衛(wèi)順生1，2，王華南2，3，胡　楊2，杜宏超2，李越華4，裴世敏2，楊　旭2，張　紅2，周　斌2，張　迪2，金藝鵬2，林德貴2（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；3.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310012；4.太原博愛寵物醫(yī)院，山西太原030024）

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Ki-67在犬乳腺腫瘤的表達(dá)與分析

衛(wèi)順生1，2，王華南2，3，胡楊2，杜宏超2，李越華4，裴世敏2，楊旭2，張
紅2，周斌2，張迪2，金藝鵬2，林德貴2
（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；3.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310012；4.太原博愛寵物醫(yī)院，山西太原030024）

摘要：本試驗(yàn)通過免疫組化的方法，檢測(cè)了從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集到的6個(gè)正常乳腺組織和135例乳腺腫瘤組織（良性30例，惡性105例）Ki-67的表達(dá)率。結(jié)果犬乳腺腫瘤組織中的Ki-67蛋白表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織（P<0.05）；犬惡性腫瘤組織中的Ki-67蛋白表達(dá)率明顯高于良性腫瘤（P<0.05）。表明Ki-67在惡性腫瘤里高表達(dá)，可以作為犬乳腺腫瘤疾病診斷的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：犬乳腺腫瘤；Ki-67蛋白；免疫組化；惡性腫瘤；良性腫瘤

1　材料與方法

1.1動(dòng)物材料采集自2012年5月至2013年6月間，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院臨床確診的乳腺腫瘤患犬的腫瘤病料135例，其中良性腫瘤（30例），包括良性混合瘤（10例）、混合腺瘤（8例）、導(dǎo)管乳頭狀瘤（12例）;惡性腫瘤（105例），包括實(shí)體癌（60例）、導(dǎo)管乳頭狀癌（25例）、纖維肉瘤（5例），原位癌（5例）和混合癌（10例）；以及健康試驗(yàn)犬正常組織（6例）?；既挲g在3～20歲之間，平均年齡8.98±3.73歲。無菌手術(shù)器械對(duì)腫瘤不同部位進(jìn)行取材，無菌生理鹽水沖洗后，用10倍體積的4%中性甲醛固定液固定。

1.2主要試劑及儀器Ki-67單克隆抗體、DAB顯色試劑盒、PV9000通用型，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；切片機(jī)、攤片機(jī)、烤片機(jī)、組織包埋、光學(xué)顯微鏡、載玻片。

1.3試驗(yàn)方法對(duì)所有收集到的乳腺腫瘤組織進(jìn)行Ki-67免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色方法參照文獻(xiàn)[8]。簡(jiǎn)要步驟如下：將上述固定的乳腺組織用組織包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋；每個(gè)石蠟組織至少制備2張0.3 μm的切片；第一張切片制備H.E.染色，進(jìn)行病理學(xué)分類;另一張組織切片經(jīng)過脫蠟、水化、修復(fù)抗原、封閉、加一抗、加二抗、顯色等過程完成Ki-67的免疫組織化學(xué)染色。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及分析方法對(duì)Ki-67蛋白的免疫組化染色以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒而細(xì)胞質(zhì)無染色者為Ki-67蛋白表達(dá)陽性，結(jié)果判定以陽性細(xì)胞所占百分比表示，即高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分?jǐn)?shù)進(jìn)行陽性細(xì)胞表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包（Statistical Package for social sciences，SPSS）19.0版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件選用fisher's精確檢驗(yàn)法、Pearson相關(guān)分析進(jìn)行檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Ki-67蛋白在正常乳腺組織中的表達(dá)從中插彩版圖1可看出，Ki-67主要表達(dá)于細(xì)胞核，大部分正常乳腺組織幾乎不表達(dá)（中插彩版圖1-A），只有一少部分正常乳腺組織少量表達(dá)Ki-67（中插彩版圖1-B）。

2.2Ki-67蛋白在乳腺腫瘤的表達(dá)從中插彩版圖2可看出，Ki-67在良性腫瘤中的表達(dá)量很低，幾乎不表達(dá)，而在犬乳腺癌中高表達(dá)，主要高表達(dá)于腺上皮細(xì)胞核。少量表達(dá)于肌上皮，纖維細(xì)胞較少表達(dá)。

2.3Ki-67蛋白表達(dá)在乳腺組織的表達(dá)量及與腫瘤良惡性的關(guān)系按照免疫組化結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示，我們列出Ki-67在犬乳腺的不同組織類型及乳腺腫瘤的不同組織學(xué)分型之間的表達(dá)量分布情況。結(jié)果顯示，不同組織學(xué)分型的腫瘤之間具有顯著性差異，P<0.01；對(duì)照組（n=6）Ki-67陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)值范圍為1.04%±1.85% （0～5%）；腫瘤組（n=135）Ki-67陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)值范圍為24.26%±26.88%（0～90%）；其中良性腫瘤（n=30）Ki-67陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)值為6.83%± 4.49%（0～10%）；惡性腫瘤（n=105）Ki-67陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)值為29.24%±28.50%（0～90%）。以Ki-67蛋白表達(dá)量50%為臨界值，采用Fisher′s檢驗(yàn)Ki-67表達(dá)與犬乳腺腫瘤良性與惡性的關(guān)系，如表2所示，Ki-67蛋白表達(dá)在正常乳腺與腫瘤之間不存在顯著性差異，P>0.05（P=0.3471）；在良性與惡性腫瘤之間表達(dá)量也存在顯著差異P<0.05 （P=0.00096）。

表1　Ki-67在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)情況

3　討論

本試驗(yàn)共收集到乳腺腫瘤組織135例，其中惡性腫瘤105例，所占比例為77.8%，其值高于國(guó)外的50%，因?yàn)閲?guó)內(nèi)一般等腫瘤變得很大才進(jìn)行手術(shù)治療，這時(shí)腫瘤往往已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移和惡化。有很多病理學(xué)家把包膜具有完整性的腫瘤直接被劃分為良性腫瘤，但這并不科學(xué)，因?yàn)槟[瘤惡性程度主要取決于核分裂相、細(xì)胞的異型性、核質(zhì)比等諸多因素，主要根據(jù)病理結(jié)果進(jìn)行定論。本試驗(yàn)中如果局部出現(xiàn)惡性程度高的區(qū)域，即使其他部分較良性且包膜完整，我們也將之化分為惡性腫瘤，有利于控制腫瘤的發(fā)展；另外，對(duì)于長(zhǎng)有多個(gè)腫瘤的病例，我們只統(tǒng)計(jì)惡性程度最高的那一個(gè)腫瘤作為整只犬的病理結(jié)果，利于及早進(jìn)行癌癥治療。

Ki-67蛋白存在于增殖細(xì)胞核，是一種非組蛋白核蛋白，由345 kD、395 kD的兩條多肽鏈組成[9]。Ki-67抗原在Gl中期到晚期出現(xiàn)，S期和G2期逐漸增加，M期達(dá)到最高值，M期后迅速，其半衰期短。Ki-67作為一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核蛋白，只與增生細(xì)胞核反應(yīng)，無組織特異性，是一個(gè)界定細(xì)胞凋亡和增殖的有價(jià)值的標(biāo)記物。Ki-67能準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，其與多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。在人類腫瘤研究領(lǐng)域，Ki-67的表達(dá)變化能較好的反映腫瘤增殖活性、對(duì)判斷腫瘤的惡性程度、預(yù)后和指導(dǎo)腫瘤的術(shù)后輔助治療有著極其重要的意義[10]。

本試驗(yàn)顯示，犬乳腺腫瘤組織中的Ki-67蛋白陽性率明顯高于正常乳腺組織，表明腫瘤細(xì)胞的核增殖性比正常乳腺細(xì)胞活躍，對(duì)腫瘤的診斷具有重要的意義；此外，我們還發(fā)現(xiàn)，犬惡性腫瘤組織中的Ki-67蛋白陽性率明顯高于良性腫瘤，對(duì)腫瘤的預(yù)后分析具有重要的診斷意義。本試驗(yàn)結(jié)果與人類醫(yī)學(xué)相關(guān)研究結(jié)果一致。我們的研究結(jié)果提示Ki-67是犬乳腺腫瘤的一個(gè)良好的生物標(biāo)記物，可作為犬乳腺腫瘤的預(yù)后指標(biāo)。

表2　Ki-67蛋白的表達(dá)與犬乳腺腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

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中圖分類號(hào)：S858.292

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0038-02

收稿日期：2015-12-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31572578；31372489）

作者簡(jiǎn)介：衛(wèi)順生（1964-），男，助理研究員，博士，從事寵物診療動(dòng)物外科手術(shù)及中獸醫(yī)和針灸工作，E-mail：tyboaipet@126. com

通訊作者：林德貴，E-mail：csama@sina.com乳腺腫瘤是犬最常見的腫瘤之一，大約50%的犬乳腺腫瘤屬于惡性腫瘤，并且手術(shù)切除之后，往往復(fù)發(fā)率較高[1]。目前，腫瘤標(biāo)記物可以用于腫瘤的檢測(cè)、診斷、評(píng)估癌癥風(fēng)險(xiǎn)、監(jiān)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)和預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后，因此找到良好的腫瘤標(biāo)記物意義重大。研究表明，Ki-67存在于細(xì)胞核內(nèi)[2]，在細(xì)胞增殖過程中起著至關(guān)重要的作用，可以用來識(shí)別生長(zhǎng)中的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，評(píng)估細(xì)胞的增生程度。在人類腫瘤研究中，很多研究都已經(jīng)證實(shí)Ki-67與乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌等癌癥關(guān)系密切[3-7]。而Ki-67在犬乳腺腫瘤的表達(dá)情況報(bào)道較少，因此，我們研究了Ki-67在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)所收集的北京市135例犬乳腺腫瘤的表達(dá)情況，將對(duì)犬乳腺腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及治療方面具有重要的指導(dǎo)意義。