顧煥先，張國輝，佀勝利

（1.凱里市林業(yè)局森林植物防治檢疫站，貴州凱里 556000；2.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)分院，貴州凱里 556011）

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桂花病害的種類調(diào)查和病原鑒定

顧煥先1，張國輝2，佀勝利2

（1.凱里市林業(yè)局森林植物防治檢疫站，貴州凱里 556000；2.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)分院，貴州凱里 556011）

摘 要：根據(jù)貴州省麻江縣桂花的病害發(fā)生現(xiàn)狀，通過林間調(diào)查法和組織分離法對病害進(jìn)行調(diào)研，采用ITS保守序列測序和形態(tài)學(xué)鑒定的方法對致病的病原菌進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果表明，病原菌為木樨生葉點(diǎn)霉（Phyllosticta osmanthicola）和膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide），其導(dǎo)致的真菌病害分別為桂花葉枯病和炭疽病。

關(guān)鍵詞：桂花；木樨生葉點(diǎn)霉；膠孢炭疽菌

文獻(xiàn)著錄格式:顧煥先，張國輝，佀勝利.桂花病害的種類調(diào)查和病原鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（6）: 888-890.

桂花（Osmanthusfragrans）別名木樨、九里香、巖桂，為木樨科木樨屬常綠灌木或小喬木，既是優(yōu)良的園林綠化樹種，又是著名的香料植物和藥用植物［1］。由于病害可降低基地內(nèi)桂花的觀賞價(jià)值，也對其生長造成較大影響。本調(diào)查研究根據(jù)麻江縣國之魂綠業(yè)科技基地的桂花病害發(fā)生現(xiàn)狀，采用組織分離法和ITS保守序列測序?qū)Σ『M(jìn)行調(diào)研，為當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源的保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

室外病害調(diào)查。于2015年9月在貴州省黔東南州麻江縣國之魂綠業(yè)科技基地進(jìn)行標(biāo)本采集，記錄病害發(fā)生的特點(diǎn)和癥狀，并采集新鮮標(biāo)本用于病原分離和鑒定。

室內(nèi)試驗(yàn)。在凱里學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。病害標(biāo)本采集于貴州省黔東南州麻江縣國之魂綠業(yè)科技基地。供試培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基。

1.2 方法

觀察并描述發(fā)病部位的病斑形態(tài)、顏色、大小及為害程度等，同時(shí)對發(fā)病部位進(jìn)行拍照。采用組織分離法和切片法對發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌分離，切取病組織3塊，25℃下倒置培養(yǎng)5～7 d。對菌落進(jìn)行分離純化，直至獲得純培養(yǎng)。再在顯微鏡下對病原菌進(jìn)行鏡檢拍照，并對菌絲和孢子大小進(jìn)行測量、記錄。采用形態(tài)學(xué)鑒定和ITS保守序列測定對致病的病原微生物進(jìn)行分類鑒定。根據(jù)測序結(jié)果，將菌株的ITS-rDNA序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行序列比對與同源性分析，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定病原菌種類。

1.3 病原回接

純化后的致病菌于PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d，用無菌水洗下，配制成濃度為106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，采用針刺法接種。發(fā)病后，再從病斑上分離病原菌并鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花葉枯病

2.1.1 發(fā)病癥狀

主要為害桂花的葉片，由葉尖開始發(fā)病，沿著葉柄方向擴(kuò)延，病部出現(xiàn)黃褐色的不規(guī)則形大病斑，病健交界明顯，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)葉尖全發(fā)病，葉面變褐壞死，后期可在病斑上產(chǎn)生黑色小點(diǎn)（圖1中a）。

2.1.2 病原鑒定

分生孢子器大小為108.15～165.41 μm，球形，（圖1中b）。分生孢子圓形，無色，1～2 μm（圖1中c）。采用ITS保守序列測序和形態(tài)學(xué)鑒定的方法對致病的病原微生物進(jìn)行分類鑒定表明，病原菌為木樨生葉點(diǎn)霉（Phyllosticta osmanthicola）。

圖1　桂花葉枯病癥狀（a）、病原菌木樨生葉點(diǎn)霉的分生孢子器（b）和孢子（c）

2.2 桂花炭疽病

2.2.1 發(fā)病癥狀

主要為害桂花葉片，多由葉緣和葉面發(fā)病，葉面首先出現(xiàn)褪綠小斑點(diǎn)，病斑逐漸擴(kuò)大，呈圓形、半圓形或橢圓形。病斑邊緣有紅褐色，中央淺褐色至灰白色，發(fā)病處病健交界明顯。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致桂花葉片的壞死脫落（圖2中a）。

2.2.2 病原鑒定

分生孢子長圓柱形，兩端鈍圓，單孢，內(nèi)多有2個(gè)油球，孢子大小為9.99～30.38 μm×3.55～7.21 μm，采用ITS保守序列測序和形態(tài)學(xué)鑒定的方法對致病的病原微生物進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果表明，病原菌為膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）（圖2中b）。

圖2　桂花炭疽病癥狀（a）和病原菌膠胞炭疽菌（b）

2.3 病原回接結(jié)果

采用針刺法用孢子懸浮液接種3 d后，桂花葉片發(fā)病，再從病斑上采用組織分離法分離病原菌并鑒定，結(jié)果表明分離菌株與以上接種菌株相同，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌株為病害的致病菌木樨生葉點(diǎn)霉和膠胞炭疽菌。

3 討論

本研究通過組織分離法和致病性測定獲得致病菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的方法和ITS保守序列測序，最終確定病原菌的分類地位，以期為今后進(jìn)行貴州省黔東南州麻江縣國之魂綠業(yè)科技基地桂花的病害防控提供參考依據(jù)。桂花經(jīng)常受到很多病菌的侵染而表現(xiàn)生長不良甚至死亡，目前已研究和記載的桂花病害主要包括:桂花炭疽病和桂花葉尖皺縮病是膠胞炭疽菌引起［2-3］；桂花枯斑病由木樨生葉點(diǎn)霉引起［4］；桂花褐斑病由木樨生尾孢（Cerospora osmanthicola）引起［5］；桂花紫紋羽病由紫卷擔(dān)菌（Hlicobasidium perpueum）引起［6］；桂花煤污病由巴特勒小煤炱（Meliola butleri）、刺盾炱（Chaetothyrium spinigerum）和柑橘煤炱（Capnodiumcitri）引起［7］；桂花藻斑病由頭孢藻（Cephaleurosvirescens）引起［8］；桂花根結(jié)線蟲病由南方根結(jié)線蟲（Meloidogynearenaria）引起及桂花葉枯病由鏈格孢菌［Alternaia alternata（Fr.）Keissler］和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起［9-13］。

目前，貴州省對桂花病害的調(diào)查研究較少，為了解黔東南州桂花病害的基本情況，本研究對貴州省黔東南州麻江縣國之魂綠業(yè)科技基地桂花進(jìn)行調(diào)研，以期明確當(dāng)?shù)毓鸹òl(fā)病的病害種類。結(jié)果表明，當(dāng)前桂花的主要致病菌為木樨生葉點(diǎn)霉和膠胞炭疽菌，其引起的病害為葉枯病和炭疽病。桂花炭疽病是為害性較大的病害，其發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成桂花葉片的枯死、脫落甚至可導(dǎo)致整個(gè)樹體的死亡，嚴(yán)重影響桂花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。炭疽病的病原菌以分生孢子盤在病落葉中越冬，由風(fēng)雨傳播［14］。炭疽病在各個(gè)桂花種植地均有發(fā)生。

值得注意的是，木樨生葉點(diǎn)霉引起的葉枯病在已發(fā)表的相關(guān)論文中表述有所不同。目前已報(bào)道的主要有細(xì)極鏈格抱菌可導(dǎo)致葉枯病，木樨生葉點(diǎn)霉引起的桂花枯斑病，木樨生葉點(diǎn)霉引起的葉斑?。?5］。由此可見，不同地區(qū)和時(shí)間桂花葉枯病的致病菌和病害命名均有差異。故須結(jié)合組織分離法進(jìn)行病害鑒定和分析。本研究中采用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析分子鑒定的方法，鑒定出桂花葉枯病的致病菌，具有一定的科研價(jià)值和參考意義。

4 小結(jié)

針對根據(jù)貴州省麻江縣桂花的病害發(fā)生現(xiàn)狀，采用林間調(diào)查法和組織分離法對病害進(jìn)行調(diào)研，ITS保守序列測序和形態(tài)學(xué)鑒定的方法對致病的病原菌進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果表明，病原菌為木樨生葉點(diǎn)霉和膠胞炭疽菌，其導(dǎo)致的真菌病害分別為桂花葉枯病和炭疽病。本次的研究結(jié)果具有一定的科研價(jià)值，為保護(hù)貴州省黔東南州麻江縣國之魂綠業(yè)科技基地的重要林木種質(zhì)桂花資源提供了較好的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

中圖分類號：S435.671

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0528-9017（2016）06-0888-02

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160629

收稿日期:2016-02-15

基金項(xiàng)目:貴州省教育廳項(xiàng)目（黔教合人才團(tuán)隊(duì)字［2014］48）

作者簡介:顧煥先（1973—），男，貴州凱里人，工程師，本科，主要從事森林植物防治檢疫工作，E-mail: 410727748@qq.com。

通信作者:張國輝（1978—），副教授，E-mail: 59833259@qq.com。