鄒同雷 汪芳俊 侯賽男 孫雪 徐年軍

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

兩種水楊酸代謝相關(guān)酶在逆境龍須菜中的活性研究

鄒同雷 汪芳俊 侯賽男 孫雪 徐年軍

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

旨在探索水楊酸（Salicylic acid，SA）信號(hào)通路相關(guān)的兩種酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-GA）在病爛、鹽度、溫度逆境和添加SA條件下在龍須菜中的活性變化。結(jié)果表明，3組病爛龍須菜中PAL和β-1，3-GA活性分別增加為對(duì)照組的1.27-1.42倍和1.26-1.35倍；高鹽條件下PAL活性與對(duì)照組無(wú)顯著差別，而β-1，3-GA活性在24 h和48 h分別增加為對(duì)照組的1.90倍和1.42倍；高溫組PAL和β-1，3-GA活性在24 h均顯著升高，分別是對(duì)照組的1.25倍和1.27倍；100 μmol/L SA添加后PAL和β-1，3-GA的活性升高，但高濃度SA卻抑制了兩種酶的活性。結(jié)果表明，在逆境脅迫下龍須菜中PAL和β-1，3-GA的活性增加與水楊酸的抗逆作用有關(guān)，而100 μmol/L SA誘導(dǎo)兩種酶的效果最顯著。

龍須菜；水楊酸；苯丙氨酸解氨酶；β-1，3-葡聚糖酶

水楊酸（Salicylic acid， SA），又名鄰羥基苯甲酸，是植物體內(nèi)普遍存在的一種小分子酚類(lèi)物質(zhì)，最早是從柳樹(shù)葉和樹(shù)皮中分離得到的［1］。SA參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的多種生理生化過(guò)程，響應(yīng)植物體遭遇的各種非生物和生物壓力，如干燥、寒冷、重金屬、熱和滲透壓脅迫以及作為內(nèi)源信號(hào)調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)，在植物體 整個(gè)生活周期中起到極其重要的“監(jiān)管”作用［2-4］。植物體內(nèi)有兩條SA合成途徑：苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）介導(dǎo)的肉桂酸途徑和異分支酸合成酶（Isochorismate synthase，ICS）介導(dǎo)的異分支酸途徑［5，6］。其中PAL催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸和氨，是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類(lèi)代謝、催化苯丙烷類(lèi)代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶［7］。PAL主要通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)SA的含量來(lái)調(diào)節(jié)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)植物體面對(duì)各種生物和非生物脅迫下的抗逆性［8］。該酶在陸地植物中廣泛存在，但在低等藻類(lèi)植物中未見(jiàn)報(bào)道，但推測(cè)藻類(lèi)植物中存在PAL類(lèi)似酶。如Moffitt等［9］從藍(lán)藻中篩選到的PAL比真核生物同源物要小20%，結(jié)構(gòu)解析表明這兩種藍(lán)藻的PAL在高級(jí)結(jié)構(gòu)上與植物和酵母PAL相似，且與芳香族氨基酸解氨酶家族的組氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Histidine ammonia-lyase，HAL）相似。

β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，β-1，3-GA）屬于糖基水解酶家族，廣泛分布于植物、真菌和細(xì)菌中。在植物中，該酶與植物細(xì)胞分裂、花粉管生長(zhǎng)、種子萌發(fā)等多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有關(guān)［10］。如在溫度變化及脫落酸等脅迫下β-1，3-GA過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子發(fā)芽性能較好［11］。β-1，3-GA是病原相關(guān)蛋白2（Pathogenesis-related protein，PR-2）的家族成員，在植物抗病過(guò)程中該酶及其基因表達(dá)顯著增加［12，13］。除了細(xì)菌和真菌等病原物的誘導(dǎo)之外，β-1，3-GA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)還受NaCl、受傷、寒冷、H2O2等非生物脅迫和SA、脫落酸、茉莉酸甲酯等植物激素的誘導(dǎo)［14］。

龍須菜（G racilariopsis lemaneiformis）是紅藻門(mén)的一種大型經(jīng)濟(jì)海藻，常被用作瓊膠提取和鮑魚(yú)養(yǎng)殖或者加工成海洋風(fēng)味食品，同時(shí)龍須菜還具有較強(qiáng)的 N、P 吸收能力，是富營(yíng)養(yǎng)化海區(qū)重要的修復(fù)材料。在我國(guó)從南到北沿海各省，尤其是福建、浙江和廣東等都有龍須菜養(yǎng)殖。但夏季天氣炎熱，南方養(yǎng)殖龍須菜容易病爛，不適合養(yǎng)殖。本研究擬探討水楊酸代謝途徑關(guān)鍵酶PAL和誘導(dǎo)酶β-1，3-GA在病爛、高鹽、高溫逆境脅迫下及外源添加SA后的活性變化，從而揭示這兩種酶與SA的抗生物和非生物脅迫作用之間的關(guān)系，為龍須菜的抗逆抗病養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為龍須菜981品種，采自浙江溫州。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的藻體，置于實(shí)驗(yàn)室23℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，添加Provasoli培養(yǎng)基［15］，光強(qiáng)2 000 lux，光周期L∶D（12 h∶12 h）。

1.2 方法

1.2.1 病爛實(shí)驗(yàn) 海區(qū)采集的龍須菜，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)一段時(shí)間后部分龍須菜出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，挑選剛開(kāi)始潰爛的龍須菜作為病爛組，以同一區(qū)域健康龍須菜為對(duì)照組，分別測(cè)定PAL和β-1，3-GA的活性。選取4對(duì)病爛組和其相應(yīng)的對(duì)照組，每組3個(gè)平行。

1.2.2 高鹽實(shí)驗(yàn) 將龍須菜分別培養(yǎng)在35‰鹽度人工海水中，以25‰鹽度海水為對(duì)照，分別測(cè)定在24 h、48 h的PAL和β-1，3-GA的活性。

1.2.3 高溫實(shí)驗(yàn) 將龍須菜置于33℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以23℃培養(yǎng)藻做對(duì)照組，分別測(cè)定兩組藻在24 h、48 h的PAL和β-1，3-GA的活性。

1.2.4 水楊酸添加實(shí)驗(yàn) 在33℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的龍須菜中，分別添加水楊酸至終濃度分別為0、100、200、300和400 μmol/L，每組3個(gè)平行，分別測(cè)定24 h、48 h的PAL和β-1，3-GA的活性。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定 使用PAL試劑盒（GY5，蘇州科銘生物公司）。PAL催化L-苯丙氨酸解氨酶裂解為反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290 nm處有最大吸收值，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率計(jì)算PAL活性。按樣本鮮重計(jì)算：PAL（U/g鮮重）=DA×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷0.05÷T=26.6× DA÷W（DA：實(shí)驗(yàn)組吸光度-對(duì)照組吸光度；V反總：反應(yīng)體系總體積，200 μL；V樣：加入樣本體積，5 μL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；W：樣品鮮重）。每克藻體在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘使290 nm下吸光值變化0.05定義為一個(gè)酶活性單位。

1.2.6 β-1，3-葡聚糖酶活性測(cè)定 采用β-1，3-葡聚糖酶活性測(cè)定試劑盒（SY12，蘇州科銘生物公司）。β-1，3-葡聚糖酶水解昆布多糖，內(nèi)切β-1，3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端，通過(guò)測(cè)定還原糖生成的速率計(jì)算酶活性。按樣本鮮重計(jì)算：β-1，3-GA（U/g鮮重）=［（DA+0.0192）÷0.0497×V1］÷（W×V1÷V2）=20.876×（DA+0.0192）÷W（V1：加入反應(yīng)體系中的樣本體積，0.035 mL；V2：加入提取液體積，1 mL；W：樣本鮮重，g）。每克藻體每小時(shí)產(chǎn)生1 mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 利用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行作圖與數(shù)據(jù)處理，使用SPSS13.0獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析中的Duncan進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 病爛對(duì)PAL和β-13-GA活性的影響

病爛龍須菜中PAL、β-1，3-GA的活性多高于健康對(duì)照藻（圖1）。如圖1-A所示，在4組健康和病爛龍須菜中，2、3、4組中病爛藻的PAL活性分別為29.41、83.67和22.79 U/g鮮重，是相應(yīng)健康對(duì)照藻的1.42、1.29和1.27倍，且與各自對(duì)照差異顯著（P<0.05）。圖1-B所示，在1、2、3組中病爛藻的β-1，3-GA的活性分別為28.63、32.85和36.88 U/g鮮重，是相應(yīng)健康對(duì)照藻的1.26、1.29和1.35倍（P<0.05）?？傮w來(lái)看，與健康龍須菜相比，病爛藻中PAL和β-1，3-GA活性顯著增加。

圖1 病爛對(duì)PAL和β-1，3-GA活性的影響

2.2 鹽度對(duì)PAL和β-13-GA活性的影響

以25‰鹽度為對(duì)照，不同鹽度對(duì)PAL、β-1，3-GA活性的影響（圖2）顯示，兩種酶的活性都有所提高且在48 h均略高于24 h。如圖2-A所示，高鹽組PAL活性在24 h和48 h分別是相應(yīng)對(duì)照組的1.21倍和1.23倍，但無(wú)顯著差異。如圖2-B所示，24 h高鹽組β-1，3-GA活性（21.69 U/g鮮重）是對(duì)照組的1.90倍（P<0.05），48 h高鹽組β-1，3-GA活性（68.45 U/g鮮重）是對(duì)照組的1.42倍（P<0.05）。總體來(lái)看，高鹽處理對(duì)β-1，3-GA的活性影響較顯著。

圖2 鹽度對(duì)PAL和β-1，3-GA活性的影響

2.3 溫度對(duì)PAL和β-13-GA活性的影響

以23℃為對(duì)照，不同溫度對(duì)兩種酶活性的影響結(jié)果（圖3）顯示，33℃培養(yǎng)下龍須菜中PAL和β-1，3-GA的活性均有所提高。在24 h，高溫組PAL活性達(dá)到33.48 U/g鮮重，是對(duì)照組的1.25倍（P<0.05）；但在48 h，PAL活性?xún)H為對(duì)照組的1.11倍，無(wú)顯著差異。高溫組β-1，3-GA在24 h的活性（33.48 U/g鮮重）是對(duì)照組的1.27倍（P<0.05），48 h的活性是對(duì)照組的1.15倍，但無(wú)顯著差異?？傮w來(lái)看，高溫組PAL和β-1，3-GA活性在24 h增加顯著。

圖3 溫度對(duì)PAL和β-1，3-GA活性的影響

2.4 SA濃度對(duì)PAL和β-13-GA活性的影響

以不添加水楊酸為對(duì)照組，100 μmol/L SA添加后PAL和β-1，3-GA都表現(xiàn)出最大活性，隨著SA濃度的繼續(xù)增高，兩種酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖4）。

PAL在24 h和48 h的酶活性測(cè)定結(jié)果（圖4-A）顯示，在24 h 100 μmol/L SA處理后PAL活性達(dá)到最大值（41.41 U/g鮮重），是對(duì)照組的1.13倍（P>0.05），而300和400 μmol/L SA添加后PAL活性分別是對(duì)照組的0.86倍和0.49倍（P<0.05），可見(jiàn)高于300 μmol/L SA顯著抑制了PAL的活性。在48 h，除了100 μmol/L SA促進(jìn)了PAL活性升高（是對(duì)照組的1.26倍）之外，其余3種濃度SA添加后PAL活性分別為對(duì)照組的0.74倍、0.57倍和0.46倍，均與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。

β-1，3-GA在24 h和48 h的酶活性測(cè)定結(jié)果（圖4-B）顯示，在24 h 100 μmol/L SA處理后β-1，3-GA活性達(dá)到最大值（36.64 U/g鮮重），是對(duì)照組的1.35倍（P<0.05），但200-400 μmol/L SA與對(duì)照組無(wú)顯著差異。在48 h，100 μmol/L SA促進(jìn)了PAL活性升高，是對(duì)照組的1.34倍（P<0.05），而400 μmol/L SA添加后β-1，3-GA活性是對(duì)照組的0.76倍，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），可見(jiàn)400 μmol/L SA顯著抑制了β-1，3-GA在48 h的活性。

上述結(jié)果表明，100 μmol/L SA促進(jìn)了PAL和β-1，3-GA活性的增加，而高濃度SA則抑制了兩種酶的活性，且多具有一定的劑量效應(yīng)。

圖4 水楊酸濃度對(duì)PAL和β-1，3-GA活性的影響

3 討論

3.1 PAL和β-13-GA參與的植物抗病性

PAL是SA代謝關(guān)鍵酶，β-1，3-GA是受水楊酸誘導(dǎo)的一種糖基水解酶，兩者在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。高峰等［16］研究表明噴施水楊酸后PAL、β-1，3-GA、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性上升，可能是水楊酸誘導(dǎo)棉花耐黃萎病的抗病性提高的一個(gè)重要原因。在馬鈴薯抗性品種中PAL和β-1，3-GA活性要高于敏感品種［17］。本研究中PAL和β-1，3-GA各做了4個(gè)病爛與健康對(duì)照組，PAL和β-1，3-GA中分別有3組的病爛龍須菜活性顯著高于健康龍須菜。推測(cè)可能是在龍須菜遭遇病爛脅迫時(shí)，兩種酶的活性迅速增加，參與龍須菜的抗病防衛(wèi)。

3.2 PAL和β-13-GA參與的植物抗逆性

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭遇各種各樣的非生物脅迫，如溫度脅迫、鹽度脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、干旱脅迫、重金屬脅迫等。PAL和β-1，3-GA參與了SA介導(dǎo)的信號(hào)通路以抵抗外界各種脅迫，維持植物的正常生長(zhǎng)。在低溫脅迫下的黃瓜幼苗中，與ICS相比，PAL活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)均增加，說(shuō)明PAL途徑在冷刺激誘導(dǎo)的SA合成過(guò)程中占據(jù)主要地位［18］。添加10 μmol/L MJ和 2 mmol/L SA后冷藏檸檬水果抗寒性增加，與激素添加后增強(qiáng)了總酚含量和PAL活性并抑制了POD活性有關(guān)［19］。在高鹽脅迫下，外源SA的添加使長(zhǎng)春花中PAL活性顯著增加，并改變了抗氧化物和酚類(lèi)代謝，產(chǎn)生抗鹽性［20］。在低營(yíng)養(yǎng)脅迫下，牽牛花子葉中PAL活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)，SA含量升高，誘導(dǎo)牽?；ㄕｉ_(kāi)花［21］。Hwang等［22］從水稻中克隆了27條β-1，3-glucanases基因，有些受H2O2、衰老、NaCl、冷及受傷等環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)主要設(shè)置了高鹽和高溫兩種脅迫條件。高鹽脅迫下，PAL活性在24 h和48 h均與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而β-1，3-GA活性均顯著高于對(duì)照組。33℃高溫培養(yǎng)下，高溫組PAL和β-1，3-GA活性均在24 h高于對(duì)照組，而48 h均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，β-1，3-GA在受NaCl脅迫中活性變化比PAL明顯，這與該酶受NaCl誘導(dǎo)的報(bào)道一致［14，22］，而兩種酶在耐受高溫脅迫中短期作用更明顯一些。

3.3 SA對(duì)PAL和β-13-GA活性的影響

外源SA作為一種激發(fā)子或外源信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)PAL和β-1，3-GA的基因表達(dá)，增加PAL和β-1，3-GA的活性。如水楊酸、草酸、CaCl2等誘導(dǎo)子可以顯著增強(qiáng)梨中的β-1，3-GA、PAL、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶等防御相關(guān)酶的活性［23］。受SA誘導(dǎo)，黃花蒿（Artemisia annua）中PAL轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)［24］。外源水楊酸鈉的添加可誘導(dǎo)康萍和浮萍的愈傷組織胞內(nèi)和胞外β-1，3-GA活性增強(qiáng)［25］。

在本研究中，100 μmol/L SA添加后PAL和β-1，3-GA活性顯著增加，表明100 μmol/L SA誘導(dǎo)了PAL和β-1，3-GA的合成，導(dǎo)致兩種酶活性增加。這與SA可作為誘導(dǎo)子增強(qiáng)PAL和β-1，3-GA活性的報(bào)道一致［26-28］。隨著SA濃度的升高，兩種酶的活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，如400 μmol/L SA處理后PAL和β-1，3-GA活性顯著降低，這可能與SA誘導(dǎo)信號(hào)通路中的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。同時(shí)，也與本課題組前期研究中100 μmol/L SA可以緩解高溫對(duì)龍須菜生長(zhǎng)的不利影響而高濃度SA則會(huì)抑制其生長(zhǎng)的結(jié)果相符（資料尚未發(fā)表）。

4 結(jié)論

本研究分析了低等藻類(lèi)植物龍須菜中兩種酶的活性變化，結(jié)果表明PAL和β-1，3-GA在病爛、高鹽和高溫逆境下活性增加，推測(cè)兩種酶在龍須菜的抗病抗逆過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。此外，外源SA可以誘導(dǎo)龍須菜中PAL和β-1，3-GA活性增加，100 μmol/L SA可產(chǎn)生最佳誘導(dǎo)效果，而濃度過(guò)高則使兩種酶活性受抑制。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

On the Activities of Two Enzymes Related to Salicylic Acid Metabolism in Gracilariopsis lemaneiformis Under Adverse Environment

ZOU Tong-lei WANG Fang-jun HOU Sai-nan SUN Xue XU Nian-jun
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，Ningbo 315211）

The article mainly studied two enzymes related to Salicylic acid（SA） signaling pathway：phenylalanine ammonia-lyase（PAL）and β-1，3-glucanase（β-1，3-GA）in marine algae Gracilariopsis lemaneiformis，and measured their activity change under sick，high salt，high temperature stresses and addition of SA. Results showed that the activities of PAL and β-1，3-GA in G. lemaneiformis of 3 sick groups increased 1.27-1.42 times and 1.26-1.35 times compared to healthy groups，respectively. For high salt stress，the activities of PAL had no significant difference from the control，whereas β-1，3-GA increased 1.90 times and 1.42 times at 24 h and 48 h compared to the control，respectively. The activities of PAL and β-1，3-GA under high temperature stress increased 1.25 times and 1.27 times compared to the control groups. The activities of PAL and β-1，3-GA increased after adding 100 μmol/L SA，but high concentration of SA inhibited the activities of 2 enzymes. This study indicated that the increases of activities of PAL and β-1，3-GA in G. lemaneiformis might be associated with the SA resistance to environment. In addition，100 μmol/L SA had the most significant effect on the induction of PAL and β-1，3-GA activities.

Gracilariopsis lemaneiformis；salicylic acid；phenylalanine ammonia-lyase；β-1，3-glucanase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.026

2015-08-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41376151），國(guó)家教育部博士點(diǎn)博導(dǎo)基金項(xiàng)目（20123305110002），寧波大學(xué)學(xué)科項(xiàng)目（xkl141053）

鄒同雷，男，碩士研究生，研究方向：藻類(lèi)生化與分子生物學(xué)；E-mail：326428653@qq.com

孫雪，女，副研究員，研究方向：藻類(lèi)生化與分子生物學(xué)；E-mail：sunxue@nbu.edu.cn