李　莉,徐　苓,謝國化,王根發(fā),張　良

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院:1.檢驗科;2.老年醫(yī)學科;3.泌尿外科　200092)

·論著·

Urovysion FISH檢測尿液泌尿道腫瘤相關(guān)基因的異常及在老年科體檢中的應(yīng)用

李莉1,徐苓1,謝國化1,王根發(fā)2,張良3△

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院:1.檢驗科;2.老年醫(yī)學科;3.泌尿外科200092)

摘要:目的了解基于Urovysion熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測尿液脫落細胞中泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)性染色體異常在老年科體檢中的應(yīng)用價值。方法收集1 350例老年科患者的晨尿，采用Urovysion FISH檢測尿液細胞中第3、7、17號染色體的非整數(shù)倍，以及第9號染色體長臂21區(qū)域的缺失。結(jié)果1 350例患者中共檢測出3號染色體異常55例(4.07%)，7號染色體異常68例(5.04%)，17號染色體異常41例(3.04%)，9號染色體異常36例(2.67%)。經(jīng)病理證實為膀胱癌22例(1.63%)，其他泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤16例(1.19%)。結(jié)論Urovysion FISH對于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的早期診斷有較高的應(yīng)用價值，可以作為老年科泌尿系腫瘤篩查的一線方法。

關(guān)鍵詞:泌尿系腫瘤;熒光原位雜交;尿液細胞學

泌尿道腫瘤中膀胱癌是老年人群中發(fā)病率較高的惡性腫瘤，根據(jù)美國癌癥學會的最新統(tǒng)計資料顯示，2012年全球膀胱癌新發(fā)病例42.98萬例，死亡病例16.51萬例。男女比例為10∶1，因而膀胱癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤[1]。 膀胱癌的早期診斷對疾病的預后有極其重要的影響，早期診斷主要以尿液脫落細胞學診斷、膀胱鏡組織活檢病理學檢查及影像學檢查等方法為主。 近期一種基于熒光原位雜交技術(shù)(FISH)原理的檢測技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到臨床實踐中，此項技術(shù)主要檢測尿液標本中第3、7、17號染色體的非整數(shù)倍，以及第9號染色體長臂21區(qū)域(9p21)的缺失。根據(jù)國外文獻報道顯示，F(xiàn)ISH對泌尿系腫瘤的診斷有較高的敏感度和特異性，同時對腫瘤的療效和預后判斷有較好的效果。 本文采用Urovysion FISH試劑盒檢測老年科患者泌尿系統(tǒng)脫落細胞中4種染色體的異常，評價FISH在老年人群中普查泌尿系腫瘤的意義，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集本院2011年3月至2014年10月老年醫(yī)學科患者1 350例，其中男965例(71.48%)，女385例(28.52%)，平均年齡(72.3±12.3)歲。

1.2標本采集與制備所有參試者均于試驗當天取晨尿30～200 mL，置清潔容器中送至本院實驗室待檢。行初步尿液脫落細胞計數(shù)，如尿液脫落細胞數(shù)過少，則判定為不合格標本，囑患者第2周再送尿液標本。 所有標本均于當天進行處理。

1.3FISH檢測FISH檢測按Pathvysion Urovysion DNA Kit試劑盒(USA)說明書操作,簡要描述如下。將20～50 mL新鮮尿液以2∶1比例與聚乙二醇混合，存放于4 ℃冰箱中當天處理。 將尿液置500 r/min離心10 min以取得泌尿道脫落細胞。用甲醇、冰醋酸混合液固定后2次離心沉淀，將沉淀的細胞用15 μL固定液重懸浮，制成細胞涂片。熒光探針包括3個重復序列，分別可以識別3、7和17號染色體的著絲粒片段。另有一特殊探針識別9p21片段。 在37 ℃潮濕環(huán)境下過夜完成雜交,沖洗后空氣干燥，然后用4′、6′-二脒基-2-苯基吲哚Ⅱ進行反染色，隨后上熒光顯微鏡分析結(jié)果。

1.4FISH結(jié)果判斷對至少25個形態(tài)學異常的細胞進行分析，直至出現(xiàn)大于或等于4個細胞獲得復染色體，即CEP3-紅色，CEP-7綠色，CEP-17藍綠色信號的異常；或者出現(xiàn)大于或等于12個細胞具有9p21片段的同源缺失(即LSI 9p21黃色信號的缺失)。

2結(jié)果

2.1FISH檢測尿液中脫落細胞染色體異常的方法驗證首先驗證了Urovysion FISH在尿液脫落細胞中檢測染色體異常的準確性，結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH能夠準確檢測出尿液脫落細胞中3、7、17號染色體的異常，以及9p21區(qū)段的缺失。4種染色體異常的熒光顯微鏡下表現(xiàn)見圖1。圖1A為正常尿液脫落細胞FISH結(jié)果，表現(xiàn)為紅色、綠色、藍綠色及黃色各2個信號； 圖1 B為FISH陽性結(jié)果，表現(xiàn)為3、7、17號染色體多重信號增加；圖1C為7號染色體異常結(jié)果，表現(xiàn)為綠色信號缺失；圖1D為17號染色體異常，表現(xiàn)為藍綠色信號缺失；圖1E為9p21缺失異常，表現(xiàn)為黃色信號缺失； 圖1F為3號染色體異常，表現(xiàn)為紅色信號缺失。

圖1　　泌尿道脫落細胞FISH檢測結(jié)果

2.21 350例老年患者尿液脫落細胞中染色體異常結(jié)果分析 Urovysion FISH檢測老年科患者尿液脫落細胞染色體正常1 112例(82.37%)，異常238例(17.63%)，其中3號染色體異常55例(4.07%)，7號染色體異常68 例(5.04%)，17號染色體異常 41例(3.04%)，9p21缺失36例(2.67%)。病理學確診膀胱癌 22例(1.63%)，其他泌尿系腫瘤16例(1.19%)。

3討論

目前，膀胱癌的確診主要以膀胱鏡活檢、影像學表現(xiàn)及最終病理學診斷等手段，為臨床醫(yī)生提供準確的病例類型和臨床分期。 FISH檢測尿液脫落細胞學，分析膀胱上皮細胞中染色體的異常，可為膀胱癌的早期診斷提供重要的線索和依據(jù)。并且是一種無創(chuàng)性診斷方法，獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局和國家藥監(jiān)局批準，用于普通人群膀胱癌的篩選檢查。

FISH的特點是方法穩(wěn)定，可以避免標本處理和固定過程中的影響因素。 其另一個優(yōu)點是能對結(jié)果直接進行定性和定量分析，受觀察者主觀因素的影響較小。 本研究晨尿中脫落細胞的數(shù)量決定了分析結(jié)果的可靠性。因而細胞數(shù)量低于分析前要求，本研究采取了重新采樣的做法，以確保檢驗結(jié)果的準確性。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH檢測尿液脫落細胞染色體異常產(chǎn)生了較為滿意的敏感度和特異性,與國外的報道結(jié)果相類似[2-4]。 3、7、17號染色體倍體異常，以及9p21區(qū)段的缺失在膀胱癌中呈現(xiàn)較高的發(fā)生率。Kim等[5]的研究結(jié)果顯示，尿液脫落細胞FISH陽性結(jié)果可以預測尿液細胞學可疑及膀胱鏡檢陰性的膀胱癌患者的復發(fā)和腫瘤進展，但需要的隨訪時間較長;陽性FISH結(jié)果預測復發(fā)的風險比(HR)=2.35,95%CI:1.42～3.90,P=0.001,預測腫瘤進展的HR=3.01,95%CI:1.10～8.21,P=0.03。在另一項前瞻性篩選研究中，Bonberg等[6]報道，染色體的不穩(wěn)定性與膀胱癌的發(fā)生密切相關(guān)，3、7、17號染色體的多倍體異常，以及9p21位點的缺失是膀胱癌最為常見的拷貝數(shù)變異(CNV )表現(xiàn)，此類異常具有累積性，且在腫瘤獲得診斷前3年即可被發(fā)現(xiàn)；高分化性腫瘤比低分化性腫瘤有更高的累計性CNV。Urovysion FISH也可以檢測上泌尿道脫落細胞中染色體的異常，Reynolds等[7]報道,相對于尿液細胞學檢查，F(xiàn)ISH有更高的檢測敏感度和特異性，而二者聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高診斷的準確性。 Urovysion FISH在非肌肉侵襲性膀胱癌的預后評估中具有顯著意義,在多變量分析模型中均值大于16%的CNV是膀胱癌的預后影響因子(P=0.048,OR:6.07,95%CI:1.02～57.45)[8]。同時9p21缺失大于12%是預后的獨立影響因子(P<0.001,OR:3.24,95%CI:1.85～5.62)。

綜上所述，UroVysion FISH適合在一般老年人群中作為一種普查試驗來篩選膀胱惡性腫瘤，并且可以提前數(shù)年為臨床醫(yī)生提供診斷的線索，避免侵入性的檢查方法。 同時可以作為膀胱癌預后判斷的一種有效方法。

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Application of Urovysion FISH in the detection of aberrant chromosomes of urothelial malignancies:a study of geriatric patients by detecting urine specimens

LILi1,XULing1,XIEGuohua1,WANGGenfa2,ZHANGLiang3△

(1.DepartmentsofClinicalLaboratory; 2.DepartmentofGerontology,XinHuaAffiliatedHospitalofShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200092,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the clinical application values of Urovysion fluorescent in situ hybridization (FISH) in the detection of aberrant chromosomes of urothelial malignancies in exfoliated urothelial cells of geriatric patients.MethodsMorning urine samples from 1 350 cases of geriatric patients were collected.The aberrant chromosomes 3,7 and 17 aneuploidy and 9p21 locus deletions were tested with Urovysion FISH assay.ResultsIn total of 1 350 cases,55 cases (4.07%) were detected as chromosome 3 anueploidy; 68 cases (5.04%) were detected as chromosome 7 aneuploidy; 41 cases (3.04%) were detected as chromosome 17 anueploidy and 36 cases (2.67%) were detected as 9p21 locus deletions.The final pathologic diagnosis confirmed that 22 cases(1.63%) were bladder cancer and 16 cases (1.19%) were other urothelial carcinomas.ConclusionUrovysion FISH has high application value for the screening of urothelial malignancies and can be used as routine diagnostic method.

Key words:urothelial malignancy;fluorescent in situ hybridization;urinary cytology

作者簡介：李莉，女，主管技師，主要從事分子生物學檢驗方面的研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:drliangz@126.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.008

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1470-02

(收稿日期：2016-01-12修回日期：2016-03-12)