劉小文， 齊成媚， 李　園， 顏冬冬， 王秋霞， 郭美霞， 曹坳程*

( 1. 湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院， 湖南 永州 425199； 2. 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 北京 100193 )

不同鉛水平下紫莖澤蘭細(xì)胞內(nèi)鉛的分布和化學(xué)形態(tài)的分析

劉小文1,2,3， 齊成媚1， 李園2,3， 顏冬冬2,3， 王秋霞2,3， 郭美霞2,3， 曹坳程2,3*

( 1. 湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院， 湖南 永州 425199； 2. 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 北京 100193 )

摘要：該研究運(yùn)用差速離心法和化學(xué)試劑逐步提取法，分析了重金屬鉛在紫莖澤蘭亞細(xì)胞內(nèi)的分布和主要化學(xué)形態(tài)。結(jié)果表明：隨著Pb濃度的升高，紫莖澤蘭的葉、根、莖中各亞細(xì)胞組分Pb含量逐漸增加；紫莖澤蘭中的Pb在葉片分布于可溶性部分和細(xì)胞壁中，兩者占總量的75.34%～84.63%；莖也主要分布于可溶性部分和細(xì)胞壁中，占總量的36.10%～57.14%和20.07%～36.52%；而在根中則富集于細(xì)胞壁和可溶性部分，分別占39.2%～49.78%和28.27%～37.62%，其他細(xì)胞器中的Pb含量均較少。紫莖澤蘭葉中的Pb以鹽酸提取態(tài)和水提取態(tài)為主，兩者占總量的58.74%～73.04%；莖中的Pb以醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)為主；而根中的Pb則以醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)占優(yōu)勢(shì)，兩者占總量的39.15%～52.91%。

關(guān)鍵詞：鉛， 紫莖澤蘭， 亞細(xì)胞分布， 化學(xué)形態(tài)

重金屬污染是最為廣泛的土壤污染源之一，并逐步發(fā)展成污染生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)(劉秀梅和王慶仁, 2001)。植物修復(fù)是近年來發(fā)展迅速的一門環(huán)境污染修復(fù)技術(shù)，是以植物對(duì)某種或某些化學(xué)元素的耐性或超累積效應(yīng)為基礎(chǔ)而作用于環(huán)境中的污染物，并能良好地利用植物與環(huán)境微生物之間的共存效應(yīng)而成為一種新興的環(huán)境污染修復(fù)技術(shù)，對(duì)治理土壤重金屬污染產(chǎn)生了重要作用(Garbisu & Alkorta, 2001; Salt et al, 1995)。植物主要通過避性和耐性兩種方式來實(shí)現(xiàn)適應(yīng)環(huán)境中的重金屬污染，避性是植物以自我調(diào)節(jié)的方式遠(yuǎn)離不良的生存環(huán)境，從而免受或減輕重金屬污染對(duì)其危害性，如根系向重金屬含量低的部分生長(zhǎng)，或是植物通過自身代謝將吸收的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)至外環(huán)境中；耐性是植物體內(nèi)通過一些生理變化，與重金屬結(jié)合呈現(xiàn)出解毒形態(tài)，如與植物細(xì)胞壁結(jié)合，或與植物細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白、多肽、有機(jī)酸反應(yīng)而形成絡(luò)合物，通過改變重金屬原有的活性，使其形成無毒或毒性較弱的形態(tài)，再轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)貯存等。Pb是植物生長(zhǎng)的非必需元素，可通過影響植物的光合作用，破壞葉綠素的合成和抗氧化酶系統(tǒng)，濃度過高時(shí)能嚴(yán)重影響植物正常生理代謝功能，進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可使植物死亡(Wu et al, 2003)。

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)是原產(chǎn)于中美洲的菊科澤蘭屬多年生草本植物，現(xiàn)已擴(kuò)散至亞洲、歐洲、非洲、大洋洲、北美洲等區(qū)域且已被諸多國(guó)家及權(quán)威研究機(jī)構(gòu)公認(rèn)為世界級(jí)惡性入侵雜草(牛燕芬等，2011)。該植物于20世紀(jì)40年代前后從中緬邊境以自然擴(kuò)散的方式傳入我國(guó)云南，經(jīng)半個(gè)多世紀(jì)發(fā)展后已蔓延至我國(guó)貴州、廣西、重慶、四川、湖北、西藏等地并以其對(duì)環(huán)境極強(qiáng)的適應(yīng)性迅速建立起了種群優(yōu)勢(shì)，嚴(yán)重危害了當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境和生物鏈平衡(賈海江等，2009)。鑒于紫莖澤蘭的危害性大，研究紫莖澤蘭的防控措施已迫在眉睫。目前，研究重金屬污染土壤的熱點(diǎn)是植物修復(fù)技術(shù)，且已證實(shí)紫莖澤蘭生長(zhǎng)能力強(qiáng)、產(chǎn)量高，具備環(huán)境污染修復(fù)先鋒植物的特征(魯平等，2005；李雪瑤和應(yīng)浩，2009)。紫莖澤蘭可有效吸收富集土壤中的Pb，且植株的不同部位對(duì)Pb的耐受能力呈現(xiàn)出很大差異(李冰等，2008；汪文云等，2008；Zu et al，2005)。筆者在調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭可在重金屬Pb污染嚴(yán)重的環(huán)境中保持正常生長(zhǎng)，且隨著土壤Pb含量不同，其生長(zhǎng)狀況也明顯不同，紫莖澤蘭體內(nèi)可能存在某些耐重金屬的機(jī)制。前期研究表明，紫莖澤蘭的生長(zhǎng)狀態(tài)隨Pb處理水平表現(xiàn)出低促高抑的效應(yīng)，且在高濃度Pb脅迫下，紫莖澤蘭各組織中Pb的累積量遠(yuǎn)超過一般植物的累積水平。具備超累積效應(yīng)的植物對(duì)重金屬的吸附能力跟植株在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上區(qū)隔重金屬的作用強(qiáng)弱有關(guān)(Kupper et al，1999)。研究重金屬在植物亞細(xì)胞分布將有助于揭示植株內(nèi)重金屬的解毒形態(tài)和富集區(qū)的具體分布(Hall，2002)。因此，本研究以差速離心技術(shù)分離紫莖澤蘭各組織的亞細(xì)胞組分，并運(yùn)用化學(xué)試劑逐步提取法對(duì)Pb在紫莖澤蘭細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布特征和結(jié)合形態(tài)富集量進(jìn)行了研究，擬揭示其對(duì)Pb的耐性和解毒機(jī)理，以期為研究紫莖澤蘭對(duì)Pb的生理響應(yīng)和富集Pb的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)

試驗(yàn)在室內(nèi)大棚中進(jìn)行，場(chǎng)地環(huán)境為相對(duì)濕度(55±8)%、白天溫度(25±5)℃、夜間溫度(15±5)℃。場(chǎng)地土壤采自四川省西昌學(xué)院內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地土壤表層，相關(guān)參數(shù)為pH值6.30(水)/7.71(CaCl2)、總N 853 mg·kg-1、總P 441 mg·kg-1、總K 2 313 mg·kg-1，CEC 11.23 meq、有機(jī)質(zhì)含量25.1 mg·kg-1、重金屬Pb含量20 mg·kg-1。Pb脅迫處理水平為0(CK)、200、500、1 000 mg·kg-1，Pb以Pb(CH3COO)2的形式加入。經(jīng)上述處理后將土壤充分拌勻，穩(wěn)定2周后移植紫莖澤蘭幼苗。選取株高8～10 cm且質(zhì)量接近的植株，隨機(jī)分配至每個(gè)濃度處理的土壤中，每個(gè)處理栽種16盆，每盆1株。移植完成后，用稱重法補(bǔ)充水分至田間持水量的60%左右并保持至收獲，重金屬脅迫處理60 d后，收獲紫莖澤蘭植株。植株先用自來水沖洗表面雜質(zhì)后，再用20 mmol·L-1Na2-EDTA交換20 min，去除根系表面吸附的Pb2+，最后用去離子水洗凈，并用吸水紙吸干植株表面水分，于-20 ℃環(huán)境的冰箱中儲(chǔ)存。處理過的樣品組分為根、莖和葉片3個(gè)組分，依次測(cè)定重金屬全量、亞細(xì)胞分布和亞細(xì)胞內(nèi)化學(xué)形態(tài)。

1.2 植物亞細(xì)胞組分的分離

將紫莖澤蘭各組織研磨勻漿后用差速離心法分離不同組織中的各亞細(xì)胞組分。參照Weige & Jager(1980)和Gabbrielli et al(1980)的方法，并針對(duì)處理方法的局限性加以完善：取樣0.200 0 g，加入8 mL提取液[0.25 mol·L-1蔗糖+50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH7.5)+1 mmol·L-1二硫赤鮮糖醇]，勻漿處理后，收集勻漿液后在300 r·min-1下冷凍離心30 s，至沉淀完全析出，過濾分離上清液，即為細(xì)胞壁組分(F1)；收集離心樣品的上清液并在2 000 r·min-1下離心15 min，待沉淀穩(wěn)定后分離上清液，沉淀部分即為細(xì)胞核和葉綠體組分(F2)；收集細(xì)胞核和葉綠體沉淀后上清液在10 000 r·min-1下離心20 min，重復(fù)上述分離操作，所謂不溶物為線粒體組分(F3)；收集經(jīng)三次差速離心分離的上清液，為可溶組分(F4)，各步驟均在4 ℃下進(jìn)行。

1.3 紫莖澤蘭體內(nèi)重金屬化學(xué)形態(tài)分析

采用不同試劑分步提取法逐步分離紫莖澤蘭植株內(nèi)內(nèi)重金屬各化學(xué)形態(tài)，方案如下：取樣0.200 0 g，加入8 mL提取劑研磨勻漿后轉(zhuǎn)入10 mL塑料離心管中，在25 ℃恒溫振蕩22 h后，5 000 r·min-1下離心10 min，倒出上清液，加入8 mL的提取劑，25 ℃下恒溫振蕩1 h，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液混合后充分搖勻，采用下列5種提取劑依次逐步提?。?0%乙醇(FE)，去離子水(FW)，1 mol·L-1NaCl溶液(FNaCl)，2% HAc(FHAc)，0.6 mol·L-1HCl(FHCl)，最后為殘留態(tài)(FR)。

1.4 Pb含量的測(cè)定

以提取劑作為空白對(duì)照，所得樣品用去離子水洗凈后轉(zhuǎn)移至100 mL三角瓶中，將其蒸干后采用濃HNO3∶HF∶HClO4(2∶1∶2)法測(cè)定Pb的含量，先消煮至澄清，過濾后用去離子水定容，北京瑞利WFX-120A /石墨爐原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定，所有數(shù)據(jù)用SAS 8.2軟件進(jìn)行處理。

2結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭各組織中Pb的亞細(xì)胞分布

重金屬為避免損傷植物核心的細(xì)胞、組織和細(xì)胞器，從而體現(xiàn)對(duì)應(yīng)的選擇性分配，形成了在亞細(xì)胞各組分中的分配差異，其主要累積區(qū)位于植物的細(xì)胞壁和液泡中，但由于植物種類、Pb處理水平等條件的不一致，會(huì)導(dǎo)致Pb在兩者之間分配比例存在差異。不同濃度的Pb處理下，Pb在紫莖澤蘭各組織的亞細(xì)胞分布及各組分所占比例如表1所示，在紫莖澤蘭的亞細(xì)胞組分分離樣品中，Pb的回收率為82.17%～97.65%，除對(duì)照中葉片外，紫莖澤蘭葉片Pb的亞細(xì)胞組分的含量均呈現(xiàn)F4>F1>F3>F2的分布格局，即均以含可溶性部分F4分布最高，占28.72%～54.23%，其次是細(xì)胞壁F1，占23.51%～44.44%，兩者占全量的75.34%～84.63%，少量分布在F2和F3中，與對(duì)照相比，Pb在F4組分中明顯上升，而在F1組分中呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)；紫莖澤蘭莖中Pb主要富集于F4和F1，占36.10%～57.14%和20.07%～36.52%，少量富集于F2和F3中，隨Pb濃度增加，Pb在細(xì)胞壁和可溶性部分分配比例均呈先增后降的趨勢(shì)，而細(xì)胞核和葉綠體的分配比例則先減少后增加。根系中細(xì)胞亞細(xì)胞組分Pb含量依次為F1>F4>F3>F2，大部分Pb位于細(xì)胞壁和可溶性部分，分別占39.2%～49.78%和28.27%～37.62%。隨Pb濃度增加，Pb在細(xì)胞壁分配比例逐漸下降，而可溶性部分則逐漸增加。以上結(jié)果證實(shí)了Pb在紫莖澤蘭根莖葉中的主要分布位點(diǎn)集中在可溶性部分和細(xì)胞壁，少量分布在紫莖澤蘭各組織的細(xì)胞核和葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，細(xì)胞壁對(duì)Pb有較強(qiáng)的束縛能力，對(duì)其根來說這種束縛作用更為明顯，隨Pb濃度的增加各組織細(xì)胞壁對(duì)Pb的束縛能力有所降低，并能降低紫莖澤蘭各組織的細(xì)胞核、葉綠體和線粒體等細(xì)胞器中Pb的分布，有效地保護(hù)了紫莖澤蘭正常的生理功能。

2.2 紫莖澤蘭各組織中Pb的化學(xué)形態(tài)

一般來說，重金屬都以其特定的形態(tài)存在于植物的不同組織中，并保持動(dòng)態(tài)平衡，各組織中重金屬特征形態(tài)的性質(zhì)和活性，對(duì)重金屬在植物體內(nèi)的毒性強(qiáng)弱、轉(zhuǎn)運(yùn)及累積有明顯影響。各種化學(xué)結(jié)合形態(tài)的Pb在紫莖澤蘭各組織的含量，所占比例如表2所示。不同濃度Pb處理下，葉中不同形態(tài)的Pb占的比例均有所不同，除對(duì)照外，均以鹽酸提取態(tài)FHCl和水提取態(tài)Fw為主，兩者占總量的58.74%～73.04%，其次為乙醇提取態(tài)FE，醋酸提取態(tài)FHAc和氯化鈉提取態(tài)FNaCl最少，隨Pb濃度的增加，F(xiàn)HCl有所減低，而FE則明顯升高。在莖中， 除對(duì)照外，各處理Pb的提取形態(tài)依次為FHAc>FNaCl>FW>FHCl>FE，

表 1　Pb脅迫下對(duì)紫莖澤蘭各組織中Pb亞細(xì)胞分布

注： F1. 細(xì)胞壁組分; F2. 細(xì)胞核和葉綠體組分; F3. 線粒體組分，F(xiàn)4. 可溶組分。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，Pb含量和分配比例中同一行的不同字母表示不同組分有顯著差異(P<0.05)。下同。

Note: F1. Cell wall fraction; F2. Nuclear and chloroplast fraction; F3. Mitochondrial fraction; F4. Soluble fraction. Date are shown as Mean±SD. (n=3). Different letters within the same Pb subcellular fraction of the same lead level indicate significant differences between the four cultivars at 0.05 level. The same below.

表 2　Pb脅迫下紫莖澤蘭中Pb的化學(xué)形態(tài)

注： FE. 乙醇提取態(tài); FW. 水提取態(tài); FNaCl. 氯化鈉提取態(tài); FHAc. 醋酸提取態(tài); FHCl. 鹽酸提取態(tài); FR。

Note: FE. ethanol-extractable; Fw. water-extractable; FNacl. Nacl-extractable; FHAc. HAc-extractable; FHCl. HCl-extractable; FR. residual.

FHAc和FNaCl提取態(tài)所占比例優(yōu)勢(shì)明顯，且FHAc隨Pb濃度的增加而增加，F(xiàn)NaCl則逐漸減少。Pb在根的主要形態(tài)依次為FHAc>FHCl>FNaCl>FW>FE，F(xiàn)HAc和FHCl占總量的39.15%～52.91%，且兩者均隨Pb的增加而分布比例增大。上述結(jié)果說明在紫莖澤蘭不同部位Pb存在著不同的化學(xué)形態(tài)，根莖葉中Pb均與多種配位體結(jié)合。

3討論

植物自身進(jìn)化出了許多機(jī)制來適應(yīng)被重金屬污染土壤的逆境脅迫環(huán)境，避免受到重金屬的毒害作用，與其它因素在植株對(duì)重金屬的忍耐與解毒過程中發(fā)揮了重要作用(楊衛(wèi)東等, 2009)，主要包括選擇性排斥，通過阻止重金屬跨膜運(yùn)輸來限制重金屬吸收、富集及代謝，通過質(zhì)子泵作用于重金屬將其泵出胞外；重金屬鰲合，通過鰲合素、金屬硫蛋白、有機(jī)酸等贅合重金屬，使其轉(zhuǎn)化為低毒形態(tài)，并通過液泡將其隔離；細(xì)胞壁固定，胞外碳水化合物能將重金屬結(jié)合并固定于細(xì)胞壁上(Zornoza et al, 2002; Ke et al, 2007; Wu et al, 2005; Ramos et al,2002)。

超累積植物自身一般都具備相應(yīng)的生理解毒機(jī)制從而對(duì)重金屬產(chǎn)生耐性，使植株能適應(yīng)高濃度重金屬污染的區(qū)域，并保持正常生長(zhǎng)，這是因?yàn)橹亟饘僭谥参矬w內(nèi)以贅合物等解毒形態(tài)存在，從而失去原有的毒性，形成解毒機(jī)制，如與植物細(xì)胞壁結(jié)合、植物的主動(dòng)運(yùn)輸作用將重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡、與有機(jī)酸或某些蛋白質(zhì)結(jié)合形成絡(luò)合物等(夏小燕等, 2007)，在植物對(duì)重金屬的耐性與富集特性方面，植物細(xì)胞壁的固持作用及液泡區(qū)隔化效應(yīng)發(fā)揮了重要作用(Kupper et al, 2000)；液泡中含有多種能與重金屬離子結(jié)合的有機(jī)酸、有機(jī)堿、蛋白質(zhì)等，使其在細(xì)胞內(nèi)區(qū)隔化；以細(xì)胞壁為主體的非原生質(zhì)體部分以特定的成分及理化性質(zhì)，構(gòu)成植物中的“死組織”，其生理代謝活動(dòng)水平低，這些親金屬離子的配位基團(tuán)由植物細(xì)胞壁中多糖分子(木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、粘膠等)和蛋白質(zhì)分子中的大量羥基、羧基、氨基、醛基和磷酸基等通過相互作用形成，這些配位集團(tuán)進(jìn)入植物體內(nèi)與重金屬離子發(fā)生配位作用，有效防止植物體內(nèi)重金屬離子發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，大幅度減少了到達(dá)原生質(zhì)體中重金屬離子的富集量，保護(hù)了植物細(xì)胞功能區(qū)正常生理活性；由此可見，細(xì)胞壁是植物體內(nèi)吸收重金屬代謝解毒的重要場(chǎng)所(Hayens，1980; Allan & Jorrell, 1989)。當(dāng)細(xì)胞壁吸附重金屬離子的量接近飽和時(shí)，重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部通過轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入液泡中儲(chǔ)存，液泡中含有多種有機(jī)酸、有機(jī)堿、蛋白質(zhì)等，可作用于重金屬使其在植物細(xì)胞內(nèi)被區(qū)隔化，降低了原生質(zhì)中重金屬富集量，從而避免或減輕重金屬對(duì)植株的危害。

本研究結(jié)果表明紫莖澤蘭中的Pb在葉片分布于可溶性部分和細(xì)胞壁中，兩者占全量的75.34%～84.63%；莖類似與葉片也主要分布于可溶性部分和細(xì)胞壁中，占總量的36.10%～57.14%和20.07%～36.52%；而根中則富集于細(xì)胞壁和可溶性部分，分別占39.2%～49.78%和28.27%～37.62%，其他細(xì)胞器中的Pb含量均較少。He et al(2002)認(rèn)為超累積植物東南景天Pb的亞細(xì)胞分布主要集中在細(xì)胞壁上，其次是可溶性部分；周小勇等(2008)研究表明長(zhǎng)柔毛委陵菜中47%～77%的Pb分布于細(xì)胞壁上，其次分布于可溶性部分；江行玉和趙可夫(2002)證實(shí)蘆葦細(xì)胞中不同位置Pb的含量有明顯差異，Pb在細(xì)胞內(nèi)的具體分布為細(xì)胞間隙>細(xì)胞壁>液泡>細(xì)胞質(zhì)；本研究結(jié)果與上述結(jié)果類似，紫莖澤蘭吸收的Pb首先與細(xì)胞壁中眾多的化合物形成穩(wěn)定的絡(luò)合物或不溶性有機(jī)物而固定下來，若細(xì)胞壁上可承載的Pb離子接近飽和狀態(tài)后，多余的Pb會(huì)通過細(xì)胞膜進(jìn)入原生質(zhì)中，與液泡中一些可溶性部分如有機(jī)酸、有機(jī)堿等物質(zhì)結(jié)合而Pb在液泡被區(qū)隔化(周小勇等, 2008)，使Pb對(duì)其它細(xì)胞器的危害大大減弱，使紫莖澤蘭對(duì)重金屬Pb的耐性相對(duì)于一般植物明顯增強(qiáng)。因此，大量的Pb在紫莖澤蘭植株內(nèi)可溶性部分被區(qū)隔化和細(xì)胞壁沉淀可能是其耐受高濃度Pb的重要機(jī)制，這說明了紫莖澤蘭對(duì)于Pb污染土壤有良好的生態(tài)修復(fù)價(jià)值。

植物體內(nèi)重金屬的遷移能力、活性、毒性和基質(zhì)分離的難易與其在植物體內(nèi)呈現(xiàn)的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)(Qiao & Ho, 1996)。重金屬區(qū)被植物體內(nèi)室化的方式一般是通過與植物體內(nèi)存在的配體結(jié)合，這些有機(jī)配體主要有3種類型：以檸檬酸、蘋果酸、草酸等為代表的含氧羧酸；以金屬硫蛋白與鰲合素等為代表的含硫基化合物；以組氨酸等為代表的含氮氨基酸。Wu et al(2003)和楊居榮等和黃翌認(rèn)為由于在不同提取劑中，重金屬的溶解度有很大差異，故Pb、Cd等重金屬存在的化學(xué)形態(tài)可通過不同溶劑對(duì)應(yīng)的提取量來反映。其中，以氯化物、硝酸鹽為主的重金屬結(jié)合態(tài)可用乙醇提??；去離子水對(duì)以水溶性有機(jī)酸鹽、重金屬的一代磷酸鹽M(H2PO4)等方式結(jié)合的重金屬有較好的提取效果；氯化鈉能提取與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或呈吸著態(tài)的重金屬和在植物體內(nèi)以果膠酸鹽的形式結(jié)合的重金屬等；而醋酸常用來提取包括M2HPO4和正磷酸鹽M3PO4在內(nèi)的難溶于H2O的重金屬磷酸鹽結(jié)合態(tài)；鹽酸一般用來提取草酸鹽等。提取劑的極性強(qiáng)弱對(duì)應(yīng)提取的重金屬的活性、毒性及遷移能力差異顯著，極性越強(qiáng)，提取得到的重金屬鹽在植物體內(nèi)的活性、毒性及遷移能力越低，以此來分離得到與植物基質(zhì)結(jié)合程度各異的重金屬離子(許嘉琳和宋文昌, 1991)。

長(zhǎng)柔毛委陵菜中Pb以鹽酸提取態(tài)為主，占總量的28%～60%(周小勇等, 2008)；藥用植物麥冬、北沙參和地黃中的Pb的形態(tài)是以鹽酸提取態(tài)和醋酸提取態(tài)形式存在，占藥用部分的65%(劉軍和李先恩, 2002)；小麥和水稻葉中的Pb都以鹽酸提取態(tài)為主，根中都以醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)為主(許嘉琳和宋文昌, 1991)；蘆葦體內(nèi)的Pb也以鹽酸提取態(tài)和醋酸提取態(tài)為主(江行玉和趙可夫, 2002)；本研究結(jié)果顯示紫莖澤蘭葉中Pb以鹽酸提取態(tài)和水提取態(tài)為主，兩者占總量的58.74%～73.04%，在莖中，以醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)為主，在根中，醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)占優(yōu)勢(shì)，兩者占總量的39.15%～52.91%；說明紫莖澤蘭葉片中的Pb的存在方式主要以水溶性的有機(jī)酸鹽、磷酸鹽為主；紫莖澤蘭莖中的Pb主要以難溶于水的重磷酸鹽、果膠酸鹽方式被吸附或與蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在；根中Pb的存在方式也主要是以難溶于水的重磷酸鹽醋酸、草酸鹽的形式等，表明紫莖澤蘭體內(nèi)的Pb存在多種配位體，且螯合的鉛都不易被植物吸收，紫莖澤蘭體內(nèi)遷移能力強(qiáng)的乙醇提取態(tài)的比例較低，Pb在其體內(nèi)的移動(dòng)性較差，這種Pb形態(tài)可明顯促進(jìn)紫莖澤蘭體內(nèi)的Pb在細(xì)胞壁的固定和液泡的區(qū)隔化，使得Pb在紫莖澤蘭植株體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)困難，從而避免了Pb對(duì)紫莖澤蘭造成損傷。

4結(jié)論

本研究證實(shí)了紫莖澤蘭中的Pb在莖、葉片中的主要分布區(qū)域位于可溶性部分和細(xì)胞壁中，而在根中則富集于紫莖澤蘭細(xì)胞壁和其它可溶性部分，其它細(xì)胞器中的Pb含量均較少；Pb對(duì)其它細(xì)胞器的毒性由于這種特殊亞細(xì)胞分布大大降低，使得紫莖澤蘭對(duì)Pb的耐性明顯提高。紫莖澤蘭體內(nèi)存在多種Pb配位形式，且螯合的鉛大都不易被植物體吸收，紫莖澤蘭體內(nèi)遷移能力強(qiáng)的乙醇提取態(tài)的比例較低，Pb在其體內(nèi)的移動(dòng)性較差，這種Pb形態(tài)十分有利于細(xì)胞壁對(duì)Pb的固定和液泡對(duì)Pb的區(qū)隔化，限制了Pb在紫莖澤蘭植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而避免了Pb對(duì)紫莖澤蘭植株造成損傷。紫莖澤蘭能有效吸收土壤中的Pb，且能適應(yīng)高濃度Pb處理的土壤，體現(xiàn)了一定的超富集植物特性?？梢娮锨o澤蘭作為環(huán)境污染修復(fù)植物，在Pb及其它重金屬污染的土地區(qū)的防治上有著良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn):

ALLAN DL, JARRELL WM, 1989. Proton and copper adsorption to maize and soybean root cell walls [J]. Plant Physiol, 89(3): 823-832.

GARBISU C, ALKORTA I, 2001. Phytoextraction:a cost-effective plant-based technology for the removal of metals from the environment [J]. Bioreso Technol, 77(3): 229-236.

Gabbrielli R，Panddfini T，Vergnano O，et a1， 1990. Comparison of two ser-pentine species with different nickel tolerance strategies [J]. Plant Soil，22:271-277．

HALL JL， 2002. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance [J]. J Exper Bot, 53(366): 1-11.

HAYENS RJ, 1980. Ione xehange ProPerties of roots and ionie interactions within the apoplasm: Their role in ion accumulation by Plants [J]. Bot Rev, 46: 75-99.

HE B, YANG XE, NI WZ, et al， 2002. Sedum alfredii: a new lead-accumulating ecotype [J]. Acta Bot Sin Chin Ed, 44(11): 1 365-1 370.

JIA HJ，LI XK，TANG SC，et al， 2009. Allelopathic effects ofEupatoriumadebophorumon seed germination of three woody plants in karst region [J]. Guihaia，29(5): 631-634. [賈海江，李先琨，唐賽春，等， 2009. 紫莖澤蘭對(duì)三種巖溶地區(qū)木本植物種子萌發(fā)的化感作用 [J]. 廣西植物，29(5): 631-634.]

JIANG YX，ZHAO KF, 2002. The Distribution of Pb and Pb-stressed relative proteins in Pb-polluted phragmites austral is seedlings [J]. J Plant Physiol Mol Biol，28(3): 169-174. [江行玉，趙可夫, 2002. 鉛污染下蘆葦體內(nèi)鉛的分布和鉛脅迫相關(guān)蛋白 [J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，28(3): 169-174.]KE W, XIONG Z, XIE M, et al， 2007. Accumulation, subcellular localization and ecophysiological responses to copper stress in twoDaucuscarotaL. populations [J]. Plant & Soil, 292(1): 291-304.

KUPPER H, JIEZHAO F, MCGRATH SP, 1999. Cellular compartmentation of zinc in leaves of the hyperaccumulatorThlaspicaerulescens[J]. Plant Physiol, 119(1): 305-312.

KUPPER H, LOMBI E, ZHAO FJ, et al， 2000. Cellular compartmentation of cadmium and zinc in relation to other elements in the hyperaccumulatorArabidopsishalleri[J]. Planta, 212(1): 75-84.

LI B，ZHANG CH, 2008. Studies on the bryophytes and analysis of ecological restore potential in the Lannigou Gold Deposit, Guizhou Province [J]. J Trop & Subtrop Bot，16(6): 511-515. [李冰，張朝暉, 2008. 貴州爛泥溝金礦區(qū)苔蘚植物及其生態(tài)修復(fù)潛力分析 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，16(6): 511-515.]

LI XY，YING H， 2009. The harms prevention and comprehensive utilization ofEupatoriumadenophorum[J]. Biomass Chem Engin，43(1): 57-60. [李雪瑤，應(yīng)浩， 2009. 紫莖澤蘭的危害、防除及綜合利用 [J]. 生物質(zhì)化學(xué)工程，43(1): 57-60.]

LIU J，LI XN, 2002. Chemical form and distribution of lead in medical plants [J]. Agro-environm Protect，21(2): 143-145. [劉軍，李先恩, 2002. 藥用植物中鉛的形態(tài)和分布研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，21(2): 143-145.]LIU XM，WANG QH, 2001. The latest development about phytoremediation of heavy metal contaminated soil [J]. J Gansu Agric Univ，36(1): 8-13. [劉秀梅，王慶仁, 2001. 植物修復(fù)重金屬污染土壤的研究進(jìn)展 [J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，36(1): 8-13.]

LU P，SANG WG，MA KP, 2005. Progress and prospects in research of an exotic invasive species,Eupatoriumadenophorum[J]. Acta Phytoecol Sin，29(6): 1 029-1 037. [魯平，桑衛(wèi)國(guó)，馬克平, 2005. 外來入侵種紫莖澤蘭研究進(jìn)展與展望 [J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，29(6): 1 029-1 037.]NIU YF，F(xiàn)ENG YL，XIE JL，et al， 2011. Effects of disturbance intensity on seed germination, seedling establishment and growth ofAgeratinaadenophora[J]. Guihaia，31(6): 795-800. [牛燕芬，馮玉龍，謝建磊，等， 2011. 干擾強(qiáng)度對(duì)群落中紫莖澤蘭種子萌發(fā)、幼苗定居和生長(zhǎng)的影響 [J]. 廣西植物，31(6): 795-800. ]

QIAO L, HO G， 1996. The effect of clay amendment on speciation of heavy metals in sewage sludge [J]. Water Sci & Technol, 34(7-8): 413-420.

RAMOS I, ESTEBAN E, LUCENA J, et al， 2002. Cadmium uptake and subcellular distribution in plants ofLactucasp. Cd-Mn interaction [J]. Plant Sci, 162(5): 761-767.

SALT DE, BLAYLOCK M, KUMAR NPBA, et al， 1995. Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants [J]. Nature, 13(5): 468-474.

WANG WY，ZHANG CH, 2008. Study on the bryophytes from Shuiyindong carlin gold deposit in Guizhou [J]. Gold，29(6): 8-12. [汪文云，張朝暉, 2008. 貴州水銀洞卡林型金礦苔蘚植物研究 [J]. 黃金，29(6): 8-12.]

Weigel HJ，Jager HJ， 1980. Subcellular distribution and chemical form of cadmium in bean [J]. Plant Physiol， 65:480-482．

WU F, DONG J, QIAN QQ, et al， 2005. Subcellular distribution and chemical form of Cd and Cd-Zn interaction in different barley genotypes [J]. Chemosphere, 60(10): 1 437-1 446.WU FB, ZHANG GP, DOMINY P, 2003. Four barley genotypes respond differently to cadmium:lipid peroxidation and activities of antioxidant capacity [J]. Environ & Exp Bot, 50(1): 67-78.

XIA XY，YANG LQ，ZHAI FQ，et al, 2007. Organic acids alleviating the toxicity of Cd to young wheat plants [J]. J Agro-Environ Sci，26(3): 990-995. [夏小燕，楊麗琴，翟福勤，等, 2007. 有機(jī)酸對(duì)小麥幼苗鎘毒的緩解作用 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，26(3): 990-995.]

XU JL，SONG WC， 1991. Chemieal forms of Pb, Cd and Cu in crops [J]. Chin J Appl Ecol，2(3): 244-248. [許嘉琳，宋文昌， 1991. 農(nóng)作物體內(nèi)鉛, 鎘, 銅的化學(xué)形態(tài)研究 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2(3): 244-248.]YANG JR，HUANG Y, 1994. Mechanism of heavy metal tolerance of plants [J]. Chin J Ecol，13(6): 20-26. [楊居榮，黃翌, 1994. 植物對(duì)重金屬的耐性機(jī)理 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志，13(6): 20-26.]

YANG WD，CHEN YT，QU MH，et al， 2009. Subcellular distribution and chemical forms of cadmium inSalixmatsudana[J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，(7): 1 394-1 399. [楊衛(wèi)東，陳益泰，屈明華，等， 2009. 鎘在旱柳中亞細(xì)胞分布及存在的化學(xué)形態(tài) [J]. 西北植物學(xué)報(bào)，(7): 1 394-1 399.]ZHOU XY，CHOU RL，LI QF，et al， 2008. Effects of zinc on distribution and chemical for m of lead inPotentillagriffithiivar.velutina[J]. Acta Sci Circumst，28(10): 2 064-2 071. [周小勇，仇榮亮，李清飛，等， 2008. 鋅對(duì)長(zhǎng)柔毛委陵菜中鉛的分布和化學(xué)形態(tài)的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，28(10): 2 064-2 071.]

ZORNOZA P, VáZQUEZ S, ESTEBAN E, et al， 2002. Cadmium-stress in nodulated white lupin: strategies to avoid toxicity [J]. Plant Physiol Biochem, 40(12): 1 003-1 009.

ZU YQ, LI Y, CHEN JJ, et al， 2005. Hyperaccumulation of Pb,Zn and Cd in herbaceous grown on lead-zinc mining area in Yunnan, China [J]. Environm Inter, 31(5): 755-762.

Subcellular distribution and chemical forms of lead inEupatoriumadenophorumat different lead levels

LIU Xiao-Wen1,2,3, QI Cheng-Mei1, LI Yuan2,3, YAN Dong-Dong2,3,WANG Qiu-Xia2,3, GUO Mei-Xia2,3, CAO Ao-Cheng2,3*

( 1.CollegeofBiologicalandChemicalEngineering,HunanUniversityofScienceandTechnology, Yongzhou 425199, China；2.StateKeyLaboratoryforBiologyofDiseasesandInsertPests, Beijing 100193, China; 3.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing 100193, China )

Abstract:The differential centrifugation technique and sequential chemical extraction method were used to study the subcellular distribution and chemical forms of lead in the roots, leaves and stems of Eupatorium adenophorum. The results showed that with the increasing of lead levels, the contents of lead in subcellular distribution of leaves, stems and roots significant increased. The lead distributed mainly in the soluble partition and cell wall in leaves, occupied 75.34%-84.63% of the total. Lead distributed in stems were similar to it in leaves. It mainly accumulated in the soluble partition and cell wall, which occupied 36.10%-57.14% and 20.07%-36.52%, respectively. And it distributed mainly in cell wall and soluble partition in roots, which occupied 39.20%-49.78% and 28.27%-37.62%, respectively. There was less lead in other organelles. The chemical forms of lead in leaves of E. adenophorum were mainly in HCl and water, occupied 58.74%-73.04% of the total. In stems, the main chemical forms were HAc and NaCl, and the chemical forms of HAc and HCl were predominant in roots, occupied 39.15%-52.91% of the total.

Key words:lead, Eupatorium adenophorum, subcellular distribution, chemical forms

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201404010

收稿日期:2014-07-18修回日期： 2014-12-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技專項(xiàng)(201103027); 湖南省教育優(yōu)秀青年項(xiàng)目(14B071)；中國(guó)博士后科學(xué)基金第56批面上項(xiàng)目(2014M561110)；湖南省自然科學(xué)基金(13JJ6080)；湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2011-76)；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(2012-318)[Supported by National Public Welfare Fund for Agricultural Research(201103027); Preject for Advanced Youth of Hunan Provincial Education Department(14B071); Postdoctoral Science Foundation of China(2014M561110); Key Discipline Construction Project of Hunan Province(2011-76); Science and Technology Innovation Team Plan of Hunan Provincial Colleges and Universities(2012-318)]。

作者簡(jiǎn)介：劉小文(1983-)，男，湖南耒陽(yáng)人，博士，副教授，研究方向?yàn)樯锇踩铜h(huán)境毒理學(xué)，(E-mail)lxw1110@126.com。

*通訊作者：曹坳程，博士，研究員，研究方向?yàn)樯锶肭趾屯寥老荆?E-mail)caoac@vip.sina.com。

中圖分類號(hào)：Q945.79

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142(2016)03-0335-07

劉小文，齊成媚，李園，等. 不同鉛水平下紫莖澤蘭細(xì)胞內(nèi)鉛的分布和化學(xué)形態(tài)的分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(3)：335-341

LIU XW， QI CM， LI Y， et al. Subcellular distribution and chemical forms of lead inEupatoriumadenophorumat different lead levels [J]. Guihaia， 2016，

36(3)：335-341