楊錫蘭，李　言，王　盼，趙士弟，陳前芬

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川芎嗪對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

楊錫蘭，李言，王盼，趙士弟，陳前芬

[摘要]目的：探討川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)RhoA、Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK2)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化及細(xì)胞骨架連接蛋白(ezrin-radxin-moesin，ERM)磷酸化水平的影響。方法：以體外培養(yǎng)的HUVEC為實(shí)驗(yàn)對象，分為對照組、LPS組和TMP組(0.5、1.0、1.5 mg/mL)，熒光定量PCR測定內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCK2和信使RNA(p-Ezr mRNA)的表達(dá)，Western blot法測定內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，LPS組RhoA、ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白及RhoA、ROCK2和p-Ezr mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，TMP 3組RhoA蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白及ROCK2、p-Ezr mRNA表達(dá)均降低(P<0.05～P<0.01)，且TMP 3組之間ROCK2、p-MLC和p-ERM的分子表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)。結(jié)論：TMP對LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制Rho/ROCK信號通路中ROCK2、p-MLC和p-ERM的表達(dá),以減弱LPS對內(nèi)皮細(xì)胞骨架的損傷。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮，血管；川芎嗪；脂多糖；細(xì)胞骨架；Rho/ROCK通路

內(nèi)毒素與膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，血管內(nèi)皮通透性增高和大分子物質(zhì)滲出是其重要的病理生理過程，主要由炎癥介質(zhì)和細(xì)胞骨架改變共同介導(dǎo)。肌動蛋白細(xì)胞骨架已被認(rèn)為是細(xì)胞外信號啟動和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號時(shí)的首要靶蛋白，是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的重要機(jī)制[1]。研究[2]證實(shí)，Rho/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)的重要信號通路。多種因子和介質(zhì)可作用于Rho/ROCK信號通路使Rho活化，Rho激活ROCK，進(jìn)一步使磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)和細(xì)胞骨架連接蛋白(ezrin-radxin-moesin，ERM)水平升高，肌球蛋白交聯(lián)增加，微絲骨架收縮增強(qiáng)，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮，通透性增加。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的主要活性成分，在臨床上被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[3-4]。有研究[5]表明，TMP能減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。本實(shí)驗(yàn)擬建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)損傷模型，從分子水平探討Rho/ROCK信號通路是否參與LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，探討TMP對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及TMP干預(yù)Rho/ROCK信號通路的具體分子學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要材料、試劑及藥品健康足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，標(biāo)本取自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科(均征得產(chǎn)婦同意)；ECM培養(yǎng)基(Sciencell公司)；膠原酶Ⅰ型、β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Biosharp公司)；胰酶(碧云天生物技術(shù)研究所)；LPS(0111美國Sigma公司)；TMP(中國食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)品)；Ⅷ因子相關(guān)抗原兔抗人抗體、SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；RhoA抗體(Santa Cruz biotechnology)；兔抗人ROCK2抗體、p-MLC抗體、p-ERM抗體(Cell Signaling公司)；逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo公司)；Super Real熒光定量預(yù)混試劑(Tiangen公司)。

1.2原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、傳代無菌條件下，取新生兒臍帶(>20 cm)，剪去損傷部分，用37 ℃預(yù)熱的PBS沖洗3次。注入預(yù)熱的0.1% 膠原酶約15 mL，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，充分消化臍靜脈內(nèi)皮。收集消化液，然后注入含5%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入3 mL完全培養(yǎng)液，用吹打管吹打均勻，按1×106個接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待3～5 d，細(xì)胞生長成單層細(xì)胞，達(dá)到70%～80%融合后，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，然后加入0.25%胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)，經(jīng)Ⅷ因子抗體免疫組織化學(xué)鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞后,將2～3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3分組與處理實(shí)驗(yàn)分組(n=6)：(1)對照組不加特殊處理因素；(2)LPS組：只加LPS(0.1 μg/mL)；(3)TMP組：Ⅰ組(0.5 mg/mL TMP+0.1 μg/mL LPS)，Ⅱ組(1.0 mg/mL TMP+0.1 μg/mL LPS)，Ⅲ組(1.5 mg/mL TMP+0.1 μg/mL LPS)。實(shí)驗(yàn)處理：LPS組和TMP組分別加入藥物處理24 h(對照組加等體積的培養(yǎng)基)。處理時(shí)間結(jié)束后分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。

1.4檢測指標(biāo)和方法

1.4.1熒光定量PCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCK2、信使RNA(p-Ezr mRNA)的表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄合成說明書合成cDNA，Real-Time PCR反應(yīng)操作按Super Real熒光定量預(yù)混試劑盒說明書進(jìn)行，每份標(biāo)本均檢測3次。反應(yīng)體系：20 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 min →變性95 ℃ 10 s，退火52～60 ℃(RhoA、57 ℃；ROCK、53 ℃；p-Ezr、59 ℃)，延伸72 ℃ 30 s(收集熒光信號)，循環(huán)40次→溶解曲線分析。引物序列：RhoA上游5′-TGG ATG GAA AGC AGG TAG AGT-3′，下游5′-GTT GGG ACA GAA ATG CTT GAC-3′;ROCK2上游5′-TGA CAT TGG ACA GTA AAG ACA GTG-3′，下游5′-AGT GTT GTT TCG TAC AGG CAA T-3′;p-Ezr上游5′-TGC ACA AGT CTG GGT ACC TCA-3′，下游5′-CAT TTC CAG GTC CTG AGC AAT-3′;內(nèi)參GAPDH上游5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3′，下游5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3′。采用2-△△CT法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析。得到的RQ值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2Western blot法測定內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCK2、p-MLC、p-ERM蛋白表達(dá)用胰酶消化下細(xì)胞，與舊培養(yǎng)基一并收集至于離心管內(nèi)，加入RIPA裂解液+PMSF重懸5×106個細(xì)胞，置于冰上裂解30 min，不時(shí)彈動管壁使充分裂解。裂解后4 ℃，12 000 r/min離心15 min。樣品采用BCA法測定上清蛋白濃度。加上樣緩沖液煮沸變性后，取38 μg蛋白樣品于SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%BSA室溫封閉2 h，然后一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min；然后二抗孵育2 h，TBST洗3次后顯影，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)照相、拍照。用quantity one進(jìn)行積分光密度(integral optical density,IOD)值分析，與β-actin蛋白積分光密度值之比作為蛋白相對表達(dá)量。平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)，倒置顯微鏡觀察顯示融合的內(nèi)皮細(xì)胞為多角形或短梭形，呈典型的鵝卵石樣或鋪路石樣緊密排列，無重疊生長現(xiàn)象；內(nèi)皮細(xì)胞爬片后，第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測培養(yǎng)的正常內(nèi)皮細(xì)胞，陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量紅棕色顆粒積聚、濃染(見圖1 )。

2.2各組內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCK2、p-Ezr mRNA的表達(dá)比較擴(kuò)增曲線和溶解曲線提示產(chǎn)物純度高；LPS組與對照組比較，RhoA、ROCK2和p-Ezr mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，與LPS組比較，TMP各組RhoA mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ROCK2和p-Ezr mRNA表達(dá)均呈明顯的劑量依賴性下降(P<0.01)；TMP Ⅱ組和TMP Ⅲ組ROCK2和p-Ezr mRNA的表達(dá)均低于TMP Ⅰ組(P<0.05～P<0.01)(見圖2、表1)。

2.3內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCK2、p-MLC、p-ERM蛋白表達(dá)比較與對照組比較，LPS組RhoA、ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)；

q檢驗(yàn)：與對照組比較#P<0.05，##P<0.01；與LPS組比較 **P<0.01；與TMPⅠ組比較△P<0.05，△△P<0.01

TMP組與LPS組比較，RhoA蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05～P<0.01)，且TMP 3組之間呈劑量依賴性下降(P<0.05～P<0.01)(見圖3、表2)。

3討論

血管內(nèi)皮屏障功能障礙是膿毒血癥的病理基礎(chǔ)。革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分LPS可能通過影響內(nèi)皮屏障的功能參與了膿毒血癥的早期發(fā)病環(huán)節(jié)[6]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞骨架受到血管緊張素Ⅱ和白細(xì)胞介素-1等[7]的作用，細(xì)胞內(nèi)纖維狀網(wǎng)架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞收縮，內(nèi)皮屏障功能受損[8]。Rho/ROCK信號通路在調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài)方面扮演重要角色。有研究[9]表明，抑制Rho/ROCK信號通路能取得較顯著的內(nèi)皮保護(hù)作用。激活狀態(tài)的Rho蛋白與細(xì)胞膜相結(jié)合，進(jìn)一步激活ROCK2，活化的ROCK2 能使肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)失活，也可直接作用于MLC和ERM家族，使二者磷酸化水平增高。p-MLC的高表達(dá)能誘使肌動-肌球蛋白交聯(lián)增加，從而導(dǎo)致了肌動蛋白微絲骨架的聚合[10]；而p-ERM能進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞周邊應(yīng)力纖維的形成，二者共同作用最終導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加。本實(shí)驗(yàn)將LPS作為誘導(dǎo)劑，檢測到LPS組與對照組比較，RhoA、ROCK2和p-Ezr mRNA的表達(dá)和RhoA、ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，說明Rho/ROCK通路可能參與了LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程，LPS作用于Rho/ROCK信號通路且上調(diào)了RhoA、ROCK2、p-MLC和p-ERM的表達(dá)，造模成功。

q檢驗(yàn)：與對照組比較##P<0.01；與LPS組比較 *P<0.05，**P<0.01；與TMPⅠ組比較△P<0.05，△△P<0.01；與TMPⅡ組比較 ++P<0.01

TMP是從傘形科植物川芎中提取的一種酰胺類生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)為2，3，5，6-四甲基吡嗪。有研究[11]提示TMP具有抑制機(jī)體過度炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)和抗凝血等作用。TMP在抗動脈粥樣硬化中能保護(hù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞[12]。近年有報(bào)道[13]TMP對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷也有保護(hù)作用，但對于內(nèi)皮細(xì)胞上其他受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究均較少涉及。本實(shí)驗(yàn)建立LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型，從Rho/ROCK通路入手，探討TMP對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。TMP組和LPS組相比，RhoA蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于RhoA處于信號通路的上游，其表達(dá)較少受作用于下游的藥物影響，而TMP組整體升高的趨勢可能只是單一受LPS的影響所致；ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白及ROCK2和p-Ezr mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，提示TMP保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的分子機(jī)制可能與抑制ROCK2、p-MLC和p-ERM的表達(dá)有關(guān)，且TMP能劑量依賴性地減弱由LPS誘導(dǎo)的ROCK2、p-MLC和p-ERM激活。

綜上所述，Rho/ROCK通路可能參與了LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的病理過程，TMP可能通過降低Rho/ROCK通路信號分子的表達(dá)，對受損的內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。TMP的保護(hù)作用可為臨床實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)，但其在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)中其他信號通路的作用尚不完全清楚，仍需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]ETIENNE-MANNE VILLE S,HALL A.RhoGTPases in cell biology[J].Nature,2002,420(6 916):629.

[2]TAKAI Y,SASAKI T,MATOZAKI T.Small GTP-binding proteins[J].Physiol Rev,2001,81(1):153.

[3]XU H,SHI DZ,GUAN CY,etal.Clinical application and pharmacologic action of tetramethylpyrazine[J].Chin J Integr Med,2003,23(5):376.

[4]ZHAO L,WEI MJ,HE M,etal.The effects of tetramethylpyrazine on learning and memory abilities of mice with Alzheimer disease and its possible mechanism[J].Chin Pharmacol Bull,2008,24(8):1088.

[5]姚義安,張抒揚(yáng).內(nèi)皮細(xì)胞與動脈粥樣硬化[J].中華內(nèi)科雜志,2008,47(1):63.

[6]SUZUKI K,NEMOTO K,NINOMIYA N,etal.Fasudil,a Rho-kinase inhibitor,attenuates lipopolysaccharide-induced vascular hyperpermeability and colonicmuscle relaxation in guinea pigs[J].J Surg Res,2012,178(1):352.

[7]WETTSCHURECK N,OFFERMANNS S.Rho/Rho-kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology[J].J Mol Med,2002,80(10):629.

[8]王高頻,楊雪佳,王繼紅,等.鹽酸法舒地爾對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架損傷的保護(hù)作用[J].中國動脈硬化雜志,2010,18(10):795.

[9]國偉,孟建中,陳宇.Rho/Rho激酶信號通路與血管內(nèi)皮通透性的研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2009,28(2):154.

[10]LOIRAND G,GURIN P,PACAUD P.Rho kinases incardiovascular physiology and pathophysiology[J].Circ Res,2006,98:322.

[11]鄭紅,徐慶連,韓之勛,等.中藥川芎嗪對燙傷豚鼠腎臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,40(1):13.

[12]CUI L,WANG SX,LIU XY.The effective mechanism of tetramethylpyrazine in anti-atherosclerosis[J].Med Recap,2008,14(22):3491.

[13]李文明,劉洪濤,李秀英,等.川芎嗪對脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2009，25(11):1516.

(本文編輯劉暢)

Protective effect of tetramethylpyrazine on the injury endothelial cell induced by lipopolysaccharide

YANG Xi-lan,LI Yan,WANG Pan,ZHAO Shi-di,CHEN Qian-fen

(DepartmentofPathophysiology,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China)

[Abstract]Objective:To explore the effects of tetramethylpyrazine(TMP) on the levels of RhoA,Rho associated coiled coil forming protein kinase 2(ROCK2),myosin light chain(MLC) phosphorylation and ezrin-radxin-moesin(ERM) phosphorylation in the injury of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) induced by lipopolysaccharide(LPS).Methods:The HUVECs were cultured in vitro,and divided into the control group,LPS group and TMP groups(0.5,1.0,1.5 mg/mL).The mRNA levels of RhoA,ROCK2 and p-EZR in endothelial cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR,and the protein levels of RhoA,ROCK2,p-MLC and p-ERM were examined using western blotting.Results:Compared with the control group,the protein levels of RhoA,ROCK2,p-MLC and p-ERM,and the mRNA levels of RhoA,ROCK2 and p-Ezr in LPS group significantly increased(P<0.01).The differences of the protein and mRNA levels of RhoA between LPS group and 3 TMP groups were not statistically significant(P>0.05).Compared with the LPS group,the protein levels of ROCK2,p-MLC and p-ERM,and the mRNA levels of ROCK2 and p-Ezr decreased significantly in 3 TMP groups(P<0.01).The differences of the expression of ROCK2,p-MLC and p-ERM within 3 TMP groups were statistically significant(P<0.05 to P<0.01).Conclusions:TMP may protect the HUVECs against LPS-induced injury by inhibiting the expressions of ROCK2,p-MLC and p-ERM in Rho/ROCK signaling pathways,and reducing the injury of LPS on endothelial cell skeleton.

[Key words]endothelial,vascular;tetramethylpyrazine;eipopolysaccharide;cytoskeleton;Rho/ROCK pathway

[文章編號]1000-2200(2016)03-0284-04·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

[收稿日期]2015-01-31

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202833)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085MH140)；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(Byycx1306)

[作者簡介]楊錫蘭(1988-)，女，碩士研究生.[通信作者] 陳前芬，碩士研究生導(dǎo)師，副教授.E-mail：cqf14621@126.com

[中圖法分類號]R 322.12；R 284.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.002

[作者單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030