錢　旭， 甘會云， 杜勇濤， 張　鮮， 陳　曄， 樊有賦

( 九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 江西 九江 332000 )

龍南鉀礦區(qū)常見蕨類植物可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性

錢旭， 甘會云， 杜勇濤， 張鮮， 陳曄*， 樊有賦

( 九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 江西 九江 332000 )

摘要：植物內(nèi)生真菌作為一類特殊的微生物資源，與宿主在長期的生態(tài)系統(tǒng)演化過程中形成了互惠共生關(guān)系,通過多樣化途徑來增強植物體的營養(yǎng)生理和抗性機能，對宿主植物產(chǎn)生多種有益生物學(xué)作用，在植物演替過程中具有重要的生態(tài)學(xué)意義。這種特殊微生物資源近年來倍受關(guān)注，而利用植物-真菌共生體強化植物在礦區(qū)逆境中生長，提高礦區(qū)生物修復(fù)效率是一個新的研究熱點。為探明鉀礦區(qū)不同蕨類植物內(nèi)生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態(tài)分布規(guī)律，該研究以芒萁、狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙、華中鐵角蕨、井欄邊草和烏蕨等植物為材料，采用組織分離、形態(tài)學(xué)鑒定等方法，對其內(nèi)生真菌多樣性進行分析。結(jié)果表明：從7種植物中共分離獲得377株內(nèi)生真菌，總分離率在2.50%～4.52%之間。經(jīng)鑒定377個菌株隸屬于鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢菌屬和輪枝孢屬等25個分類單元，其中鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢菌屬和輪枝孢屬等在所有被調(diào)查蕨類植物中都有分布，為優(yōu)勢屬，共計為185株，占總株數(shù)的49.07%，但它們在每種植物的分布存在明顯差異；7種蕨類植物內(nèi)生真菌總定植率為葉高于根狀莖 (P<0.05)，多樣性指數(shù)在0.502～0.867之間，但每種植物及其不同組織部位的內(nèi)生真菌定植率和多樣性指數(shù)存在一定的差異；從相似性分析來看，同一個鉀礦區(qū)不同蕨類植物內(nèi)生真菌菌群之間的相似性程度較低，相似性系數(shù)在0.189～0.587之間。該研究結(jié)果不僅豐富了植物內(nèi)生真菌種質(zhì)資源，而且為進一步開展植物內(nèi)生真菌強化宿主植物在鉀礦區(qū)生長適應(yīng)機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鉀礦區(qū)， 蕨類植物內(nèi)生真菌， 優(yōu)勢菌群， 多樣性指數(shù)， 相似性系數(shù)

鉀是植物生長發(fā)育必需元素之一，土壤中的鉀可分成礦物鉀(占90%左右)、緩效鉀(2%～8%)和速效鉀(0.1%～0.2%)。礦物鉀是植物難以利用的鉀，如長石和白云母中的鉀。各種形態(tài)鉀的含量及其相對活性，決定了鉀對植物的有效性。如何將礦物鉀中營養(yǎng)元素溶出，形成有利于植物吸收的活性物質(zhì)倍受關(guān)注(蔣梅茵，1982；徐曉燕和馬毅杰,2001; 潘大偉等,2005)。植物內(nèi)生真菌作為一類特殊的微生物資源，具有分布廣、種類多等特點。自20世紀80年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對溫帶、亞熱帶、熱帶、鹽堿地等不同生境植物內(nèi)生真菌多樣性進行了調(diào)查研究(Tejesvi，2011；Jyoti et al，2012；Kristin et al，2012；劉愛榮等，2010)。研究表明，植物內(nèi)含有較豐富的內(nèi)生真菌資源，受組織、環(huán)境等因素的影響體現(xiàn)出一定的組織、宿主差異性(郭良棟，2000)。植物內(nèi)生真菌與宿主在長期的生態(tài)系統(tǒng)演化過程中形成了互惠共生關(guān)系,對宿主植物產(chǎn)生多種有益生物學(xué)作用(郭良棟，2000；Atsatt & Whiteside，2014)。應(yīng)用植物—微生物共生體強化植物在礦區(qū)逆境中生長已成為新的研究熱點(牛之欣等，2009)。

目前，內(nèi)生真菌的宿主植物研究主要集中在種子植物，而有關(guān)蕨類等孢子植物內(nèi)生真菌多樣性及其生態(tài)功能活性研究的報道卻相對很少(張君誠等，2010；鄒文欣等，2001)。蕨類植物是一類較原始的高等植物，也是較早的陸生植物?，F(xiàn)存的蕨類植物約有12 000種，世界各地均有分布，具有豐富的物種多樣性。蕨類植物具有抗逆境能力強、生長迅速、繁殖能力強等特點，是較理想的植物修復(fù)資源(褚磊等，2007)。具有內(nèi)生真菌定植的蕨類植物有Pteridiumaquilinu,Equisetumhyemale,Botrychiumternatum,Huperziaserrata,Huperziaserratavar.longipetiolata,Huperziaappressa,Huperziacrispata,Phlegmariuruscryptomerianus,Schizaeapusilla，Nodulisporiumsp.，Nephrolepisexaltata等(Gabel et al，1996；Petrini et al，1992；Sati et al，2006，2009；石瑋等，2005；鞠鏨等，2009；樊有賦等，2008；巫婷玉等，2012；詹壽發(fā)等，2007，2012；Riyaz-UI-Hassan et al，2013; Thangavelu & Kandasamy，2012)，但對蕨類植物內(nèi)生真菌的種類、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生態(tài)分布等尚缺乏全面系統(tǒng)地研究。

相對于豐富的蕨類植物資源，還有大量蕨類植物的內(nèi)生真菌亟待研究，特別是礦區(qū)環(huán)境蕨類植物內(nèi)生真菌的研究。本研究對采自江西省龍南縣鉀礦區(qū)7種常見蕨類植物進行內(nèi)生真菌的分離、純化和形態(tài)學(xué)鑒定，以探索鉀礦區(qū)蕨類植物內(nèi)生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態(tài)分布規(guī)律，為進一步探究植物內(nèi)生真菌對宿主植物在礦區(qū)適應(yīng)影響機制提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 樣地概況

龍南縣安基山鉀礦區(qū)位于江西省最南端龍南縣程龍鎮(zhèn)(114°23′～114°59′ E、24°29′～25°1′ N)，占地面積15 000 m2，年產(chǎn)鉀礦0.9 萬t，開采多年，礦區(qū)內(nèi)已堆積大量廢棄裸露礦渣(礦渣由鉀長石、白云母、黑云母等礦物組成，按照NY/T 889-2004標準測定礦渣速效鉀為13.714 mg/mL，占全鉀0.015%)，生長在礦渣上的植物只有少數(shù)蕨類等草本植物，無木本植物生長。

1.2 樣品采集處理

2013年7月上旬于江西省龍南縣程龍鎮(zhèn)安基山鉀礦區(qū)采集芒萁(Dicranopterislinearis)、狗脊(Woodwardiajaponica)、禾稈蹄蓋蕨(Athyriumyokoscense)、烏蕨(Stenolomachusanum)、海金沙(Lygodiumjaponicum)、華中鐵角蕨(Aspleniumsarelii)、井欄邊草(Pterismultifida)等7種常見蕨類植物樣本。采集方法：在隨機20 個10 m2樣地內(nèi)采集健康植株(每樣地間距200 m)，7 種植物各采集20 株健康植株。去除枯葉，地上葉部剪成10 cm帶葉柄段片，立即放入無菌塑料袋中，地下根狀莖連同土壤一起放入無菌塑料袋中，分別貼上標簽放入低溫采集箱內(nèi)帶回實驗室，4 ℃冰箱保藏，葉在2 d內(nèi)處理完畢，根狀莖在7 d內(nèi)處理完成。

1.3 內(nèi)生真菌分離純化

1.3.1 培養(yǎng)基改良的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，2%)培養(yǎng)基為分離、純化培養(yǎng)基，配比：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，10%蕨葉(蕨葉為每種植物自身葉片，如分離芒萁內(nèi)生真菌采用芒萁葉)水提液100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH(使用前在培養(yǎng)基中加80 U/mL慶大霉素1 mL)。

促孢培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。 1.3.2 分離純化按常規(guī)無菌操作方法(樊有賦等，2008；巫婷玉等， 2012；詹壽發(fā)等，2012)，葉部從每種植物樣品中隨機選取20段帶有葉片的小段片，自來水沖洗干凈；按下列程序進行表面消毒：體積分數(shù)75%乙醇漂洗2～3 min、無菌水沖洗3次，25% NaClO溶液漂洗5 min、無菌水沖洗3～4次，再用75%乙醇沖洗1 min、無菌水沖洗5次；將樣品置于無菌濾紙上吸干水分，剪成0.5 cm × 0.5 cm的片段，從每種植物樣品中隨機選取80個葉柄和80個葉片接到改良的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～10 d，每天觀察，若發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有菌落長出，則將菌轉(zhuǎn)接入斜面，經(jīng)純化后得到內(nèi)生真菌菌株。根狀莖在用25%NaClO溶液漂洗5 min、無菌水沖洗3～4次后，用0.1%升汞溶液浸泡5～8 s，無菌水沖洗4～5次，再用75%乙醇沖洗1 min、無菌水沖洗5次，其它步驟同地上部分。分離純化獲得的菌株保存于九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院真菌研究室(JJTU)。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

依據(jù)菌落形態(tài)、產(chǎn)孢方式、孢子形態(tài)特征和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)對菌株進行鑒定。將不產(chǎn)孢菌株在促孢培養(yǎng)基上進行促孢培養(yǎng)，并檢查其產(chǎn)孢情況，產(chǎn)孢后按上述方法進行鑒定。經(jīng)促孢培養(yǎng)后仍不產(chǎn)孢的菌株則根據(jù)菌落表面特征、菌絲顏色、菌絲生長速率等分為無孢類群的不同組。真菌屬的鑒定主要依據(jù)Barnett & Hunter(1998)；Keith et al(2011)等相關(guān)文獻。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

定植率(Colonization rates,CR)是指樣本中受內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)占樣本全部組織塊數(shù)的百分數(shù)；分離率(Isolation rate，IR)：分離到的某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占樣品組織塊總數(shù)比值；分離頻率(Isolation frequency，IF)：某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占獲得總內(nèi)生真菌菌株數(shù)比值。

采用Shannon指數(shù)(H)進行內(nèi)生真菌種群的多樣性水平分析。H=-∑[ni/Nln(ni/N)]。式中，ni為第i個內(nèi)生真菌菌株數(shù)目，N為全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)。

采用Jaccard相似性指數(shù)(Cj)對不同植物間內(nèi)生真菌組成的相似程度進行比較和分析。Cj=c/(a+b-c)。式中，a是一種植物內(nèi)生真菌的種類數(shù)，b是另一種植物內(nèi)生真菌的種類數(shù)，c是兩種植物共同具有的內(nèi)生真菌種類數(shù)，比較兩種植物之間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。

2結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離率和定植率

從龍南鉀礦區(qū)7種常見蕨類植物的葉片、葉柄和根狀莖的1 680個組織塊中共分離獲得377個菌株。從表1可見，7種蕨類植物內(nèi)生真菌的總分離率在2.50%～4.52%之間，其中烏蕨的內(nèi)生真菌總分離率最高(4.52%)，其它6種蕨類植物總分離率依次為禾稈蹄蓋蕨(3.63%)>海金沙(3.27%)>華中鐵角蕨(3.21%)>狗脊(2.74%)>井欄邊草(2.56%)>芒萁(2.50%)。在7種蕨類植物中烏蕨的內(nèi)生真菌總定植率最高(22.92%)，其余依次為禾稈蹄蓋蕨(17.08%)>華中鐵角蕨(16.25%)>海金沙(15.83%)>狗脊(15.42%)>井欄邊草(15.00%)>芒萁(14.17%)。從不同組織部位來看，7種蕨類植物內(nèi)生真菌總分離率和定植率的趨勢為葉高于根狀莖。這說明蕨類植物內(nèi)生真菌存在最主要部位是葉，而不是莖。

表 1　鉀礦區(qū)7種蕨類植物內(nèi)生真菌分離率和定植率

注： *為占總株數(shù)的百分數(shù)，P<0.05。

Note： * indicates the percentage of total strains number，P<0.05.

每種植物不同部位的內(nèi)生真菌分離率和定植率存在差異，其中狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙、烏蕨、芒萁等5種植物內(nèi)生真菌的定植率和分離率依次為葉柄>葉片>根狀莖，華中鐵角蕨、井欄邊草內(nèi)生真菌的定植率和分離率依次為葉片>根狀莖>葉柄。

2.2 內(nèi)生真菌類群組成

從鉀礦區(qū)7種常見蕨類植物中共分離獲得內(nèi)生真菌377個菌株，經(jīng)鑒定屬于鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢菌屬(Cladosporium)和輪枝孢屬(Verticillium)等25個分類單元(表2)。根據(jù)分離頻率判斷曲霉屬、枝孢菌屬、輪枝孢屬、鏈格孢屬和Exophiala等屬為7種植物內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬，其分離頻率分別為14.58%、13.26%、7.69%、7.16%和6.37%，5個屬共獲得菌株為185株，占總株數(shù)的49.07%。這5個分類單元從每種植物中分離獲得的菌株數(shù)存在明顯差異，鏈格孢屬在芒萁中最多(6株)，曲霉屬在狗脊中最多(12株)，枝孢菌屬在烏蕨中(16株)，Exophiala在禾稈蹄蓋蕨中最多(6株)，輪枝孢屬在井欄邊草中較多(7株)。其它20個分類單元在7種植物中分類獲得菌株數(shù)也存在一些差異，其中Penicillium除芒萁外均可從其它6種植物中分離獲得，并在井欄邊草中最多(7株)，Phomachrysanthemicola，Sclerococcum和Scytalidiym等3個分類單元獲得的菌株數(shù)最少，主要分布在禾稈蹄蓋蕨和烏蕨中。

2.3 不同植物的內(nèi)生真菌分布

表1研究結(jié)果表明，同一礦區(qū)不同植物中內(nèi)生真菌存在明顯差異，其中從烏蕨植物中獲得76個菌株，占總株數(shù)的20.16%。其中禾稈蹄蓋蕨占15.92%、海金沙占14.59%、華中鐵角蕨占14.32%、狗脊占12.20%、井欄邊草占11.41%、芒萁占11.14%。

表2結(jié)果表明，每種植物內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬不同。其中，狗脊的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為Aspergillus、Penicillium、Cladosporium和Monilia，共計25個菌株，占其總株數(shù)的54.35%；禾稈蹄蓋蕨的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為Cladosporium、Aspergillus、Exophiala和Fusarium，共計33個菌株，占其總株數(shù)的54.10%；烏蕨的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為Cladosporium、Monilia、Fusarium、Oidiodendron、Aspergillus和Alternaria，共計46個菌株，占其總株數(shù)的60.53%；海金沙內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬為Aspergillus、Cladosporium、Phomopsis和Penicillium，共計21個菌株，占其總株數(shù)的38.18%；華中鐵角蕨內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為Aspergillus、Verticillium、Alternaria、Exophiala和Phomopsis，共計29個菌株，占其總株數(shù)的53.70%； 井欄邊草的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為Penicilli-um、Verticillium、Aspergillus和Cladosporium，共計25個菌株，占其總株數(shù)的58.14%；芒萁內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬為Alternaria、Cephalosporium、Cladosporium、Verticillium和Aspergillus，共計29個菌株，占其總株數(shù)的69.05%。

表 2　鉀礦區(qū)7種蕨類植物內(nèi)生真菌種群組成

2.4 蕨類植物的內(nèi)生真菌多樣性與相似性

由表3可知，每種蕨類植物內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)不同，從高到低的順序為烏蕨(0.867)>禾稈蹄蓋蕨(0.728)>海金沙(0.692)>華中鐵角蕨(0.650)>狗脊(0.553)>井欄邊草(0.553)> 芒萁(0.553)，其中烏蕨內(nèi)生真菌多樣性最為豐富，多樣性指數(shù)為0.867，芒萁內(nèi)生真菌多樣性最低，多樣性指數(shù)為0.5020。從組織部位來看，內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)順序為葉片(1.69)>葉柄(1.374)>根狀莖(1.105)；每種植物不同組織部位的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)存在差異，其中狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙和烏蕨等4種植物的多樣性指數(shù)依次為葉柄>葉片>根狀莖， 而華中鐵角蕨和井欄邊草的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)依次為葉片>根狀莖>葉柄，芒萁不同組織部位內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)為葉柄=葉片>根狀莖。

表 3　蕨類植物內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)

對鉀礦區(qū)7種常見蕨類植物內(nèi)生真菌相似性分析表明， 不同植物之間內(nèi)生真菌種類組成的相似性

表 4　7種鉀礦區(qū)常見蕨類植物內(nèi)生真菌相似性系數(shù)

系數(shù)在0.189 2～0.587 3之間(表4)，說明同一個鉀礦區(qū)不同蕨類植物內(nèi)生真菌菌群之間的相似性程度較低。其中，狗脊與華中鐵角蕨的內(nèi)生真菌為中等相似，相似性系數(shù)為0.5873；而狗脊與芒萁的內(nèi)生真菌為極不相似，相似性系數(shù)為0.1892。芒萁的內(nèi)生真菌與其它6種植物內(nèi)生真菌相似性均較低。

3討論

本研究從江西龍南鉀礦區(qū)7種常見蕨類植物的1 680個組織塊中共分離獲得377個菌株，經(jīng)鑒定屬于Alternaria，Aspergillus，Cladosporium和Verticillium等25個分類單元。根據(jù)分離頻率判斷Aspergillus，Cladosporium，Verticillium，Alternaria和Exophiala等為7種蕨類植物內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬。

從分離率、定植率來看，7種蕨類植物內(nèi)生真菌的總分離率在2.50%～4.52%之間，總定植率為14.17%～22.92%，說明在鉀礦區(qū)蕨類植物中有一定數(shù)量的植物內(nèi)生真菌定植。與非鉀礦區(qū)其它蕨類植物內(nèi)生真菌的分離率相比要低，如廬山石韋、狗脊、槲蕨等植物分離率在4.75%～5.67%(詹壽發(fā)等，2007，2012；巫婷玉等，2012；樊有賦等，2008)；與鉛鋅礦廢棄礦區(qū)相比鉀礦區(qū)蕨類植物內(nèi)生真菌的分離率偏低，如李東偉等(2012)報道的鉛鋅礦廢棄礦區(qū)的硬毛南芥(Arabishirsuta)、魚骨松(Acaciadecurrens)、白檀(Symplocospaniculata)、毛萼香茶菜(Rabbosiaeriocalyx)、蚤輟(Arenariaserpyllifolia)和倒掛刺(Rosalongicuspis)等種子植物內(nèi)生真菌的分離率在0.42～0.93之間。

從不同組織部位來看，7種蕨類植物葉的內(nèi)生真菌總分離率和定植率都明顯高于根狀莖的內(nèi)生真菌分離率和定植率(P<0.05)(表1)，說明蕨類植物內(nèi)生真菌存在最主要部位是葉?？赡芘c蕨類植物各部位組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，所研究7種蕨類植物為真蕨類，并且真蕨類植物葉在形態(tài)、結(jié)構(gòu)上較發(fā)達，葉分為葉片和葉柄，葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)為表皮、葉肉組織和葉脈，葉柄的內(nèi)部結(jié)構(gòu)為表皮、皮層和中柱，它們表皮均有氣孔分布，內(nèi)生真菌可能主要通過自然孔口(氣孔)和葉表皮細胞間隙侵入植物體內(nèi)，蕨類植物莖為根狀莖，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為表皮、皮層和中柱，表皮無氣孔，蕨類植物根狀莖的內(nèi)生真菌是通過莖表皮細胞間穿過皮層機械組織細胞間隙侵入到根狀莖的皮層薄壁細胞(詹壽發(fā)等，2012)；也可能與礦區(qū)土壤環(huán)境有關(guān)，因為礦區(qū)土壤貧瘠，有些真菌難以在這種環(huán)境中生存，故侵入蕨類植物根狀莖內(nèi)生真菌數(shù)量較少，而地上部分葉可以接受空氣中大量真菌孢子，孢子通過不同途徑侵入葉內(nèi)定植。具體影響內(nèi)生真菌在蕨類植物不同組織部位分布差異的因素需要進一步探究。

龍南鉀礦區(qū)7種常見蕨類植物內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)在0.502～0.867之間，可見鉀礦區(qū)蕨類植物內(nèi)生真菌較為豐富。從相似性分析結(jié)果來看，不同植物之間內(nèi)生真菌種類組成的相似性系數(shù)在0.189 2～0.587 3之間，除了狗脊與華中鐵角蕨、禾稈蹄蓋蕨與烏蕨的內(nèi)生真菌相似性為中等相似外，其它植物之間內(nèi)生真菌的相似性都比較低，說明同一個鉀礦區(qū)不同蕨類植物內(nèi)生真菌菌群之間的相似性程度較低，這是否表明鉀礦區(qū)蕨類植物內(nèi)生真菌的宿主具有一定專一性還有待進一步研究。

致謝感謝中國科學(xué)院微生物研究所郭良棟研究員給予的幫助和指導(dǎo)。

參考文獻:

ATSATT PR，WHITESIDE MD, 2014. Novel symbiotic protoplasts formed by endophytic fungi explain their hidden existence，lifestyle switching，and diversity within the plant kingdom [J]. PLoS One，9(4)： e95266.doi：10.1 371/journal.pone. 095 266.

BARNETT HL，HUNTER BB， 1998. Illustrated Genera of Imperfect Fungi (4 Edition) [M]. St. Paul: APS Press: 1-218.BHAGAT J，KAUR A，SHARMA M，et al, 2012. Molecular and functional characterization of endophytic fungi from traditional medicinal plants [J] . World Microbiol Biotechnol，28：963-971.

CHU L，YU XL，LI Y，et al, 2007. Research advances on the heavy metal tolerance of pteridophyte in the mining wasterland [J] . J Anhui Norm Univ，30(5)：587-592. [褚磊，于小麗，李影，等, 2007. 礦業(yè)廢棄地中耐重金屬蕨類植物的研究進展 [J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報，30(5)：587-592.]

FAN YF，GAN JL，CHEN Y，et al, 2008. Prelininary study on the endophytic fungi in a medicinal Fera-Cibotiumbaromtz[J] . J Anhui Agri Sci，36(9)：3 737，3 375. [樊有賦，甘金蓮，陳曄，等, 2008. 藥用蕨類植物狗脊內(nèi)生真菌的初步研究 [J] . 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 36(9)：3 737，3 375.]

GABEL A，STUDT R，METZ S， 1996. Effect ofCryptomycinapteridisonPteridiumaquilinum[J]. Mycologia，88：635-641.

GUO LD， 2000. Advances of researches on endophytic fungi [J]. Mycosystema，20(1)：148-152. [郭良棟， 2000. 內(nèi)生真菌研究進展 [J]. 菌物系統(tǒng)，20(1)：148-152.]

JIANG MY, 1982. Fix and release of potassium of soil potassium minerals [J]. Chin J Soil Sci，13(3)：44-49；13(4)：44-45. [蔣梅茵, 1982. 土壤含鉀礦物中鉀的固定與釋放 [J]. 土壤通報，13(3)：44-49；13(4)：44-45.]

JU Z，WANG J，PAN SL, 2009. Isolation and preliminary identification of the endophytic fungi which produce Hupzine A from four species in Hupziaceae and determination of Huperzine A by HPLC [J]. Fudan Univ J Med Sci，36(4)：445-449. [鞠鏨， 王峻， 潘勝利 , 2009. 4種石杉科植物中產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌的分離及初步鑒定和HPLC測定石杉堿甲的含量 [J]. 復(fù)旦學(xué)報·醫(yī)學(xué)版，36(4)：445-449.]

KIRK PM，CANNON PF，MINTER DW，et al, 2008. Dictionary of The Fungi (10th) [M]. CABI Europe-UK: 1-782.

LI DW，XU HM，MEI T，et al, 2012. Diversity of endophytic fungi from six dominant plant species in a Pb-Zn mine wasteland in China [J]. Acta Ecol Sin，32(7)：2 288-2 293. [李東偉，徐紅梅，梅濤，等, 2012. 云南會澤鉛鋅礦廢棄礦渣堆常見植物內(nèi)生真菌多樣性 [J]. 生態(tài)學(xué)報，32(7)：2 288-2 293.]LIU AR，ZHANG Y，NIU LH,et al， 2010. Analysis of diversity of endophytic fungi in two plants in Hainan Province(Rhizophorastylosaandndeliacandel) [J] . Guihaia，30(5)：657-660. [劉愛榮，張洋，牛麗紅,等， 2010. 海南兩種紅樹林植物內(nèi)生真菌的多樣性分析 [J] . 廣西植物，30(5)：657-660.]

MILLER KI，QING C，MAN-YUEN SZE D，et al, 2012. Culturable endophytes of medicinal plants and the genetic basis for their bioactivity [J]. Microb Ecol，64：431-449.

NIU ZX，SUN LN，SUN TH，2009. Plant-microorganism combined remediation of heavy metals-contaminated soils: Its research progress [J]. Chin J Ecol，28(11)：2 366-2 373. [牛之欣，孫麗娜，孫鐵珩， 2009. 重金屬污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)研究進展 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志，28(11)：2 366-2 373.]

PAN DW，LING CH，DU LY, 2005. Progress in research on potassium release from K-beared minerals in soil [J]. Chin J Soil Sci，36(2)：253-258. [潘大偉，梁成華，杜立宇, 2005. 土壤含鉀礦物的釋鉀研究進展 [J]. 土壤通報，36(2)：253-258.]

PETRINI O,FISHER PJ，PETRINI LE, 1992. Fungal endophytes of bracken(Pteridiumaquilinun) with some reflections on their use in biological control [J]. Sydowia, 44：282-293.

RIYAZ-UI-HASSAN，SYED， STROBEL G，et al, 2013. An endophyticNodulisporiumsp. from Central America producing volatile organic compounds with both biological and fuel potential [J]. Microbiol Biotechnol，23(1)：29-35.

SATI SC，BELWAL M, 2005. Aquatic Hyphomycetes as root endophytes of Riparian plant roots [J]. Mycologia，97(1)：45-49.

SATI SC，PARGAEIN N，BELWA M, 2009. Diversity of aquatic hyphomycetes as root endophytes on pteridophytic plants in Kumaun Himalaya [J]. J Am Sci， 5(4)：179-182.

SATI SC，PARGAEIN N，BELWAL M, 2006. Three species of aquatic hyphomycetes as new root endophytes of temperate forest plants [J]. Nat Acad Sci Ind， 29(2)：9-10.

SEIFERT K，MORGAN-JONES G，GAMS W，et al, 2011. The Genera of Hyphomycetes [M]. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,P.O.，1-997.SHI W，LUO JP，TING ZH，et al, 2005. Isolation and identification of endophytic fungi ofHuperziaserrata[J]. Chin Trad Herb Drugs，36(2)：281-283. [石瑋，羅建平，丁振華，等, 2005. 千層塔內(nèi)生真菌分離鑒定的初步研究 [J]. 中草藥，36(2)：281-283.]

SUN JQ，GUO LD，ZANG W，et al， 2008. Endophytic fungal diversity and ecological distribution of medicinal plants [J]. Sci Chin Life Sci，38(5)：475-484.

TEJESVI MV，KAJULA M，MATTILA S，et al, 2011. Bioactivity and genetic diversity of endophytic fungi in Rhododendron to mentosum Harmaja [J]. Fung Divers，47(1)：97-107.

THANGAVELU MUTHUKUMAR，KANDASAMY PRABHA， 2012. Fungal associations in gametophytes and young sporophytic roots of the fernNephrolepisexaltata[J] . Acta Bot Croat，71(1)：139-146.

WU TY，YANG L，XU MM，et al, 2012. Diversity and correlation of endophytic fungi and rhizosphere fungi isolated fromDrynariaroosii[J]. Guangdong Agric Sci，39(17)：157-159. [巫婷玉，楊麗，許明敏，等, 2012. Diversity and correlation of endophytic fungi and rhizosphere fungi isolated fromDrynariaroosii[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，39(17)：157-159.]XU XY， MA YJ， 2001. K-release from potassium-containing minerals in soil and it’s significance for plant nutrition [J]. Chin J Soil Sci，32(4)：173-176. [徐曉燕，馬毅杰， 2001. 土壤礦物鉀的釋放及其在植物營養(yǎng)中的意義 [J]. 土壤通報，32(4)：173-176.]

ZHAN SF，F(xiàn)AN YF，GAN JL，et al, 2007. A study on endophytic fungi inPterismultifidaⅠ:Isolation and identification of endophytic fungi [J]. J Fung Res，5(4)：195-197. [詹壽發(fā)，樊有賦，甘金蓮，等, 2007. 鳳尾蕨內(nèi)生真菌的研究I-菌種分離及其分類鑒定 [J]. 菌物研究，5(4)：195-197.]ZHAN SF，PENG Q，CHEN Y，et al, 2012. Diversity of endophytic fungi inPyrrosiasheareri(Bak.) Ching and the microstructure of its ground parts [J]. J Southern Agric，43(9)：1 320-1 324. [詹壽發(fā)，彭琴，陳曄，等, 2012. 廬山石韋內(nèi)生真菌多樣性及地下部分顯微結(jié)構(gòu)觀察 [J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，43(9)：1 320-1 324.]ZHANG JC，WANG ZG，ZHANG HY，et al, 2010. The summarize about recent research process on fern endophyte [J]. Chin Agric Sci Bull，26(20)：70-72. [張君誠，王錚敏，張杭穎，等, 2010. 蕨類植物內(nèi)生菌研究進展 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，26(20)：70-72.]ZOU WX，TAN RX， 2001. Recent advances on endophyte research [J]. Acta Bot Sin，43(9)：881-892. [鄒文欣，譚仁祥， 2001. 植物內(nèi)生菌研究新進展 [J]. 植物學(xué)報，43(9)：881-892.]

Diversity of culturable endophytic fungi separated from seven common ferns in potassium mine areas in Longnan, South Jiangxi Province

QIAN Xu， GAN Hui-Yun， DU Yong-Tao， ZHANG Xian， CHEN Ye*， FAN You-Fu

(SchoolofPharmacyandLifeSciences，JiujiangUniversity， Jiujiang 33200， China )

Abstract:Plant endophytic fungi is a special kind of microorganisms mutualistic ally symbiosed with host plants. The special microbial resources have attracted tremendous interests in recent years, because of their potential to address problems associated with enhanced plant growth in environmental stress of mines and to improve the efficiency of ecological restoration. With a long peoriod of evolution, endophytic fungi and their host plants have formed a closemutual symbiotic relationship. Many beneficial biological effects have been made on the host plants, and they have the important ecological significance in plant community succession process. It is widely attracted using plants-microorganisms to enhance plant growth in environmental stress of mines, and to improve biological restoration efficiency, and its significance to host plants has become a new hot issue. In order to make clear the species diversity, community composition and ecological distribution of endophytic fungi, we carried out our work among 7 species of common ferns in potassium mine areas in Longnan, South Jiangxi Province. They are Dicranopteris linearis, Woodwardia japonica, Athyrium yokoscense, Stenoloma chusanum, Lygodium japonicum, Asplenium sarelii and Pteris multifida. And we analyzed the diversity of endophytic fungi, using the method of tissue isolation, morphological identification. The results showed that 377 strains of endophytic fungi were isolated from 7 species of plants, and the separation rate ranged from 2.50% to 4.52%. All of 377 strains belong to 25 genera, and among them, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium and Verticillium,which are found in all these 7 fern species, indicated that they were dominant, but there were obvious differences in the distribution in each fern species. The total separation rate and the colonization rate of entophytic fungi from leaves are generally greater than that from the rhizomes, but there are some differences in the total separation rate and the colonization rate from different parts of each fern species. The diversity indexes of endophytic fungi range from 0.502 to 0.867 in the seven species of ferns. It indicated that there was high diversity of endophytic fungi in potassium mines and the low similarity of endophytic fungi in different ferns in the same mine areas. The similarity coefficients of the endophytic fungi in the seven species of ferns were from 0.189 to 0.587. The results of this study would not only enrich germplasm resources of plant endophytic fungi, but also would offer basic data for further research on the mechanism that endophytic fungi could strengthen the adaptation of the host plant on mineral nutrition and stress physiology in potassium mine areas.

Key words:potassium mine areas, endophytic fungi in ferns, dominant endophytic fungi, diversity index, similarity coefficient

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201408021

收稿日期:2014-12-14修回日期： 2015-01-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31360064, 51264014)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31360064, 51264014)]。

作者簡介：錢旭(1992-)，男，河南鄲城人，研究方向為真菌多樣性，(E-mail)1321483416@qq.com。 *通訊作者： 陳曄，教授，研究方向為植物內(nèi)生真菌多樣性，(E-mail)chenyejjtc@126.com。

中圖分類號：Q939.5

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)03-0342-07

錢旭，甘會云，杜勇濤，等. 龍南鉀礦區(qū)常見蕨類植物可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性 [J]. 廣西植物， 2016， 36(3)：342-348

QIAN X，GAN HY，DU YT，et al. Diversity of culturable endophytic fungi separated from seven common ferns in potassium mine areas in Longnan, South Jiangxi Province [J]. Guihaia， 2016， 36(3)：342-348