陳鴻 史荔 張俊 趙道洪 史磊陸秦楠 張啟 段祺輝 舒嵩華

1昆明市第一人民醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)外科（昆明650000）

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

3昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科

中國(guó)漢族人群前交叉韌帶損傷與β-fib基因多態(tài)性的相關(guān)性

陳鴻1史荔2張俊3趙道洪3史磊2陸秦楠1張啟1段祺輝1舒嵩華1

1昆明市第一人民醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)外科（昆明650000）

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

3昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科

目的：探索β-fib基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷發(fā)生的關(guān)系。方法：收集105名ACL損傷的漢族患者，以110名無ACL損傷史的漢族個(gè)體作為對(duì)照，通過限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析、測(cè)序技術(shù)對(duì)β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）進(jìn)行檢測(cè)并分型，開展病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果：β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)共檢出6個(gè)SNPs，包括;β-148C/T（rs1800787）、β-249C/T（rs1800788）、β-455G/ A（rs1800790）、β-854G/A（rs1800791）、β-933G/A（rs2227389）、β-1420G/A（rs1800789），其中rs1800790、rs1800788和rs1800787的AG、CT和CT基因表型頻率在病例組中高于對(duì)照組 （P＜0.05）。rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型C G A*、T G A*、T G G*在病例組和對(duì)照組中也顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：在中國(guó)漢族人群，β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)rs1800790、rs1800788和rs1800787及其單倍型可能與ACL損傷的發(fā)生相關(guān)。

前交叉韌帶損傷；β-fib基因多態(tài)性；病例對(duì)照研究

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是人體膝關(guān)節(jié)中重要的靜力性穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，ACL損傷在膝關(guān)節(jié)的損傷中較為常見，是引起膝關(guān)節(jié)功能障礙的常見因素之一[1]。 ACL損傷常使患者健康水平下降，將出現(xiàn)脛骨前移并導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，繼而出現(xiàn)半月板損傷，尤其內(nèi)側(cè)半月板損傷多見[2]，且ACL損傷時(shí)間越久，關(guān)節(jié)軟骨退變的范圍和程度越大[3]，結(jié)果會(huì)進(jìn)一步加速膝關(guān)節(jié)的退行性改變和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[4]。大量研究表明ACL損傷的患者關(guān)節(jié)炎發(fā)生的概率遠(yuǎn)高于無損傷的患者[5，6]。明確ACL損傷的原因?qū)⒂兄陬A(yù)防膝關(guān)節(jié)損傷，但目前ACL損傷發(fā)生的病因尚不清楚，Bahr等[7]認(rèn)為內(nèi)部因素和外部因素共同作用導(dǎo)致ACL損傷，而作為內(nèi)部危險(xiǎn)因素之一的遺傳因素逐漸受到人們的重視[8]。研究表明，在ACL損傷的發(fā)生過程中以及手術(shù)后，常常伴隨著纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）水平的顯著升高[9-11]。而β-fib基因決定纖維蛋白β多肽鏈的合成進(jìn)而影響血漿纖維蛋白原水平的大部分變化。由于不同人種或不同地區(qū)的人群存在基因異質(zhì)性，在中國(guó)人群中β-fib基因多態(tài)性是否與ACL損傷相關(guān)呢？本研究探討β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群ACL損傷發(fā)生的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）體格檢查膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)、磁共振（MRI）與關(guān)節(jié)鏡檢查明確ACL損傷；（2）除ACL損傷，不合并有膝關(guān)節(jié)其他部位的韌帶損傷。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）除ACL損傷，合并有膝關(guān)節(jié)其他部位的韌帶損傷；（2）既往風(fēng)濕或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、膝關(guān)節(jié)結(jié)核等膝關(guān)節(jié)疾病患者；（3）既往膝關(guān)節(jié)手術(shù)或外傷患者。

2011年10 月至2015年10月，研究包括105名ACL損傷患者和110名正常對(duì)照者：ACL損傷患者男73例、女32例，平均年齡33.62±11.18歲，左ACL損傷41例，右ACL損傷64例；正常對(duì)照者男69例、女41例，平均年齡35.57±12.78歲。均為漢族。臨床診斷前交叉韌帶損傷的方法主要包括：臨床膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性體格檢查提示膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，膝關(guān)節(jié)MRI檢查提示ACL異常信號(hào)，關(guān)節(jié)鏡檢查明確ACL損傷。本次試驗(yàn)的ACL損傷病例同時(shí)滿足以上三方面的檢查標(biāo)準(zhǔn)，上述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均不滿足者進(jìn)入對(duì)照組。本研究獲得昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及昆明醫(yī)科大學(xué)臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，經(jīng)患者和正常對(duì)照本人及其家屬同意并簽署同意書。

1.2DNA提取、定量

采集ACL損傷病例及對(duì)照組外周靜脈血5 ml， EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒提取樣本的基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品DNA進(jìn)行測(cè)定。電泳條件：4V/cm，2%瓊脂糖電泳45分鐘，凝膠成像。使用分光光度計(jì)ND-1000測(cè)定DNA濃度，調(diào)節(jié)DNA濃度至15 ng/μL～20 ng/μL。

1.3fib啟動(dòng)子SNP檢測(cè)

1.3.1PCR引物設(shè)計(jì)

用DNASTAR primerselect設(shè)計(jì)引物序列。引物設(shè)計(jì)完成后在UCSC上進(jìn)行PCR確認(rèn)擴(kuò)增序列準(zhǔn)確性和長(zhǎng)度。再將序列輸入NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，再次確認(rèn)序列準(zhǔn)確性和長(zhǎng)度；同時(shí)確認(rèn)擴(kuò)增序列中的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)是否是待檢測(cè)的SNP位點(diǎn)和酶切片段的長(zhǎng)度。最后抽取一些樣本進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。引物序列 （擴(kuò)增片段 1560bp）為：上游引物 （F）：5’-ACGTCACTAAAATAAAATCCTGTCTA-3’；下游引物（R）：5’-GAAGCTCCAAGAAACCATCC-3’

1.3.2PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系

10×PCR擴(kuò)增緩沖液2.0 μL、dNTP1.6 μL、正向引物0.2 μL、反向引物0.2 μL HostStart rTaq聚合酶0.1 μL、模板DNA 1.3 μL，再加入雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序 94℃，3 min（94℃，30 s；58.9℃，30 s；72℃，2 min）×30；72℃，10 min，4℃保存。

1.3.3雙向測(cè)序

擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，檢測(cè)β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Hardy-weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)病例組和對(duì)照組的基因頻率以及等位基因頻率。運(yùn)用SHEsis程序[12]（http：//analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php）分析統(tǒng)計(jì)β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)的基因型、等位基因及其單倍型頻率。位點(diǎn)的多態(tài)性與ACL損傷風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性用比值比（oddsratio，OR 值 ） 及 其 95% 可 信 區(qū) 間（confidenceintervals，CI）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)SNP檢測(cè)

β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)共檢出6個(gè)SNPs，包括；β-148C/T（rs1800787），β-249C/T（rs1800788），β-455G/A （rs1800790），β-854G/A（rs1800791），β-933G/A（rs222-7389），β-1420G/A（rs1800789）。測(cè)序結(jié)果如圖1。

2.2β-fib基因病例對(duì)照分析

2.2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

對(duì)照組與感染組等位基因的頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P值均＞0.05），說明人群具有代表性。

圖1 β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)SNPs測(cè)序結(jié)果

2.2.26個(gè)SNPs在病例組與對(duì)照組中等位基因頻率與基因型頻率比較

研究比較了6個(gè)SNPs在病例組和對(duì)照組中等位基因頻率，以及基因型頻率分布。結(jié)果6個(gè)SNPs等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中未顯示差異 （P值均＞0.05），但 rs1800790、rs1800788和 rs1800787的AG、CT和CT基因表型頻率在病例組中高于對(duì)照組，其差異具有顯著性意義，P值分別為0.0045、0.0022和0.010。這提示rs1800790、rs1800788和rs1800787可能與ACL的發(fā)生相關(guān)。結(jié)果見圖2和3。

圖2 β-fib基因6個(gè)SNPs等位基因頻率比較

圖3 β-fib基因6個(gè)SNPs基因型頻率比較

圖4 β-fib基因6個(gè)SNPs連鎖不平衡圖

2.2.36個(gè)SNPs連鎖不平衡分析

將β-fib基因6個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果如圖4顯示 ：rs2227389、rs1800791和rs1800790連鎖不平衡較高。其余位點(diǎn)之間連鎖程度較低。

2.2.4單倍型構(gòu)建及病例對(duì)照分析

根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果，構(gòu)建了rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型，并進(jìn)行對(duì)照病例分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C G A*，T G A*，T G G*單倍型顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型ACL病例—對(duì)照分析結(jié)果

3 討論

目前，ACL損傷的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，內(nèi)外多種因素都可能與ACL損傷的發(fā)生相關(guān)。長(zhǎng)期以來，學(xué)者們關(guān)注于ACL的三維空間結(jié)構(gòu)、三維力學(xué)機(jī)制的分析研究。但近年來，多種高風(fēng)險(xiǎn)因子的發(fā)現(xiàn)表明基因與基因、基因與環(huán)境的相互作用在ACL損傷發(fā)生中也起到非常重要的作用。研究表明：性別、家族因素、特殊的遺傳序列變異等也是ACL損傷發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)因素。ACL損傷在女性的發(fā)生率高于男性，Posthumus對(duì)Ⅴ型膠原基因COL5A1基因多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：女性ACL損傷患者COL5A1 BstUI RFLP CC基因型的頻率顯著高于對(duì)照[13]。另外，女性XII型膠原基因COL12A1 AluI RFLP AA型ACL損傷的風(fēng)險(xiǎn)也增高[14]。Khoschnau等觀察到Ⅰ型膠原基因COL1A1 Sp1結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性與ACL損傷減低相關(guān)[15]。而且ACL損傷患者親屬中ACL損傷的發(fā)生率高于正常，是正常的2倍，患者一級(jí)親屬的ACL損傷的發(fā)生率則達(dá)到2倍以上[16]。這些數(shù)據(jù)都提示遺傳因素在ACL損傷的發(fā)生中起到一定作用。對(duì)遺傳高風(fēng)險(xiǎn)因子的鑒別有利于確定在職業(yè)或非職業(yè)體育活動(dòng)中，重復(fù)性的機(jī)械負(fù)荷是否是導(dǎo)致個(gè)體損傷增加的因素，而且有助于在未來的治療中，針對(duì)不同個(gè)體采用最有效的治療方法。同時(shí)，遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素也是決定損傷預(yù)后的重要因素。因此，ACL損傷的遺傳機(jī)制分析越來越受到重視，研究表明除了膠原蛋白（COL1A1，COL5A1，COL12A1）基因，還有基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體-2（KDR）、肌原纖蛋白2（FBN2）等基因編碼或表達(dá)ACL的結(jié)構(gòu)，并與ACL損傷有關(guān)[17-19]。

纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）是肝臟合成的一種血漿球蛋白，由完全相同的兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含有α、β、γ三條肽鏈，主要作為凝血因子Ⅰ 參與凝血，是凝血系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)，它在凝血過程的最后階段被凝血酶切斷纖維蛋白原α鏈N-末端區(qū)域的纖維蛋白肽A和β鏈N-末端區(qū)域的纖維蛋白肽B而生成纖維蛋白單體，最終形成不溶性纖維蛋白凝塊而發(fā)揮血液凝固作用。纖維蛋白原3對(duì)多肽鏈分別由3條獨(dú)立的基因（α、β、γ）編碼，其中纖維蛋白原Bβ鏈的mRNA合成被認(rèn)為是控制整個(gè)分子合成的限速步驟，所以β-fib基因決定了纖維蛋白β多肽鏈的合成進(jìn)而影響血漿纖維蛋白原水平的大部分變化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性進(jìn)行初步研究，共檢出6個(gè)SNPs：β-148C/T（rs1800787），β-249C/T（rs1800788），β-455G/ A （rs1800790），β-854G/A （rs1800791），β-933G/A （rs2227389），β-1420G/A（rs1800789）。病例對(duì)照分析結(jié)果表明：rs1800790，rs1800788和rs1800787的AG、CT 和CT基因表型頻率在病例組中高于對(duì)照組，其差異具有顯著性意義，P值分別為0.0045、0.0022和0.010。進(jìn)一步構(gòu)建的rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型C G A*、T G A*、T G G*在病例組和對(duì)照組中也顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。近年來的研究也表明，在ACL損傷的發(fā)生過程中以及手術(shù)后，常常伴隨著纖維蛋白原水平的顯著升高[9-11]。

4 結(jié)論

綜上所述，在中國(guó)漢族人群，β-fib基因啟動(dòng)子區(qū)rs1800790、rs1800788和rs1800787及其單倍型可能與ACL損傷的發(fā)生相關(guān)。

[1]Kilcoyne KG，Dickens JF，Haniuk E，et al．Epidemiology of meniscal injury associated with ACL tears in young athletes [J]．Orthopedics，2012，35（3）：208-212．

[2]吳毅，蔡道章，趙暢，等．成人前交叉韌帶斷裂并半月板損傷的臨床研究[J/CD]．中華關(guān)節(jié)外科雜志電子版，2015，9（4）：483-487．

[3]劉偉樂，易瑜華，孫春漢，等．關(guān)節(jié)滑液血管活性腸肽水平與膝前交叉韌帶損傷后關(guān)節(jié)軟骨退變相關(guān)性研究 [J/CD]．中華關(guān)節(jié)外科雜志電子版，2015，9（4）：438-444．

[4]Lohmander LS，Englund PM，Dahl LL，et al.The long-term consequence of anterior cruciate ligament and meniscus injuries：osteoarthritis[J].Am J Sports Med，2007，35（10）：1756-1769.

[5]Blagojevic M，Jinks C，Jeffery A，et al.Risk factors for onset of osteoarthritis of the knee in older adults：a systematic review and meta-analysis[J]．Osteoarthritis Cartilage，2010，18：24-33．

[6]Muthuri SG，McWilliams DF，Doherty M，et al．History of knee injuries and knee osteoarthritis：a meta-analysis of observational studies [J]．Osteoarthritis Cartilage，2011，19：1286-1293．

[7]Bahr R，Krosshang T.Understanding injury mechanisms：a key component of preventing injuries in sport[J].Br J Sports Med，2005，39（6）：324-329.

[8]Alentorn-Geli E，Myer GD，Silvers HJ，et al.Prevention of noncontactanteriorcruciate ligamentinjuriesin soccer players.Part 1：Mechanisms of injury and underlying risk factors[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2009，17（7）：705-729.

[9]Bosmans T，Gasthuys F，Duchateau L，et al.A comparison of tepoxalin-buprenorphine combination and buprenorphine for postoperative analgesia in dogs：a clinical study[J].J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med，2007，54（7）：364-369.

[10]Murray MM，Spindler KP，Ballard P，et al.Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligament with a collagen-platelet-rich plasma scaffold[J].J Orthop Res，2007，25（8）：1007-1017.

[11]Wang C，Ao Y，Wang J，et al.Septic arthritis after arthroscopic anterior cruciate ligamentreconstruction：a retrospective analysis of incidence，presentation，treatment，and cause[J].J Orthop Res，2009，25（3）：243-249.

[12]Shi YY，He L.SHEsis，a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium，haplotype construction，and genetic association at polymorphism loci[J].Cell Res，2005，15（2）：97-98.

[13]Posthumus M，SeptemberAV，O’cuinneagain D，etal．The COL5A1 gene is associated with increased risk of anterior cruciate ligament ruptures in female participants[J]．Am J Sports Med，2009，37（11）：2234-2240．

[14]Posthumus M，SeptemberAV，O’cuinneagain D，etal．The association between the COL12A1 gene and anterior cruciate ligament ruptures[J]．Br J Sports Med，2010，44（16）：1160-1165．

[15]Khoschnau S，Melhus H，Jacobson A，et al.Type I collagen alpha1 Sp1 polymorphism and the risk of cruciate ligament ruptures or shoulder dislocations[J].Am J Sports Med，2008，36：2432-2436.

[16]Flynn RK，Pedersen CL，Birmingham TB，et al.The familial predisposition toward tearing the anterior cruciate ligament：a case control study[J].Am J Sports Med，2005，33（1）：23-28.

[17]Posthumus M，September AV，Keegan M，et al．Genetic risk factors for anterior cruciate ligament ruptures：COL1A1 gene variant[J]．Br J Sports Med，2009，43（5）：352-356．

[18]Collins M，Raleigh SM. Genetic risk factors for musculoskeletal soft tissue injuries[J]．Med Sport Sci，2009，54：136-149.

[19]Khoury LE，Posthumus M，Collins M，et al．ELN and FBN2 gene variants as risk factors for two sports-related musculoskeletal injuries[J]．Int J Sports Med，2015，36（4）：333-337．

Association of β-fib gene polymorphisms with ACL injury in Chinese Han Population

Chen Hong1，Shi Li2，Zhang Jun3，Zhao Daohong3，Shi Lei2，Lu Qinnan1，Zhang Qi1，Shu Songhua1
1 Sports Medicine and Joint Surgery，The First People’s Hospital of Kunming，Yunnan 650000，China
2 Institute of Medical Biology，Chinese Medical Sciences Academy，Yunnan 650000，China
3 Department of Orthopedics，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan 650000，China

Lu Qinnan，Email：luqinnanyn@163.com

ObjectiveTo investigate the association of polymorphisms of β-fib gene with anterior cruciate ligament（ACL）injury in Chinese Han population.MethodOne hundred and five ACL injury patients were recruited in an experimental group，while 110 healthy counterparts were selected into a controll group.RFLP analysis and genetic sequencing technology were applied to detect and classify the single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the β-fib gene promoter region.Then association analysis was conducted.Result In the β-fib gene promoter region，6 SNPs were detected as follow：β-148C/T （rs1800787），β-249C/T （rs1800788），β-455G/A （rs1800790），β-854G/A （rs1800791），β-933G/A （rs2227389），，β-1420G/A （rs1800789））.Moreover，the AG，CT and CT phenotypes of β-fib rs1800790，rs1800788 and rs1800787 gene were found significantly more in the experimental group than the control group （P＜0.05）.Significant differences were also found in the appearance of rs2227389-rs1800791-rs1800790 haplotype CGA*，TGA*，TGG* between the 2 groups.Conclusionβ-fib rs1800790，rs1800788 and rs1800787 genes and their haplotypes were related to ACL injury in Chinese Han population.

ACL injury，β-fib gene polymorphism，association analysis

2016.01.19

云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)）（40210029）

陸秦楠，Email：luqinnanyn@163.com