提高了41.18%和9.54%，32.64%和29.41%，37.74和22.85%。但在NH4HCO3濃度為400 mg/L和600 mg/L時，兩個突變株的生長速率或者與出發(fā)藻株無明顯差異，或者略低于出發(fā)藻株，說明這兩個在高銨濃度篩選壓力篩選出來的突變株在高銨培養(yǎng)條件下更能顯示其生長優(yōu)勢。同時，尼羅紅顯微觀察證明,突變藻株B4和C6能快速生長，而最大光合速率的檢測還揭示了它們的生長優(yōu)勢可能來自光合效率的提高。

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(責任編輯：尹闖)

UV Mutagenesis and Screening for Ammonium Tolerant Strains of Chlorella vulgaris

CAO Xiaofei,FENG Shengwei,SONG Xinwei,XU Di

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding,Ministry of Education,College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao,Shandong,266003,China)

Abstract:【Objective】Breeding the new strains of Chlorella vulgaris that have a tolerance to high concentration of ammonium can efficiently avoid being eaten by the contamination animals such as rotifer,ciliate and so on during cultivation. 【Methods】The original strain of Chlorella vulgaris was first mutated by exposing to UV light and then was screened by the high concentration of ammonium in media.【Results】Two mutants,B4 and C6,were acquired with better growth rate than the original one.The biomass of strains B4 and C6 after being cultivated for 12 d increased 41.18% and 9.54%,32.64% and 29.41%,37.74% and 22.85%,respectively,under different ammonium concentration,which was 800 mg/L,1 000 mg/L,and 1 200 mg/L.The Fv/Fm results also proved a significant improvement on their maximum light conversion efficiency.【Conclusion】The mutants B4 and C6 showed growing advantages under higher ammonium concentration, which may be gained from the enhancement of photosynthesis efficiency.

Key words:Chlorella vulgaris,UV mutagenesis,high ammonium tolerant,Fv/Fm

收稿日期：2015-02-25

作者簡介：曹曉菲(1991- )，女,碩士研究生,主要從事藻類培養(yǎng)及分子生物學研究。 **通訊作者：徐滌(1972- )，博士，副教授，主要從事藻類遺傳學研究，E-mail:dixu@ouc.edu.cn。

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)02-0120-05

*北海市科學研究與技術開發(fā)計劃項目(201203024)資助。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(2):120～124

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-11

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160511.0919.002.html