李小紅　李尚為　羅珊　樊偉　曾珣　白瑜

(四川大學華西第二醫(yī)院生殖醫(yī)學中心， 四川 成都 610041)

·論著·

Hsp70對慢性心理應激小鼠胚胎在體外培養(yǎng)中的作用

李小紅李尚為羅珊樊偉曾珣白瑜

(四川大學華西第二醫(yī)院生殖醫(yī)學中心， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討HSP70能否對慢性輕度不可預見性應激(CUMS)小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)的環(huán)境中起到應激保護作用。方法設立對照組，構建CUMS雌性昆明小鼠模型，予以PMSG/HCG促排卵獲取2-細胞胚胎，置于M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時，觀察優(yōu)胚率及囊胚形成率， 免疫熒光檢測Hsp70及Caspase-3在胚胎的表達情況，共培養(yǎng)囊胚與Ishikawa 細胞觀察粘附率，并進行統(tǒng)計學分析。結果實驗組的優(yōu)胚率和囊胚率分別為62.2%和20.6%，均低于對照組的89%和31%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HSP70在實驗組胚胎中陽性表達率為86.67%,高于對照組的30%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Caspase-3在實驗組及對照組之間陰性表達率無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。實驗組胚胎的粘附率為20%，低于對照組的30%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論HSP70可能對CUMS小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)的環(huán)境中起到應激保護作用，該作用可能通過抗凋亡因子(caspase-3)實現。

【關鍵詞】熱休克蛋白70；慢性輕度不可預見性應激；2-細胞胚胎；體外培養(yǎng)；caspase-3

胚胎體外培養(yǎng)是人類輔助生殖技術重要且關鍵的環(huán)節(jié)，優(yōu)質胚胎及囊胚的獲得則是助孕成功的先決條件。由于胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)并不能完全模擬女性生殖道的微環(huán)境，因此，體外培養(yǎng)的胚胎可能要面對氧化應激，溫度變化和完全改變的細胞環(huán)境，往往發(fā)育潛能降低[1-3]。

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是機體在應對各種不同應激刺激下所做出的細胞防御反應，是一種應激保護因子。在體外培養(yǎng)的胚胎其HSP70.1的表達水平明顯高于體內胚胎，對體外培養(yǎng)的鼠胚和豬胚給予熱應激和高氧應激，HSP70的表達顯著升高[4，5 ]。在相同培養(yǎng)液中培養(yǎng)不同數目的牛胚，其Hsp70.1轉錄體也明顯不同[6]。

課題組前期建立了慢性輕度不可預見性應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)雌性昆明小鼠模型，研究發(fā)現CUMS誘導HSP70在昆明小鼠卵泡、2-細胞胚胎和孕4天胚胎中陽性表達，可能參與應激胚胎的保護作用[7]。如果將CUMS小鼠2-細胞胚胎置于體外培養(yǎng)的環(huán)境中，HSP70能否繼續(xù)發(fā)揮其應激保護作用，本研究將對此進行初步探討。

1材料與方法

1.1實驗動物昆明純種小鼠，購于四川大學實驗動物中心(動物合格證號: SCXK(川)2013-026)。其中雌性小鼠20只，4～5周齡，體質量18～22g，每籠飼養(yǎng)5只；雄性小鼠5只，5～6周齡，體質量22～25g，每籠1只單獨飼養(yǎng)，合籠備用。正常飼養(yǎng)條件為自由攝食、飲水，12小時光照，環(huán)境溫度18～22℃，相對濕度40%～60%。雌性小鼠正常飼養(yǎng)5天后采用隨機數字表法將其分為對照組(5只)和實驗組(CUMS超排組，15只)。

1.2CUMS造模方法采用課題組前期研究的方法[8]，以9種應激因子在28天內隨機應用，每日一種，每種累計2～4次，使動物不能預料刺激的發(fā)生。9種應激因子如下：①潮濕墊料和傾斜飼養(yǎng)24小時(將200ml水加入有墊料的籠底，并將小鼠籠子傾斜45°)。②禁食24小時。③禁水24小時。④高溫10min(40℃環(huán)境)。⑤夾尾1min(距尾根1cm夾鐵質小書夾)。⑥4℃冰水游泳5min。⑦束縛應激4小時。⑧陌生異常物品(如塑料杯、木勺、碎布片等)。⑨孤養(yǎng)24小時。

CUMS刺激28天后采用曠場實驗及糖水消耗實驗驗證建模是否成功，成功后進入下一步研究。

1.3超排卵方案實驗組及對照組性成熟雌性小鼠于下午4時腹腔內注射孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG，天津實驗動物中心)10U，48h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG，上海生物化學制藥廠)10 U。

1.42-細胞胚胎的獲取及培養(yǎng)PMSG/HCG促排卵，HCG注射后即與性成熟雄鼠2∶1 合籠，次日8時觀察陰栓并與雄鼠分開，見陰栓當日為孕1天。孕2天下午2時(相當于見陰栓后30小時或HCG注射后46小時)采用脫臼法處死雌性小鼠，于卵巢與子宮之間找到并取出雙側輸卵管，在解剖顯微鏡下以1號注射器針尖縱行撥開輸卵管，以M2培養(yǎng)基沖洗，尋找2-細胞期胚胎并計數。

將獲得的2-細胞胚胎以毛細玻璃吸管轉移至M2操作液中清洗兩次，再轉移至平衡過夜后的M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15～20個胚胎/滴。將培養(yǎng)皿置于5%CO2、95%濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，然后置于體視顯微鏡下觀察并記錄胚胎發(fā)育情況。

1.5小鼠胚胎的評分標準小鼠胚胎的評分參照人類胚胎的評分標準[9]，共分為六級胚胎，其中一級、二級和三級胚胎定為優(yōu)質胚胎。一級胚胎評分標準為卵裂球均勻規(guī)則, 折光度適中, 透明帶完整，無碎片或碎片體積小于胚胎體積的10%；二級胚胎為卵裂球不均勻欠規(guī)則, 折光度稍差,碎片體積小于胚胎體積的10% ; 三級胚胎為碎片體積小于胚胎體積的50%, 剩余卵裂球形態(tài)和折光度與二級胚胎相當, 透明帶完整。

1.6胚胎免疫熒光染色將體外培養(yǎng)48小時的優(yōu)質胚胎進行免疫熒光染色?；静襟E：①4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS洗3次。②含0.1%Triton的PBS室溫打孔10分鐘，PBS洗3次。③含3%BSA的PBS封閉30分鐘，37℃。④1∶100稀釋的hsp70一抗或Caspase-3一抗，4℃過夜，PBS洗3次。⑤1∶100稀釋的羊抗鼠熒光二抗，37℃，30分鐘，PBS洗3次。⑥0.5μg/mlHoechst33258染核30分鐘，PBS洗3次。⑦甘油封片，在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

該實驗每次均設有陰性對照組，即封閉液代替一抗孵育過夜。陽性界定為激光共聚焦下見明亮的紅色熒光、各細胞期胚胎的細胞輪廓能夠清晰地呈現：陰性則看不到明亮的紅色熒光。

1.7囊胚體外粘附實驗將Ishikawa細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至90～95%融合時加入1ml M16培養(yǎng)液，將在體外培養(yǎng)48小時形態(tài)良好的囊胚移入培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察囊胚的粘附情況。觀察時輕微晃動培養(yǎng)板，位置沒有發(fā)生變化的囊胚記為粘附的囊胚，計算并比較各組間的粘附率。

2結果

2.1CUMS小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)48小時后發(fā)育情況5只對照組小鼠獲得2-細胞胚胎100枚，15只實驗組小鼠獲得2-細胞180枚。將獲得的實驗組和對照組2-細胞胚胎分別放在M16培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48小時后觀察，實驗組的優(yōu)胚率和囊胚率分別為62.2%和20.6%，均低于對照組的89%和31%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2HSP70和Caspase-3在體外培養(yǎng)48小時的CUMS小鼠胚胎中的表達將培養(yǎng)48小時獲得的優(yōu)質胚胎采用免疫熒光法檢測HSP70和Caspase-3的表達，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采圖，每組30枚。結果顯示，HSP70在實驗組胚胎中主要呈陽性表達，表達部位在透明帶，見圖1；其陽性表達率為86.67%,高于對照組的30%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Caspase-3在實驗組及對照組主要呈陰性表達，兩者之間陰性表達率無統(tǒng)計學差異，見表2。

表1　小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)后發(fā)育情況

注：優(yōu)胚率和囊胚率的比較采用2檢驗。

圖1免疫熒光測定HSP70在體外培養(yǎng)48小時胚胎中的表達

Fig.1The expression of HSP70 in 48 hr embryos cultured in vitro by immunofluorescence method

注：結果顯示，HSP70在實驗組主要呈陽性表達(紅色熒光)，在對照組中主要呈陰性表達

表2免疫熒光法檢測HSP70和Caspase-3在體外培養(yǎng)48小時胚胎中的表達

Table 2　Expression of HSP70 and Caspase-3

注：率的比較采用2檢驗。

2.3囊胚體外粘附實驗將培養(yǎng)獲得的形態(tài)良好的囊胚進行體外粘附實驗，每組各30枚。結果顯示，實驗組胚胎的粘附率為20%，低于對照組的30%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3　體外培養(yǎng)囊胚的粘附實驗[n(×190-2)]

注：粘附率的比較采用2檢驗

3討論

不孕癥及經歷人類輔助生殖技術治療過程都具有心理應激的特點，目前大量文獻已經證實心理應激對生殖功能的負面影響，包括影響月經，降低卵巢儲備功能和影響IVF成功率等[10-12]。本研究構建的CUMS雌性昆明小鼠模型是運用情緒應激的方法，使動物出現抑郁狀態(tài)、興趣喪失、快感缺乏等表現，與人體抑郁癥的臨床表現類似。前期研究已經發(fā)現其是一種生殖功能減退的情緒應激動物模型[8]。本研究將CUMS小鼠的2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)48小時后觀察發(fā)現，其優(yōu)胚率及囊胚形成率均明顯低于對照組，進一步做囊胚體外粘附實驗也發(fā)現其粘附率低于對照組，說明受到心理應激影響的2-細胞胚胎再次面臨體外培養(yǎng)的應激時，發(fā)育潛能進一步降低。

胚胎在體外培養(yǎng)的環(huán)境中同樣面臨應激的狀態(tài)。胚胎培養(yǎng)介質可能會影響牛和小鼠胚胎的基因表達和基因印跡狀態(tài)[13-15]，體外培養(yǎng)的豬胚發(fā)育至囊胚的潛能及質量均較體內獲得者降低[16]。本項目前期研究發(fā)現HSP70在CUMS昆明小鼠體內2-細胞胚胎中呈陽性表達，可能對體內應激胚胎起到保護作用[7]。本研究是將體內來源的CUMS小鼠2-細胞胚胎置于M16培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)48小時，結果發(fā)現，在優(yōu)質胚胎中HSP70的陽性表達率明顯高于對照組，提示HSP70可能對CUMS小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)的環(huán)境中起到應激保護作用。但具體分子機制尚不清楚。

HSP70的抗凋亡作用體現在其表達水平升高后，可以降低或阻斷caspase的活化，抑制線粒體損傷和核裂解[17,18]。caspase-3為caspase家族中關鍵的執(zhí)行分子，在凋亡的早期階段被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。在我們的研究中，CUMS小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)48小時后，在獲得的優(yōu)質胚胎中，HSP70陽性表達率高者caspase-3陰性表達率高，提示HSP70的應激保護作用可能與其拮抗caspase-3的抗凋亡作用有關。

4結論

通過體外培養(yǎng)CUMS小鼠2-細胞胚胎，我們發(fā)現其發(fā)育潛能降低，在獲得的優(yōu)質胚胎中HSP70陽性表達率升高，caspase-3陰性表達率升高，提示HSP70可能對CUMS小鼠2-細胞胚胎在體外培養(yǎng)的環(huán)境中起到應激保護作用，該作用可能通過抗凋亡因子(caspase-3)來實現。

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The effect of Hsp70 on 2- cells embryos in the mouse with chronic unpredictable mild stress in vitro

LI Xiaohong, LI Shangwei, LUO Shan,et al

(ReproductiveMedicalCenter,WestChinaSecondUniversityHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore whether HSP70 can play a protective role in 2- cells in vitro in the mouse with chronic unpredictable mild stress(CUMS). MethodsWe established an animal model of CUMS using female Kunming mice and administrated PMSG/hCG for induction of superovulation. After obtained 2- cell embryos, we cultured them in M16 culture medium for 48 hours and observed the rate of good quality embryos and blastocyst formation. We detected the expression of HSP70 and Caspase-3 in the embryos by immunofluorescence method and calculated the adhesion rate of embryos to endometrial epithelial Ishikawa cells in vitro. ResultsThe good quality embryo rate and blastocyst formatiaon rate of the experimental group were 62.2% and 20.6% respectively. Both of which were significantly lower than that of the control group (89% and 31%, P<0.05). The positive expression rate of HSP70 in the experimental group was 86.67%, which was significantly higher than that in the control group (30%, P<0.05). There was no significant difference in both groups about the negative expression rate of Caspase-3. When cultured the embryos with Ishikawa cells for 48 hours, we observed that the adhesion rate of the experimental group was 20%, which was lower than that of the control group (30%, P<0.05). ConclusionHSP70 may play a protective role in 2- cells of CUMS mouse in vitro, which may be realized by anti apoptotic factors (caspase-3).

【Key words】Heat shock protein70; Chronic unpredictable mild stress; 2-cell embryo; Culture in vitro; Caspase-3

【中圖分類號】R 329.1

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.007

(收稿日期：2016-02-26； 編輯： 張文秀)