周國堅　葉董婷　鄧旭杏

【摘要】目的：觀察黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸對CYP3A4活性的影響。方法：利用體外肝微粒體培育體系，以咪達唑侖作為探針底物，研究黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸對人肝微粒體細胞色素 P450 3A4（CYP3A4）活性的影響。結果：與空白組對比，黃連上清丸、牛黃解毒丸對CYP3A4活性表現為誘導作用，護肝片對CYP3A4活性表現為抑制作用。結論：在與臨床上經 CYP3A4代謝的藥物聯合應用時，應警惕黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸潛在藥物之間的相互作用。

【關鍵詞】黃連上清丸；護肝片；牛黃解毒丸；細胞色素 P450 3A4

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）10-0018-03

細胞色素P450酶是人體內的肝藥酶，廣泛分布于肝臟等器官。研究發(fā)現，有20多種同工酶與藥物代謝相關性高，共同參與人體內300余種藥物的代謝[1]。多種藥物同時使用時，若其中藥物是CYP3A4的誘導劑或抑制劑，則會顯著影響合用中其他藥物的代謝，也會對其他藥物的療效產生影響。研究表明，多種中藥提取物對P450活性有一定影響，如銀杏、五味子、白芷、羌活等甲醇提取物對CYP3A4有抑制作用[2-3]。利用體外實驗預測藥物在體內是否發(fā)生藥物代謝性相互作用，是藥物代謝研究的熱點內容。研究黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸對重組人肝微粒體細胞色素酶rCYP3A4的影響，結果如下。

1儀器與材料

11儀器MINI-10K微型離心機（常州朗越儀器制造有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；XH-C旋渦混合器（常州朗越儀器制造有限公司）；DW-86L386立式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；FE20實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；LC3000高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）。

12材料人重組肝細胞微粒體CYP3A4（批號：M41013，SPIBIO產）；咪達唑侖注射液（批號：20140607，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；1羥基咪達唑侖（批號：FN08081402，Cerilliant）；卡馬西平（批號：100142-201105，中國食品藥品檢定研究院）；酮康唑（批號：SM0325YF13，上海源葉生物科技有限公司）；NADPH（批號：WO1028EA14，上海源葉生物科技有限公司）。黃連上清丸（批號：14060026，太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司）；牛黃解毒丸（批號：13012307，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠）；護肝片（批號：201405102，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司）。乙腈（批號：20141021，天津市大茂化學試劑廠）；甲醇（批號：20140723，廣東光華科技股份有限公司）；磷酸氫二鉀（批號：20140701-2，廣州化學試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷（批號：TA0429CA14，上海源葉生物科技有限公司）；無水氯化鎂（批號：20140412，天津市福晨化學試劑廠）；碳酸氫鈉（批號：20140701-1，廣州化學試劑廠）。

2實驗方法

21溶液的配制

211咪達唑侖的配制精密吸取咪達唑侖注射液360μl（相當于咪達唑侖18mg），置于5ml容量瓶中，用純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度均為10mmol/l的儲備液，置于4℃冰箱備用。精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度為100μmol/l的咪達唑侖溶液。

2121-羥基咪達唑侖標準溶液的配制精密吸取100μl 1-羥基咪達唑侖于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1μg/ml的儲備液，精密吸取1ml 100μl 1-羥基咪達唑侖儲備液于10ml容量瓶中，甲醇定容制刻度，得到100ng/ml的儲備液，置于冰箱4℃下保存待用。

213卡馬西平內標溶液的配制精密稱取100mg卡馬西平于10ml容量瓶中，用乙腈定容得到1mg/ml的卡馬西平儲備液，從儲備液中精密吸取200μl到10ml容量瓶中，用乙腈定容得到濃度為200μg/ml的內標溶液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

214磷酸鹽緩沖液（pH74）的配制 取磷酸二氫鉀136g，加 01mol/l氫氧化鈉溶液79ml，用水稀釋至200ml，即得PBS溶液。

215陽性抑制劑酮康唑的配制精密稱取酮康唑265mg于5ml容量瓶中，用PBS溶液（pH 74）溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為100mmol/l的儲備液，置于4℃冰箱備用。

216氯化鎂溶液的配制精密稱量475mg氯化鎂于10ml容量瓶中，用PBS溶液（pH 74）充分溶解，定容搖勻，得到5000mmol/l的氯化鎂溶液。

217NADPH溶液的配制精密稱量83mg的NADPH用PBS溶液（pH 74）稀釋得到濃度為100mmol/l的NADPH，現用現配，4℃冰箱避光保存。

218人重組肝細胞微粒體CYP3A4的配制精密吸取100μl人重組肝細胞微粒體 CYP3A4，置于1ml容量瓶，用PBS溶液（pH 74）配制成濃度為100pmol/l的溶液，置于-20℃冰箱中保存。

22孵育體系與樣品處理[4-5]

221孵育體系肝微粒體體外孵育體系的總體積為200μl：20μlCYP3A4（終濃度為10pmol·l-1），20μl氯化鎂（終濃度為500mmol·l-1），10μl咪達唑侖（終濃度為5μmol·l-1），剩余體積用PBS緩沖溶液（pH74）補充，37℃水浴中孵育5min后，加入20μl NADPH（終濃度為10mmol/l）啟動反應，反應5min。

222樣品處理孵育結束后，馬上向孵育體系中加入100μl冰乙腈（含內標物質-卡馬西平2μg/ml）終止反應，渦旋混合1min，-20℃下放置10min，10000r/min高速離心10min，取上清液過濾，吸取20μl注入到HPLC儀中測定。

23色譜條件[6]色譜柱：Kromasil C18（250mm×46mm，5μm）；流速：100ml/min；柱溫：40℃；檢測波長：230nm；流動相：100mmol/L醋酸銨緩沖液-甲醇（42∶58）；進樣量：20μl。

24分組與給藥[7]體外孵化反應分為陽性對照組、陰性對照組和試藥組。陰性對照組中加入磷酸鹽緩沖液（pH74），陽性對照組中加入酮康唑溶液（00125、0025、005、01、05、1、10、50μmol/l）；試藥組給予以磷酸鹽緩沖液（pH74）稀釋的不同濃度的中成藥溶液。孵育體系總體積均為200μl，根據“22孵育體系與樣品處理”項下進行反應并處理。將所有樣品按“23色譜條件”項下進行測定，根據代謝產物1-羥基咪達唑侖的生成率可確定 CYP3A4 酶的相對活性（即試藥組占陰性對照組生成率的百分比），計算半數抑制率（IC50）。

25標準曲線的制備取6只EP管，加入1-羥基咪達唑侖儲備液，使1-羥基咪達唑侖的終濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000ng/ml，按照體外孵育和樣品處理方法“22孵育體系與樣品處理”項操作，取上清液20μl進樣，以1-羥基咪達唑侖和卡馬西平的峰面積比值（Y）和含量（X）進行加權回歸。

26酮康唑IC50的測定及抑制活性的評價在肝微粒體孵育體系中陽性抑制劑酮康唑對CYP3A4介導的咪達唑侖1-羥基化反應有強抑制作用。陽性對照組中加入酮康唑溶液，使其終濃度為：0025、01、05、1、10、50μmol/l，根據“22孵育體系與樣品處理”項下進行反應并處理，根據1-羥基咪達唑侖的生成率來確定 CYP3A4 酶的相對活性（即實驗組占陰性對照組生成率的百分比），計算半數抑制率IC50。

27對rCYP3A4活性影響的初步篩選

271樣品配制[7]根據說明書，分別取治療量的黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸，經處理后，分別置于100ml容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，超聲30min，濾過，濾液作為儲備液。將中成藥分為低、中、高劑量組，低、高劑量組則分別為中劑量組的1/2 和2 倍。并同時設置空白組。每個樣品平行做3份。

272酶孵化的條件反應體系中先分別加入PBS（pH74）、咪達唑侖、氯化鎂、rCYP3A4和待測藥物的儲備液，置于37℃水浴中預孵化振蕩5 min后，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動孵化反應。37℃水浴振蕩反應5min后，加入冰乙腈（含內標物質-卡馬西平2μg/ml）終止反應。渦旋混合1 min，-20℃下放置10min ，10000rpm離心5 min，取上清液過濾，吸取濾液20μl注入HPLC儀中，按“23色譜條件”項下色譜條件進樣測定，測定咪達唑侖代謝產物1-羥基咪達唑侖的濃度。

273代謝產物的測定使用HPLC儀按“23色譜條件”項下色譜條件進樣分析，測定1-羥基咪達唑侖與卡馬西平的含量，考察對CYP3A4活性影響較大的中成藥。代謝產物1-羥基咪達唑侖的生成率越低，表示抑制作用越強。

28對rCYP3A4活性抑制作用的強弱（IC50值）的計算

281酶孵化的條件參見“27對rCYP3A4活性影響的初步篩選”項下“272酶孵化的條件”項操作。

282代謝產物的測定參見“27對rCYP3A4活性影響的初步篩選”項下“273酶孵化的條件”項操作。

283IC50的測定 通過體外初步篩選后，在固定CYP3A4濃度、探針底物咪達唑侖濃度和NADPH濃度的同時，改變待測中成藥的濃度，測定不同濃度下中成藥對1-羥基咪達唑侖生成率的影響，判斷對CYP3A4的抑制程度，估計中成藥對rCYP3A4活性的影響強弱。以中成藥濃度對數值為橫坐標（X），CYP3A4酶的相對活性（%）表示為縱坐標（Y），計算IC50值和95%的可信范圍[8]，計算公式為：Y=min×（max-min）/ [1+10^（X-LogIC50）]。

3結果

31專屬性考察按“23色譜條件”項下色譜條件進樣測定，1-羥基咪達唑侖，卡馬西平的分離度好（>15），1-羥基咪達唑侖與卡馬西平出峰時間分別在154min，86min。見圖1-3。

32標準曲線以1-羥基咪達唑侖和卡馬西平的峰面積比（Y）和含量（X）進行加權回歸，得到Y=00013X+00024 （R2=09937，n=6），表明1-羥基咪達唑侖在10-1000ng范圍內與峰面積線性關系良好，結果見圖4。

33陽性對照組酮康唑對rCYP3A4酶相對活性計算 IC50為006538μmol/l，95%區(qū)間為004542～00941，符合文獻[8]范圍（006～016μmol/l），表明所用的孵育體系可以滿足CYP3A4酶抑制活性的評價及測定其他抑制劑IC50的要求。

34對rCYP3A4活性影響的初步篩選由表3可看出：黃連上清丸、牛黃解毒丸對CYP3A4 酶表現出誘導作用，護肝片對CYP3A4 酶表現出抑制作用。

4討論

CYP3A4肝臟和腸道重要代謝酶，含量可達到肝臟CYP450總量的60%，腸道CYP450總量的70%[9]，是藥物代謝的主角。中成藥說明書中【藥物相互作用】欄均未見報道，只是簡單書寫“如與其他藥物同時使用可能會發(fā)生藥物相互作用，詳情請咨詢醫(yī)師或藥師”。基于此，本研究對完善中成藥的說明書有一定幫助作用，對臨床合理用藥提供參考性依據。實驗結果顯示，黃連上清丸、牛黃上清丸對CYP3A4有誘導作用，護肝片對CYP3A4有抑制作用，護肝片的IC50為4055g，因此在使用時，要考慮其潛在的藥物相互作用。

參考文獻

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（收稿日期：20160328）