何珍妮，　蓋來兵，　羅洪鎮(zhèn)，　張敬書，　趙艷麗，　段作營(yíng)，　史仲平*

1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.石家莊制藥集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 050038；3.河北常山生化制藥股份有限公司，河北 石家莊 050800

丁酸脅迫耦聯(lián)丙酮丁醇梭菌-釀酒酵母混合培養(yǎng)強(qiáng)化丁醇發(fā)酵性能

何珍妮1，蓋來兵2，羅洪鎮(zhèn)1，張敬書2，趙艷麗3，段作營(yíng)1，史仲平1*

1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.石家莊制藥集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 050038；3.河北常山生化制藥股份有限公司，河北 石家莊 050800

摘要：為改善丁醇發(fā)酵性能，提出丁酸脅迫與丙酮丁醇梭菌-釀酒酵母混合培養(yǎng)體系協(xié)同作用的新型丁醇發(fā)酵優(yōu)化控制策略。7 L發(fā)酵罐中，在溶劑生產(chǎn)期(24 h)添加4.0 g/L-broth的丁酸濃縮液和0.2 g-DCW/L-broth的釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，丁醇濃度、丁醇/丙酮比和總?cè)軇┥a(chǎn)效率與對(duì)照相比分別提高35%、43%和79%，達(dá)到15.74 g/L、2.83和0.52 g/L/h的最高水平。若將精餾后溶劑混合物作為高效柴油添加劑，柴油添加劑中B∶A∶E比例可達(dá)74∶17∶9 (w/w)的高水平，產(chǎn)品質(zhì)量獲得顯著改善。試驗(yàn)及分析闡明該優(yōu)化控制策略可大幅誘發(fā)賴氨酸的分泌及在梭菌中的吸收/利用，提高梭菌對(duì)高丁醇濃度環(huán)境的耐受能力，促進(jìn)丁醇合成；可強(qiáng)化梭菌對(duì)底物利用的競(jìng)爭(zhēng)能力、提高電子往復(fù)穿梭傳遞系統(tǒng)中還原力再生速率、產(chǎn)生更多用于丁醇合成的NADH。兩者的協(xié)同作用大幅提高了丁醇發(fā)酵的整體性能。

關(guān)鍵詞：丁醇； 丙酮丁醇梭菌； 丁酸； 賴氨酸； NADH

丁醇是一種清潔高效的生物燃料，也是一種重要的平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于生物能源和生物化工等領(lǐng)域。丁醇可用作柴油添加劑。隨著油價(jià)上漲，利用發(fā)酵方法大規(guī)模生產(chǎn)丁醇日益引起研究者們的關(guān)注[1]。

丁醇發(fā)酵又稱為丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物丁醇、丙酮和乙醇的質(zhì)量比約為6∶3∶1[1,2]。作為添加劑使用時(shí)，提升ABE溶劑混合物中丁醇濃度可以提高ABE發(fā)酵產(chǎn)品的一次性回收率[3]。丁醇濃度、丁醇/丙酮比和總?cè)軇舛仁茿BE發(fā)酵中三個(gè)重要指標(biāo)。前期研究表明，添加少量丁酸雖然可以提高丁醇/丙酮比和總?cè)軇┥a(chǎn)效率，但提升幅度很有限[4]。

研究數(shù)據(jù)顯示，將產(chǎn)溶劑梭菌與纖維素分解菌[5]、枯草芽孢桿菌[6]等進(jìn)行混合培養(yǎng)可一定程度上改善ABE發(fā)酵性能。釀酒酵母可在無氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是工業(yè)上酒精生產(chǎn)的主要微生物[7]。在高溫、有機(jī)酸、醇類物質(zhì)等脅迫環(huán)境中，釀酒酵母自身有一套完備的應(yīng)對(duì)機(jī)制[8]。因此理論上，通過混合培養(yǎng)梭菌和釀酒酵母來提高ABE的發(fā)酵性能是可行的。

本文探討丙酮丁醇梭菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)體系對(duì)ABE發(fā)酵性能的影響，并對(duì)該混合培養(yǎng)體系進(jìn)行分析和優(yōu)化，提出了丁酸環(huán)境脅迫與梭菌-酵母混合培養(yǎng)體系協(xié)同作用強(qiáng)化丁醇發(fā)酵性能的新型ABE發(fā)酵策略。

1材料與方法

1.1菌種

丙酮丁醇梭菌ATCC 824，實(shí)驗(yàn)室保藏。釀酒酵母，購自安琪酵母股份有限公司。

1.2培養(yǎng)基及制備方法

梭菌活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法同前期報(bào)道[4]。釀酒酵母活化/發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物8.5，(NH4)2SO41.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl2·2H2O 0.06。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1菌種活化方法

梭菌活化：將孢子液按10% (v/v)接種量轉(zhuǎn)接到裝有50 mL活化培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中，沸水處理1 min，冰水浴處理1 min，在37 ℃水浴鍋中培養(yǎng)27 h作為發(fā)酵種子。釀酒酵母活化：將酵母從斜面上接種到培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵種子。

1.3.2ABE發(fā)酵

100 mL厭氧瓶發(fā)酵：在厭氧條件下，將活化好的菌種按10% (v/v)轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵玉米培養(yǎng)基(15%，w/v)的厭氧瓶中，在37 ℃水浴鍋中培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，添加一定量的丁酸或釀酒酵母。7 L罐發(fā)酵：接種前，向裝有3.5 L玉米培養(yǎng)基(15%，w/v)的發(fā)酵罐通氮?dú)?0 min保證嚴(yán)格厭氧環(huán)境。接種后繼續(xù)通氮?dú)庵凉迌?nèi)壓強(qiáng)為0.04 MPa。發(fā)酵條件為37 ℃，初始pH 6.0，接種量10%(v/v)。添加丁酸和釀酒酵母：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)溶劑期(24 h)，將丁酸濃縮液一次性接入發(fā)酵罐或厭氧瓶中，添加量為4.0 g/L-broth。釀酒酵母培養(yǎng)與ABE發(fā)酵同步，在裝有2.7 L培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中按10%接種量進(jìn)行培養(yǎng)(30 ℃、pH 6.0～6.2)。利用DO-Stat補(bǔ)料控制葡萄糖和乙醇濃度接近于0的水平。

1.4分析方法

發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量、葡萄糖、游離氨基酸以及溶劑濃度的測(cè)定方法同前期報(bào)道[4]。酵母干重按DCW=OD600×0.22計(jì)算。氣體測(cè)量方法：1 h內(nèi)，前15 min利用2個(gè)裝有6 mol/L NaOH的洗瓶除盡CO2，得到氫氣釋放量AH2。余下45 min測(cè)定總產(chǎn)氣量AGAS。通過公式(1)計(jì)算CO2和H2的釋放速率(rCO2和rH2)：

(1)

利用理想氣體方程(105Pa，25 ℃)將AH2和AGAS轉(zhuǎn)換為摩爾單位。用以時(shí)間為獨(dú)立變量的多項(xiàng)式曲線擬合葡萄糖、乙醇和丙酮濃度，將其對(duì)時(shí)間求導(dǎo)得到rGLC，rEtOH和rACE。

2結(jié)果與討論

2.1外添丁酸對(duì)提高ABE發(fā)酵性能、促進(jìn)有益于丁醇合成氨基酸分泌的影響

丁酸是ABE發(fā)酵中重要的中間代謝物，丁酸的添加會(huì)影響梭菌的正常代謝[5]。如圖1和表1所示，厭氧瓶中，外添丁酸(4.0 g/L)批次的丁醇濃度和丁醇/丙酮比分別達(dá)到15.29 g/L和2.70，比對(duì)照提高了19%和34%；罐發(fā)酵中，相應(yīng)指標(biāo)達(dá)到13.50 g/L和2.36。另外，外添丁酸量(4.0 g/L)高于發(fā)酵產(chǎn)酸期丁酸的積累濃度(1.0 g/L～2.0 g/L)。因此，外添丁酸對(duì)于梭菌生存而言是一種環(huán)境脅迫，有可能誘發(fā)梭菌產(chǎn)生某些物質(zhì)、如氨基酸等以保護(hù)其生存。Heluane等[9]研究表明，賴氨酸和蛋氨酸對(duì)丁醇合成有正調(diào)節(jié)作用。此外，苯丙氨酸和酪氨酸對(duì)梭菌生長(zhǎng)及丁醇合成均有促進(jìn)作用，添加少量上述氨基酸可將丁醇濃度從12.0 g/L提高至14.2 g/L，生物量由3.44 g/L提高至4.57 g/L[10]。賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸有利于ABE發(fā)酵。

●丁醇；▲丙酮；■乙醇；○丁酸；△葡萄糖

圖2A-2B是罐發(fā)酵條件下，有益于梭菌生存和丁醇合成的氨基酸的分泌積累情況。添加丁酸的發(fā)

酵批次(#b)中，上述氨基酸(賴氨酸除外)逐漸分泌積累，濃度不斷增加。而對(duì)照(#a)中上述氨基酸濃度基本不變。外添丁酸可誘發(fā)苯丙氨酸、酪氨酸和蛋氨酸在梭菌胞內(nèi)積累，并導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的胞外分泌，一定程度上增強(qiáng)了梭菌對(duì)高丁醇濃度環(huán)境的耐受和產(chǎn)丁醇能力，但外添丁酸對(duì)提升發(fā)酵性能貢獻(xiàn)有限，因此需要更有效的發(fā)酵策略以進(jìn)一步提升ABE發(fā)酵的整體性能。

表1　不同操作模式下ABE發(fā)酵性能

(A)傳統(tǒng)發(fā)酵，批次#a；(B)丁酸添加，批次#b；

圖27 L發(fā)酵罐不同操作模式下的氨基酸分泌

2.2梭菌-酵母混合培養(yǎng)對(duì)ABE發(fā)酵性能的影響

釀酒酵母在高溫、有機(jī)酸、醇類物質(zhì)等脅迫環(huán)境下可分泌氨基酸等物質(zhì)以抵御不利生存的惡劣環(huán)境。丁醇存在條件下酵母細(xì)胞翻譯過程受抑制，胞內(nèi)“氨基酸池”處于保護(hù)狀態(tài)[11]，該環(huán)境可能導(dǎo)致酵母胞內(nèi)氨基酸池中的氨基酸分泌到胞外，進(jìn)而被梭菌細(xì)胞吸收利用。如圖3所示，當(dāng)釀酒酵母處于丁醇、丁酸和丁醇+丁酸環(huán)境脅迫下時(shí)，體系中有益于丁醇合成的氨基酸分泌量均大幅提高。因此，梭菌與釀酒酵母混合培養(yǎng)體系有提高ABE發(fā)酵性能的潛力。

圖337 ℃及外部環(huán)境脅迫下酵母分泌氨基酸情況

在100 mL厭氧瓶中對(duì)混菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為：37 ℃，發(fā)酵24 h時(shí)接入酵母，接入量0.2 g-DCW/L-broth。根據(jù)上述條件在7 L罐中進(jìn)行梭菌-酵母混合培養(yǎng)體系生產(chǎn)丁醇試驗(yàn)，結(jié)果如表1、圖2C及圖4A所示。

與對(duì)照相比，混菌培養(yǎng)批次(#c)的丁醇濃度從11.63 g/L提高到11.91 g/L，丁醇/丙酮比從1.98上升到2.22，提高幅度有限。此時(shí)，乙醇濃度增加到8.42 g/L，成為發(fā)酵第2位產(chǎn)物。與批次#b類似，批次#c中苯丙氨酸、酪氨酸和蛋氨酸濃度逐漸增加，但賴氨酸基本沒有積累。此時(shí)，各氨基酸濃度均低于批次#b的水平。因8.42 g/L的乙醇對(duì)梭菌生存不會(huì)產(chǎn)生致命影響和環(huán)境脅迫作用，參照對(duì)照結(jié)果可知，批次#c的氨基酸分泌應(yīng)主要來源于酵母。與對(duì)照相比，梭菌胞內(nèi)外的氨基酸存在濃度梯度，但批次#c中的胞外氨基酸濃度較低，即便上述氨基酸全部跨膜進(jìn)入梭菌胞內(nèi)，其積累量也達(dá)不到批次#b的水平。因此，單純的共混培養(yǎng)體系無法提高梭菌胞內(nèi)的氨基酸積累和吸收/利用。

●丁醇；▲丙酮；■乙醇；○丁酸；△葡萄糖

GLC→2EtOH+2CO2

(2)

(3)梭菌代謝合成ABE化學(xué)計(jì)量式[12]：

GLC→0.63BtOH+0.315ACE+0.11EtOH+

2.32CO2+1.26H2+0.32H2O

(3)

全部的NADH和大部分的CO2均來自于GLC→Acetyl-CoA及電子穿梭系統(tǒng)。乙醇合成支路緊靠Acetyl-CoA節(jié)點(diǎn)，且與復(fù)雜的丁酸/乙酸生成/再吸收閉環(huán)回路沒有關(guān)聯(lián)。梭菌胞內(nèi)的乙醇和CO2的化學(xué)計(jì)量關(guān)系剛性較強(qiáng)、受混合培養(yǎng)的影響不大?；旌吓囵B(yǎng)下，乙醇和CO2依舊存在公式4～5的關(guān)系。這里，GLC、BtOH、ACE和EtOH代表葡萄糖、丁醇、丙酮和乙醇。

(4)

根據(jù)以上關(guān)系，γ即可由公式(6)計(jì)算得到：

(6)

(7)

這里，γ=0為梭菌ABE發(fā)酵，ΔT、N和MWEtOH分別為采樣間隔、采樣數(shù)和乙醇分子量。

(A)：○批次#a；■批次#b；…批次#c；—批次#d；

2.3丁酸脅迫與梭菌-酵母混合培養(yǎng)體系大幅提高ABE發(fā)酵性能

當(dāng)ABE發(fā)酵至24 h時(shí)，實(shí)施上述耦聯(lián)式發(fā)酵策略，厭氧瓶中的丁醇濃度、丁醇/丙酮比、總?cè)軇舛冗_(dá)到16.34 g/L、2.97、25.34 g/L的最高水平。發(fā)酵罐中，丁醇濃度和丁醇/丙酮比也達(dá)到15.74 g/L和2.83的最高水平，相比對(duì)照提高了35%和43%。總?cè)軇舛群蜕a(chǎn)效率分別從18.77 g/L和0.29 g/L/h提高至25.15 g/L和0.52 g/L/h。酵母代謝活性得到適度抑制，乙醇濃度僅為3.84 g/L，發(fā)酵性能顯著改善。

從氨基酸分泌模式(圖2D)看出，批次#d中蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸濃度僅為批次#b和批次#c的疊加，而賴氨酸分泌量卻大幅提升。與對(duì)照相比，賴氨酸從1.67 mg/L增加到45.9 mg/L，提高了27.5倍。雖然尚無法確定賴氨酸是來自于梭菌、酵母還是二者共同分泌，但即便來自于酵母(最不直接的分泌方式)，大量游離賴氨酸若進(jìn)入梭菌胞內(nèi)，將營(yíng)造利于丁醇合成的胞內(nèi)氨基酸環(huán)境。同時(shí)，類似的賴氨酸大幅分泌現(xiàn)象也出現(xiàn)在乙酸耦聯(lián)梭菌-酵母混合培養(yǎng)的ABE發(fā)酵中[13]。

2.4丁酸脅迫與梭菌-酵母混合培養(yǎng)的ABE發(fā)酵策略的工業(yè)應(yīng)用潛力

ABE發(fā)酵生產(chǎn)中，在提高/維持總?cè)軇┥a(chǎn)效率的前提下，進(jìn)一步提高丁醇濃度或丁醇比率是重新啟動(dòng)ABE發(fā)酵工業(yè)的關(guān)鍵性因素。據(jù)報(bào)道，當(dāng)丁醇濃度從12 g/L提高至19 g/L時(shí)，丁醇分離成本將降低50%[1]。本文使用的新型ABE發(fā)酵策略使丁醇濃度從11.63 g/L提高至15.74 g/L，降低了后期分離純化成本。雖然表觀丁醇比率從62%提高到63%，但超過70%的乙醇是由酵母代謝產(chǎn)生(圖5A和表1)。使用上述新型發(fā)酵策略，梭菌細(xì)胞代謝產(chǎn)生的丁醇比率從62%提高到70%，來自于梭菌的丁醇∶丙酮∶乙醇實(shí)際上提升到70∶23∶7 (w/w)的高水平。由酵母代謝的過量乙醇雖然降低了表觀丁醇比率，但提高了丁醇、總?cè)軇舛群蜕a(chǎn)效率，以及整體發(fā)酵性能。有研究者采用離線萃取-共沸蒸餾法一次性將82%的總?cè)軇┚?，丁醇、丙酮和乙醇得率分別為96%、64%和50%[3]。蒸餾精制所得溶劑混合物可直接作為高效柴油添加劑使用，其中丁醇比例越高，柴油點(diǎn)火性能越好，質(zhì)量等級(jí)越高[15]。根據(jù)計(jì)算，傳統(tǒng)ABE發(fā)酵(B∶A∶E=6∶3∶1)，柴油添加劑中B∶A∶E比例在70∶24∶6(w/w)左右，而使用上述新工藝，通過改變發(fā)酵液中B∶A∶E比例，可將蒸餾精制得到的溶劑混合物中B∶A∶E比例提升至74∶17∶9(w/w)的高水平。該新型ABE發(fā)酵策略在提高生產(chǎn)效率同時(shí)，能夠進(jìn)一步改善發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量，具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。

粗實(shí)線：強(qiáng)化的途徑；點(diǎn)劃線：弱化的途徑；點(diǎn)線：氨基酸積累和再吸收途徑

3結(jié)論

提出了外添丁酸耦聯(lián)梭菌-酵母混合培養(yǎng)提高ABE發(fā)酵性能的新工藝。該策略可誘導(dǎo)賴氨酸的大量分泌，提高梭菌對(duì)底物利用的競(jìng)爭(zhēng)能力，產(chǎn)生更多用于丁醇合成的NADH。最終丁醇濃度、丁醇/丙酮比和總?cè)軇┥a(chǎn)效率分別達(dá)到15.74 g/L、2.83和0.52 g/L/h的最高水平。

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Enhanced ABE fermentation performance by co-culturingC.acetobutylicum/S.cerevisiaecoupling with butyrate addition and stress

HE Zhen-ni1, GE Lai-bing2, LUO Hong-zhen1, ZHANG Jing-shu2, ZHAO Yan-li3,DUAN Zuo-ying1, SHI Zhong-ping1

1. School of biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122; 2. China Shijiazhuang Pharmaceutical Group Co., Ltd.,Shijiazhuang, Hebei 050035; 3. Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Shijiazhuang, Hebei 050800

AbstractIn order to enhance acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation performance, a novel strategy of co-culturing C. acetobutylicum/S. cerevisiae coupling with exogenous butyrate addition and stress was proposed and conducted in a 7 L anaerobic bioreactor. During solventogenic phase of ABE fermentation by adding 0.2 g-DCW/L-broth of S. cerevisiae and 4.0 g/L-broth concentrated butyrate solution into C. acetobutylicum culture broth in one time (24 h), butanol concentration, butanol/acetone ratio and ABE productivity largely increased by 35%, 43% and 79% as compared with those of the control, and reached the highest levels of 15.74 g/L, 2.83 and 0.52 g/L/h, respectively. If the purified ABE solvents mixture could be directly used as the diesel additive, the B∶A∶E ratio would vary and reach a higher level of 74∶17∶9 (w/w), and the significant quality improvement of the additive product could be expected. Theoretical and experimental analysis revealed that the proposed strategy could extensively induce lysine secretion and its assimilation/utilization in C. acetobutylicum, promote C. acetobutylicum tolerant ability against high butanol environment and butanol synthesis; simultaneously enhance the competitive ability of C. acetobutylicum on substrate utilization and the reductive power originated from the electron transport shuttle system, to induce more intercellular NADH oriented for butanol synthesis in C. acetobutylicum metabolism. The synergetic actions of effective lysine assimilation and high NADH utilization rate desirable for butanol synthesis enhanced the ABE fermentation performance.

Key wordsbutanol; Clostridium acetobutylicum; butyrate; lysine; NADH

作者簡(jiǎn)介：何珍妮(1990～)，女，碩士研究生。E-mail：zhn_he@163.com。 *通訊作者：史仲平，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0510-85918292，E-mail：zpshi@jiangnan.edu.cn。

項(xiàng)目名稱：國(guó)家自然科學(xué)基金(20976072)。