葉 立 軍，　畢 昌 昊，　張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034；2.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津　300308 )

crtE、crtY、crtI、crtB基因共調(diào)控提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量

葉 立 軍1,2，畢 昌 昊2，張 春 枝1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034；2.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津300308 )

摘要:代謝合成途徑優(yōu)化的關(guān)鍵在于途徑中多個(gè)基因表達(dá)的調(diào)控，本研究使用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子對代謝通路中多個(gè)相關(guān)基因同時(shí)調(diào)控以提高大腸桿菌β-胡蘿卜素產(chǎn)量。將來源于P. agglomerans的4個(gè)基因crtE、crtY、crtI、crtB，通過Golden Gate DNA方法與不同強(qiáng)度啟動(dòng)子組合得到質(zhì)粒庫，并轉(zhuǎn)化到底盤細(xì)胞中進(jìn)行顏色篩選。篩選得到crtE、crtY、crtI、crtB啟動(dòng)子組合各不相同的菌株，β-胡蘿卜素產(chǎn)量在0.64～8.82 mg/g，最高產(chǎn)量比對照提高了65.2%。本研究驗(yàn)證了通過Golden Gate組裝建庫對代謝通路多個(gè)基因同時(shí)調(diào)控以提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的可行性。

關(guān)鍵詞:代謝通量優(yōu)化；Golden Gate DNA 組裝；β-胡蘿卜素

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1560.TS.20160429.1428.004.html.

0引言

生物系統(tǒng)中蛋白表達(dá)水平的不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)浪費(fèi)并限制細(xì)胞生長[1]，或是出現(xiàn)中間產(chǎn)物的大量積累，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[2]。初次將一個(gè)異源表達(dá)代謝通路引入微生物時(shí)，都會(huì)出現(xiàn)這類問題，所以需要調(diào)整各類相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[3]。

目前對多個(gè)蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的方式有兩種。一種是多輪調(diào)節(jié)，每次只調(diào)節(jié)一個(gè)基因，并確定該基因的最優(yōu)表達(dá)水平，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行下一輪調(diào)節(jié)[4]。這種方式雖然可以分別對每一個(gè)基因進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)，但其最大的不足是分別得到的各個(gè)基因的最優(yōu)表達(dá)水平組合在一起不一定是真正的最優(yōu)組合。第二種方式就是將需要調(diào)節(jié)的多個(gè)基因與不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)組合，構(gòu)建出所有的質(zhì)粒，分別導(dǎo)入目的菌株進(jìn)行性狀篩選[5]。這種調(diào)節(jié)方式雖然能夠同時(shí)對多個(gè)基因調(diào)節(jié)，但分別構(gòu)建出每個(gè)質(zhì)粒工作量較大，即使是以生物模塊的方法一步步組裝，構(gòu)建過程依然較慢[6]。

前人研究了代謝工程中幾種調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方式：使用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子[7]、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)[8]、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性[9]和改變蛋白的降解速率[10]。本研究結(jié)合實(shí)際情況，考慮使用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的方式，并采用適合多片段一次性組裝的Golden Gate DNA組裝方法構(gòu)建多基因[11-12]，分別搭配不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的質(zhì)粒文庫，并通過轉(zhuǎn)化、篩選實(shí)現(xiàn)同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)水平的優(yōu)化。

課題組之前通過在E.coli中異源表達(dá)crtE、crtY、crtI、crtB基因生產(chǎn)β-胡蘿卜素[13]，本實(shí)驗(yàn)將對crtE、crtY、crtI、crtB進(jìn)行共調(diào)控，以提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，同時(shí)驗(yàn)證該調(diào)控方法的可行性。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料與儀器

1.1.1主要試劑

DNA回收試劑盒，PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA Marker trans2K plus及trans2K plusⅡ，限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ，T4 DNA 連接酶。

1.1.2儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀，MicroPulser；紫外可見分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2550。

1.1.3菌株

本實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的CAR001菌株作為出發(fā)菌株構(gòu)建底盤細(xì)胞。所用菌株在表1中列出。

表1　所用菌株

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

該公司為德國NAGEL集團(tuán)在中國設(shè)立的全資子公司，全權(quán)負(fù)責(zé)NAGEL集團(tuán)旗下三大進(jìn)口品牌在中國地區(qū)的所有業(yè)務(wù)，即：TBT深孔鉆設(shè)備、刀具等；NAGEL珩磨設(shè)備、珩磨刀具等；KADIA精密小孔珩磨設(shè)備、去毛刺設(shè)備和珩磨刀具等。同時(shí)，還負(fù)責(zé)國產(chǎn)機(jī)床—山西NAGEL（深孔加工設(shè)備、槍鉆刃磨機(jī)等）的銷售業(yè)務(wù)。

使用LB培養(yǎng)基，氯霉素終濃度分別為30 μg/mL。

好氧培養(yǎng)：將轉(zhuǎn)化得到的單菌落轉(zhuǎn)接到4 mL LB試管中(15 mm×100 mm)中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)，1%的接種量轉(zhuǎn)接到相應(yīng)好氧培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h。

1.2.2β-胡蘿卜素產(chǎn)量的檢測

通過測定丙酮萃取的β-胡蘿卜素在453 nm下的吸光度計(jì)算β-胡蘿卜素產(chǎn)量[14]。

1.2.3底盤細(xì)胞的構(gòu)建

使用Cas9基因編輯技術(shù)將CAR001中的crtEYIB基因敲除得到CAR001-Δcrt。通過CPEC的方法構(gòu)建Cas9相關(guān)質(zhì)粒得到整合質(zhì)粒[15],將質(zhì)粒導(dǎo)入到CAR001中進(jìn)行編輯。

1.2.4表達(dá)外源β-胡蘿卜素基因的質(zhì)粒庫構(gòu)建

圖1　參與Golden Gate反應(yīng)的啟動(dòng)子原件設(shè)計(jì)

2結(jié)果與討論

2.1底盤細(xì)胞的構(gòu)建

使用Cas9編輯技術(shù)將crtE、crtY、crtI、crtB4個(gè)基因敲除。敲除后使用表3中的驗(yàn)證引物200-UP-L-F、200-DOWN-R-R進(jìn)行驗(yàn)證，其大小應(yīng)為1.3 kb，結(jié)果如圖2所示。

表2　終止子-啟動(dòng)子復(fù)合元件

表3　引物列表

2.2表達(dá)載體的構(gòu)建

選擇低拷貝質(zhì)粒pACYC-184為模板，將Golden Gate酶切識別位點(diǎn)包埋在表3中引物Ga9-184-F，Ga9-184-R，PCR得到骨架片段。骨架PCR產(chǎn)物條帶大小2.6 kb，電泳如圖3所示。

2.3外源β-蘿卜素基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)要在一套強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子元件TM12、TM46、TM93、TM00(表2)前后分別包埋4種互不相同的Golden Gate酶切連接所用的黏性末端，構(gòu)成4套強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子。這4套啟動(dòng)子前后的酶切黏性末端分別與4個(gè)功能基因crtE、crtY、crtI、crtB提前包埋的前后黏性末端互補(bǔ)配對。將提前構(gòu)建好的質(zhì)粒載體片段與4個(gè)功能基因以及4套啟動(dòng)子元件，共21個(gè)片段一起放入Golden Gate DNA組裝體系進(jìn)行酶切連接反應(yīng)，得到一個(gè)質(zhì)粒文庫(理論上有256種組合)，如圖4所示。

圖2　CAR001中crtEYIB基因的敲除

將GoldenGate反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到CAR001-Δcrt中，涂布于含有氯霉素的LB固體培養(yǎng)基。挑取部分轉(zhuǎn)化子并使用鑒定引物EY-FEY-R,IB-FIB-R分別鑒定基因crtEcrtY和crtIcrtB。PCR鑒定結(jié)果如圖5所示，大小分別為1.3和2.5kb。

圖3含有GoldenGate酶切識別位點(diǎn)的pACYC-184 骨架

Fig.3The backbone of pACYC-184 embedded with Golden Gate restriction enzyme recognition site

圖4　基于啟動(dòng)子的多基因同時(shí)調(diào)控質(zhì)粒文庫構(gòu)建示意圖

1～4，基因crtEcrtY；5～8，基因crtIcrtB

2.4特征菌落測序及產(chǎn)量測定

根據(jù)顏色由淺到深挑選了有代表性的菌落，通過分光光度法測定OD453及OD600，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和大腸桿菌細(xì)胞量經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算β-胡蘿卜素絕對產(chǎn)量和單位體積菌體量，并得到β-胡蘿卜素的相對產(chǎn)量。如圖6所示，列出了有代表性菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量，其中產(chǎn)量最高的TM2菌株比對照組產(chǎn)量提高了65.2%。對菌株測序，通過序列比對得到crtE、crtY、crtI、crtB前邊的啟動(dòng)子組合情況，如表4所示。從表4可以看出，每個(gè)基因前邊的啟動(dòng)子都是變動(dòng)的，與預(yù)期目標(biāo)一致。產(chǎn)量測定結(jié)果及測序結(jié)果證明，使用GoldenGate方法分別將不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子與多個(gè)基因搭配構(gòu)建文庫，實(shí)現(xiàn)了對多個(gè)基因同時(shí)調(diào)控。該方法從設(shè)計(jì)引物構(gòu)建質(zhì)粒到轉(zhuǎn)化底盤細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化子，最快只需3d。與傳統(tǒng)分別構(gòu)建質(zhì)粒得到質(zhì)粒調(diào)節(jié)庫的方式相比，大大節(jié)省了時(shí)間和資源。

圖6　不同菌株β-胡蘿卜素的相對產(chǎn)量

表4　各個(gè)菌株啟動(dòng)子的組成

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了通過GoldenGateDNA裝配方法，使用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子分別與多個(gè)基因搭配構(gòu)建質(zhì)粒文庫，從而同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)基因表達(dá)的可行性。與同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)基因時(shí)采用的分別構(gòu)建各個(gè)質(zhì)粒的方式相比，本實(shí)驗(yàn)的方法在節(jié)省時(shí)間和資源耗費(fèi)方面都有較大的優(yōu)勢。但實(shí)驗(yàn)中使用的啟動(dòng)子數(shù)目較少，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可以適當(dāng)增加啟動(dòng)子的數(shù)目，或是改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度范圍進(jìn)行更精細(xì)的調(diào)節(jié)。

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Co-regulation ofcrtE,crtY,crtI,crtBgene expression to improve β-carotene yield

YELijun1,2,BIChanghao2,ZHANGChunzhi1

( 1.School of Biological and Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China )

Abstract:The key of metabolic or biosynthetic pathway optimization depended on expression regulation of genes in the pathway. Expression of β-carotene synthetic pathway genes were simultaneously modulated by promoters of various strength to optimized the efficiency of the pathway. Genes of crtE, crtY, crtI, crtB from P. agglomerans were modulated by promoter library and enabled by Golden Gate DNA assembly method to construct plasmid library, then transferred to E. coli chassis. Representative strains were obtained from the library and proved to have different expression pattern of crtE, crtY, crtI and crtB, and different β-carotene yield in the range of 0.64-8.82 mg/g. The highest yield was increased by 65.2% compared to the control strain. It is proved that simultaneous regulation of multiple genes in the metabolic pathway by constructing library with Golden Gate DNA assembling method to improve target production.

Key words:metabolic flux optimization; Golden Gate DNA assembling; β-carotene

收稿日期:2016-02-28.

基金項(xiàng)目:國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015AA020202)；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(Y5M2121111).

作者簡介:葉立軍(1991-)，男，碩士研究生；通信作者：張春枝(1963-)，女，教授.

中圖分類號:TS202.3；Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1674-1404(2016)03-0167-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016-04-29T14:28:31.