孫　燕，劉金華，杜　悅，徐冰倩，盧陳杰，韓茜茜，謝澤睿，夏　龍

(杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院，浙江 杭州 310036)

協(xié)同負載阿司匹林/普羅布考的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的制備研究

孫燕，劉金華，杜悅，徐冰倩，盧陳杰，韓茜茜，謝澤睿，夏龍

(杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院，浙江 杭州 310036)

摘要：利用殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合凝膠，同時負載阿司匹林和普羅布考兩種性質(zhì)差異顯著的藥物，探索實現(xiàn)阿司匹林/普羅布考復(fù)合藥物協(xié)同包埋的最佳條件.結(jié)果顯示，當(dāng)阿司匹林與普羅布考的質(zhì)量濃度比為2∶1、海藻酸鈉與殼聚糖的質(zhì)量濃度比為1∶2時，協(xié)同負載普羅布考和阿司匹林的效果最佳，其包封率分別為96.33%和98.35%；并且表面電位為-13.94 mV，儲存穩(wěn)定性較好.

關(guān)鍵詞：阿司匹林；普羅布考；殼聚糖；海藻酸鈉；復(fù)合水凝膠

0引言

阿司匹林(ASA)和普羅布考(PRO)是兩種應(yīng)用廣泛和效果顯著的抗血栓藥物.PRO又稱丙丁酚，具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、預(yù)防動脈縮小等作用，對很多常見的疾病都有很好的治療作用[1].小劑量的ASA就具有較好的抗血栓作用，但ASA多數(shù)時候需要長期甚至終生服用.ASA口服過程中最大的問題是因集中釋藥，使局部藥物濃度過高，在體內(nèi)水解成水楊酸后對胃腸道黏膜有刺激作用[2-3]，嚴重時甚至出現(xiàn)水腫、糜爛潰瘍和出血的現(xiàn)象.所以對ASA和PRO的劑型方面的研究是目前較活躍的領(lǐng)域[4-5].

藥物劑型的研究離不開高分子材料.天然高分子材料中，殼聚糖(CS)和海藻酸鈉(ALG)是應(yīng)用較成熟的兩種[6].CS是自然界中唯一帶正電的堿性多糖，由貝殼類生物中的甲殼素經(jīng)脫乙酰化反應(yīng)而得,具有良好的粘合性、生物相容性和生物降解性[7]，以及無毒無味無免疫抗原反應(yīng)等特點，目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域.ALG也是一種天然的生物多糖，是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇后的副產(chǎn)品，具有無毒、無味等特點，生物相容性也很好，常被用于生物醫(yī)用領(lǐng)域[8].

本研究擬利用殼聚糖和海藻酸鈉這兩種高分子材料對ASA和PRO兩種藥物進行協(xié)同包埋，以期提高兩種藥物的利用效率，并降低藥物毒副作用.

1實驗部分

1.1藥品與儀器

ASA、PRO、醋酸、無水氯化鈣、CS、ALG、二氯甲烷、乙醇，均為市售的分析純或生物純.儀器有紫外可見分光光度計，傅里葉紅外光譜分析儀，馬爾文Zetasizer Nano ZS90，貝克曼Delsa Nano C，差示掃描量熱儀，臺式離心機.

1.2協(xié)同負載ASA/PRO的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的制備

將ALG溶于去離子水中分別配制成質(zhì)量濃度為1、2和3 mg/mL的ALG水溶液.將一定量的ASA溶解到ALG水溶液，待ASA完全溶解后，再充分攪拌0.5 h.稱取一定量的PRO溶解于一定體積的二氯甲烷中，攪拌讓其充分溶解.將PRO的二氯甲烷溶液逐滴滴加到溶有ASA的ALG溶液中，待PRO完全溶解在溶液中，再繼續(xù)攪拌0.5 h.

將CS溶于2%的稀醋酸溶液中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的CS醋酸溶液；將一定量的CS稀醋酸溶液，分別對應(yīng)滴入到溶有ASA和PRO的ALG溶液，待CS全部滴完，繼續(xù)攪拌0.5 h，并控制溶液pH=5.5，所得溶液呈藍色熒光.

2性能測試與表征

2.1PRO和ASA包封率的測定

將樣品在15 ℃下超離心(18 000 r/min)30 min，分離出納米粒子，將其冷凍干燥.上層清液用紫外分光光度儀測定波長為242 nm(PRO)和296 nm(ASA)處的吸收，計算游離的PRO和ASA 的量，用未包封PRO和ASA 的納米粒子作校正曲線.

納米粒子對藥物的包封率=(加入藥物的總質(zhì)量-游離藥物的質(zhì)量)/加入藥物的總質(zhì)量×100%.

每種試樣同時測5個平行樣，計算平均值.

2.2差示掃描量熱(DSC)分析

準確稱取5 mg冷凍干燥樣品，用KBr進行壓片，然后進行DSC分析.設(shè)置程序控溫：從室溫升溫到100 ℃，恒溫5 min；然后從100 ℃降溫到-30 ℃，并恒溫5 min；最后從-30 ℃升到300 ℃(升溫或降溫速度均為10 ℃/min).

2.3粒徑分布和Zeta電位分析

納米粒子的平均水合粒徑通過PCS粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS90)測試.每個樣品平行測定5次，取平均值.

納米粒子溶液的Zeta電位通過微電子電泳和一個Zeta Plus與Zeta電位分析儀(Delsa Nano C)來確定.測定方法如下：將樣品用軟化水稀釋，使得樣品與軟化水的比例為1∶40，所有的結(jié)果都在參考溫度25 ℃下轉(zhuǎn)化為標準值.每批樣品平行測定5次，取平均值.

3結(jié)果與討論

3.1PRO和ASA的包封率研究

本研究主要討論3個變量的影響(表1)，其一是ALG的質(zhì)量濃度，如1、2和3 mg/mL，分別用符號A1、A2和A3表示；其二是ASA和PRO的質(zhì)量濃度比，如1∶1、2∶1和1∶2，分別用符號B1、B2和B3表示；其三是ALG和CS的溶液的質(zhì)量濃度比，如1∶1、2∶1和1∶2，分別用符號C1、C2和C3表示.

表1　研究變量

圖1　普羅布考和阿司匹林的包封率Fig. 1　Entrapment efficiency of PRO and ASA

圖1為在表1所示的控制變量下，所獲得的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠對兩種藥物PRO和ASA的包封率.由圖1可以看出PRO和ASA包封率曲線的幾個明顯特征.

首先，與PRO的包封情況相比，殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠對ASA的包封效果普遍顯著.

其次，當(dāng)海藻酸鈉配制質(zhì)量濃度較小(1 mg/mL)，且當(dāng)CASA/PRO≥1時，無論海藻酸鈉和殼聚糖的質(zhì)量濃度比是大于還是小于等于1(如CALG/CS=1∶1，2∶1和1∶2)，殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠對PRO和ASA兩種藥物都顯示出較好的包封效果(1#～6#)；當(dāng)海藻酸鈉配制質(zhì)量濃度繼續(xù)增大(2和3 mg/mL)，且當(dāng)CASA/PRO<1(如CASA/PRO=1∶2)時，PRO和ASA兩種藥物的包封率也較高(16#～18#，25#～27#).殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠對ASA的包封率比對PRO的包封率普遍高的原因，可能是ASA為水溶性藥物，水凝膠可以與ASA形成離子交聯(lián)作用；而PRO為油溶性藥物，其跟CS和ALG都形成不了作用，只能靠物理包埋作用進入到水凝膠.

最后，由圖1可見另外3個比較重要的區(qū)別：1)當(dāng)海藻酸鈉配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL，CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=1∶2時(6#)，PRO和ASA的包封率都達到最大值，其值分別為96.33%和98.35%.出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是當(dāng)CALG/CS=1∶2時，除了CS能夠很好地與ALG形成致密的離子交聯(lián)作用，從而通過物理作用將PRO包裹到凝膠中外，多余的CS也能很好地通過與ASA作用將其包裹在其中.2)當(dāng)海藻酸鈉的配制質(zhì)量濃度由1 mg/mL(6#)增加到3 mg/mL，CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=2∶1時(23#)，殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠對PRO和ASA兩種藥物的包封效果卻出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，ASA和PRO的包封率最低，分別為46.01%和59.58%，這可能是因為海藻酸鈉的初始配制質(zhì)量濃度過高，減弱了海藻酸鈉與殼聚糖之間的離子交聯(lián)作用，使得形成的水凝膠對藥物的負載效果變差.3)當(dāng)海藻酸鈉配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL，CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=2∶1時(14#)，PRO和ASA的包封率差值最大，分別為54.01%和89.82%.在此條件下，由于ASA的濃度比PRO大，可以與帶正電的殼聚糖形成很好的交聯(lián)作用，從而削弱了海藻酸鈉與殼聚糖的相互作用，所以ASA的包封率比PRO的要大得多.

3.2殼聚糖/海藻酸鈉載藥復(fù)合水凝膠的TEM研究

圖2為負載兩種藥物的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的TEM照片.由圖2A所示空白不負載藥物的殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠的TEM照片可見，形成的水凝膠尺寸較小，結(jié)構(gòu)較致密.兩種藥物包封率最差的23#樣品的TEM照片顯示(圖2B)，基本沒形成較好的包裹結(jié)構(gòu)，且有很多藥物聚集顆粒分散.兩種藥物包封差距最大的復(fù)合水凝膠的TEM照片(圖2C)顯示，有尺寸較大的結(jié)構(gòu)較致密的復(fù)合水凝膠微球形成，且有明顯的藥物聚集顆粒(呈白點)分散在黑色微球周圍，這可能是未包裹的PRO形成的.圖2D所示的是PRO和ASA兩種藥物包封效果均最好的復(fù)合水凝膠的TEM照片，可以看出，載藥復(fù)合水凝膠雖然形狀不規(guī)則，但是結(jié)構(gòu)較致密.

3.3殼聚糖/海藻酸鈉載藥復(fù)合水凝膠的粒徑分布和Zeta電位分析

A:0#; B:23#; C:14#; D:6#.圖2　負載PRO/ASA藥物的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的電鏡照片F(xiàn)ig. 2　TEM of PRO/ASA loaded CS/ALG compositehydrogels

表2所示為空白和載藥的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的粒徑分布和Zeta電位值.其中空白不載藥的復(fù)合水凝膠(0#)的平均水合粒徑為(354.10±6.76) nm，Zeta電位為(-15.82±0.05) mV，說明納米水凝膠顆粒表面覆蓋著帶負電的海藻酸鈉，而帶正電的殼聚糖分子在納米水凝膠的內(nèi)核.而當(dāng)負載PRO和ASA后，復(fù)合水凝膠的粒徑迅速增大，如當(dāng)兩種藥物都包封最好時(6#)的粒徑達到了(845.90±7.08) nm.這可能是由于ASA與殼聚糖之間的作用削弱了殼聚糖與海藻酸鈉的相互作用，導(dǎo)致其離子交聯(lián)作用減弱的緣故.同時凝膠納米顆粒的表面電位為(-13.94±0.17) mV，其絕對值比空白凝膠納米表面電位值小，這也正說明了部分殼聚糖跟ASA發(fā)生了作用，導(dǎo)致與海藻酸鈉的作用能力降低.而藥物負載最差(23#)和差異最大(14#)的兩個樣品的復(fù)合納米水凝膠的粒徑更大，分別為(857.70±7.46)和(950.10±10.82) nm，并且表面電位都發(fā)生了反轉(zhuǎn)，變?yōu)檎?，分別為(11.12±0.39)和(0.59±0.03) mV.這說明，形成的納米粒子表面被殼聚糖分子纏繞，其中23#的電位正值較高，可能的原因是帶負電的ASA藥物和海藻酸鈉沒有很好地跟殼聚糖發(fā)生作用.而14#凝膠納米表面電位接近0，可能的原因在于，殼聚糖雖然不一定跟海藻酸鈉發(fā)生較好的作用，但是一定跟ASA之間發(fā)生了很好的作用，導(dǎo)致其對ASA的包封效果很突出.

表2　凝膠納米粒子的粒徑分布和Zeta電位

3.4載藥復(fù)合水凝膠的差示掃描量熱法(DSC)分析

圖3　負載PRO/ASA藥物的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的DSC譜圖Fig. 3　The DSC spectrogram of PRO/ASA loaded CS/ALG composite hydrogels

負載ASA/PRO的CS/ALG復(fù)合水凝膠的DSC分析如圖3所示，純的PRO在125 ℃左右有個強吸熱峰，是PRO的熔融溫度；純的ASA在140 ℃左右有個強吸熱峰，是ASA的熔融溫度.復(fù)合水凝膠負載PRO和ASA兩種藥物后，在120 ℃左右都有個小的吸熱峰，這應(yīng)該也是PRO藥物分子的晶體熔融峰，從而可以說明PRO是以物理包埋的形式包裹在凝膠中的.在140 ℃左右沒有出現(xiàn)吸熱峰，說明ASA分子不是以晶體形式存在，與其他物質(zhì)發(fā)生了相互作用.另外，包封最好的樣品(6#)上沒有出現(xiàn)ASA的熔融峰；但是藥物包封最差的樣品(23#)上在135 ℃左右出現(xiàn)一個小的吸熱峰，可能是ASA的熔融導(dǎo)致，這說明ASA沒有與其他物質(zhì)發(fā)生離子交聯(lián)作用，因此沒有被很好地包裹到水凝膠中.

4結(jié)論

殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合凝膠粒子對PRO和ASA的最佳包埋條件為CASA/PRO=2∶1且CALG/CS=1∶2(6#即A1B2C3變量)，此時PRO和ASA的包封率最高，分別為96.33% 和98.35%；并且表面電位為-13.94 mV，儲存穩(wěn)定性較好.

參考文獻:

[1] CHEN Y L, ZHAO S H, HUANG B Q, et al. Probucol and cilostazol exert a combinatorial anti-atherogenic effect in cholesterol-fed rabbits[J]. Thrombosis Research,2013,132(5):565-571.

[2] SCHR?R K, RAUCH B H. Aspirin and lipid mediators in the cardiovascular system[J]. Prostaglandins & Other Lipid Mediators,2015,121(A):17-23.

[3] SORIANO L C, BUENO H, LANAS A, et al. Cardiovascular and upper gastrointestinal bleeding consequences of low-dose acetylsalicylic acid discontinuation[J]. Thrombosis and Haemostasis,2013,110(6):1298-1304.

[4] TANG Y, SINGH J. Controlled delivery of aspirin: effect of aspirin on polymer degradation and in vitro release from PLGA based phase sensitive systems[J]. International Journal of Pharmaceutics,2008,357(1/2):119-125.

[5] AJUN W, YAN S, LI G, et al. Preparation of aspirin and probucol in combination loaded chitosan nanoparticles and in vitro release study[J]. Carbohydrate Polymers,2009,75(4):566-574.

[6] YOU R R, XIAO C M, ZHANG L, et al. Versatile particles from water-soluble chitosan and sodium alginate for loading toxic or bioactive substance[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,79:498-503.

[7] TRONCI G, AJIRO H, RUSSELL S J, et al. Tunable drug-loading capability of chitosan hydrogels with varied network architectures[J]. Acta Biomaterialia,2014,10(2):821-830.

[8] JABEEN S, CHAT O A, MASWAL M, et al. Hydrogels of sodium alginate in cationic surfactants: surfactant dependent modulation of encapsulation/release toward Ibuprofen[J]. Carbohydrate Polymers,2015,133(20):144-153.

Preparation of Composite Hydrogels Composed of Chitosan and Sodium Alginate Loaded Aspirin/Probucol

SUN Yan, LIU Jinhua, DU Yue, XU Bingqian, LU Chenjie, HAN Xixi, XIE Zerui, XIA Long

(Qianjiang College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:This study aims to use the composite hydrogel composed of chitosan and sodium alginate for loading aspirin and probucol, which are different largely in nature. Here, the optimum conditions for composite loading aspirin and probucol are explored. The results show that when the concentration ration between aspirin and probucol is 2∶1, and the concentration ratio of sodium alginate and chitosan is 1∶2, the best loading capability of drug is obtained. The encapsulation efficiency of probucol and aspirin are 96.33% and 98.35%, respectively, and the surface potential for drug loaded chitosan/sodium alginate hydrogels is -13.94 mV, which shows the better stability.

Key words:aspirin; probucol; chitosan; sodium alginate; composite hydrogel

收稿日期：2015-07-29

基金項目：國家自然科學(xué)青年基金項目(50903026)；杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院2014年度學(xué)生科研基金項目(2014QJXS36).

通信作者：孫燕(1978—)，女，副教授，博士，主要從事生物醫(yī)用高分子研究.E-mail:sunyan19hsz@126.com

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.03.005

中圖分類號:TQ314.1

文獻標志碼:A

文章編號:1674-232X(2016)03-0247-05