張 明 楊仁黨 李知函 楊 飛

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室,廣東廣州，510640)

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·抑菌劑·

殼聚糖改性及其在造紙白水中的抑菌應用研究

張 明 楊仁黨 李知函 楊 飛

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室,廣東廣州，510640)

殼聚糖經(jīng)冰醋酸溶解、氫氧化鈉堿性潤脹和冷凍預處理后,利用有機溶劑對殼聚糖置換脫水,再與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(ETA)制備不同取代度的殼聚糖季銨鹽；利用制備的殼聚糖季銨鹽作為抑菌劑對造紙廠白水中常見的細菌(如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等)進行抑菌實驗,并與常用抑菌劑進行比較,且將其與常用抑菌劑異噻唑啉酮復配,進行大腸桿菌和金黃色葡萄糖球菌抑菌效果實驗。實驗結果表明，通過用異丙醇對殼聚糖置換脫水,與空白樣相比殼聚糖季銨鹽得率提高14.3個百分點,產(chǎn)物得率最高可達到60.3%；從實際抑菌效果及生產(chǎn)成本考慮,最佳底物反應比例是n(殼聚糖)∶n(ETA)=1∶6；殼聚糖季銨鹽也是一種廣譜抑菌劑,在異噻唑啉酮中加入用量20%的殼聚糖季銨鹽,具有最好的復配抑菌性能。

殼聚糖季銨鹽；異丙醇；造紙白水；抑菌效果；復配

(*E-mail: 1020742122@qq.com)

造紙白水中含有纖維素、半纖維素、木素以及施膠劑、改性淀粉等,這為微生物的生長繁殖提供了豐富的營養(yǎng)[1],且封閉白水體系的溫度也適合微生物的生長繁殖[2]。這會導致漿料中腐漿的產(chǎn)生,進而引起管道堵塞和設備腐蝕,降低生產(chǎn)效率；同時腐漿還會造成孔眼、暗斑等紙病[3]。為解決因造紙生產(chǎn)過程中微生物生長而引起的各種問題,提高產(chǎn)品質量,實現(xiàn)連續(xù)高效清潔生產(chǎn),必須使用抑菌劑對白水系統(tǒng)中的微生物進行抑菌、殺菌控制[4]。目前用在造紙白水中的抑菌劑主要有氧系、氯系、溴系,但大多數(shù)在毒性、可降解性及環(huán)保方面難滿足造紙工業(yè)的生產(chǎn)要求[5]。

殼聚糖作為一種來源豐富的生物質資源,具有良好的生物相容性、無毒性、生物降解性和廣譜的抗菌抑菌等性能,其在新型抑菌材料制備、造紙白水處理等方面有著廣闊的應用前景[6-9]。但殼聚糖存在分子間與分子內氫鍵,結晶度較高,在水中不溶解。為提高殼聚糖的水溶性，以進一步改善其對造紙白水中微生物的抑菌效果,需對天然的殼聚糖進行化學改性[10]。由于殼聚糖分子鏈上含有氨基、伯羥基和仲羥基等反應性官能團,可以對殼聚糖進行改性以提高其溶解和抑菌效果[11]。

本研究以無毒、綠色、環(huán)保為理念,對殼聚糖進行改性,合成一種抑菌劑——殼聚糖季銨鹽,分析置換脫水劑乙醇、異丙醇對合成工藝的影響、殼聚糖季銨鹽的抑菌效果和機理,以及復配抑菌劑對白水微生物的抑菌效果。

1 實 驗

1.1 實驗原料

殼聚糖(CTS,脫乙酰度90.61%,相對分子質量1.0×105)；2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(ETA)；大腸桿菌(ATCC8739)、金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)、綠膿桿菌(ATCC9027)、黑曲霉菌(ATCC-16404)和枯草桿菌(ATCC6633)。

1.2 化學藥品

置換脫水劑：乙醇，異丙醇。

常用抑菌劑：異噻唑啉酮，吡啶硫酮鋅，十六烷基三甲基氯化銨。

1.3 實驗儀器

高速分散機、反應釜、電子分析天平、EVO18型掃描電子顯微鏡(SEM)、空氣搖床、壓力蒸汽滅菌鍋、無菌操作臺、生化培養(yǎng)箱。

1.4 殼聚糖季銨鹽的制備

將總質量為1.00 kg殼聚糖分多次溶于體積分數(shù)為2%的醋酸溶液中,在高速分散機中完全溶解后滴加質量分數(shù)40%的NaOH溶液,調節(jié)殼聚糖溶液的pH值到10左右,使殼聚糖完全析出,在-18℃冷凍條件下放置24 h后解凍,用水洗滌至中性。最后,用一定體積的乙醇或異丙醇分批次加入到殼聚糖中進行洗滌,置換出殼聚糖中的水。

將預處理過的殼聚糖轉移到30 L反應釜中,加入異丙醇攪拌分散成漿狀,并按一定比例分多次加入ETA,反應條件如表1所示。反應結束后,冷卻到室溫。真空減壓抽濾,用質量分數(shù)75%的乙醇洗滌(重復處理3次),干燥得殼聚糖季銨鹽粗產(chǎn)品,將殼聚糖季銨鹽粗產(chǎn)品置于冷凍干燥器中干燥，得殼聚糖季銨鹽精制品。

表1 殼聚糖季銨鹽的制備工藝條件

1.5 殼聚糖季銨鹽取代度的測定

稱取0.6 g(精確至0.001 g)殼聚糖季銨鹽精制品于250 mL錐形瓶中,加入100 mL蒸餾水使其充分溶解,加入5 g/L的鉻酸鉀溶液2 mL,用0.05 mol/L的硝酸銀標準溶液滴定至磚紅色沉淀剛出現(xiàn)即為滴定終點。另取一錐形瓶加入100 mL蒸餾水作空白對照實驗。每組實驗做3次,取平均值。取代度用式(1)計算。

(1)

式中，DS為取代度；V1為蒸餾水消耗AgNO3標準溶液體積,mL；V2為試樣消耗AgNO3標準溶液體積,mL；c為AgNO3標準溶液濃度,mol/L；314為殼聚糖季銨鹽的摩爾質量,g/mol；m為殼聚糖季銨鹽的質量,g。

1.6 殼聚糖季銨鹽抑菌性能檢測及分析

1.6.1 菌種的活化與計數(shù)

制備150 mL液體培養(yǎng)基,滅菌后將冷藏保存的菌種加入到液體培養(yǎng)基中,置于38℃空氣搖床中培養(yǎng)12 h,使細菌濃度約為108cfu/mL。然后把各菌液分別稀釋至102、104、106、108倍,對活菌進行計數(shù)。

1.6.2 抑菌實驗

將不同取代度的殼聚糖季銨鹽精制品、異噻唑啉酮、吡啶硫酮鋅、十六烷基三甲基氯化銨分別配成濃度為100、250、500、750、1000 mg/L溶液。準確移取0.1 mL菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上,再往培養(yǎng)基上加入0.1 mL不同濃度的溶液,將溶液涂勻,每個濃度制備3個平行樣。另設置空白對照組,涂菌,以等量無菌水代替上述溶液,處理完后將培養(yǎng)皿放到37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。統(tǒng)計菌落個數(shù),計算各抑菌劑的在不同濃度下的抑菌率。抑菌率用式(2)計算。

(2)

式中，N1為未經(jīng)抑菌劑處理的空白樣培養(yǎng)基上的菌落數(shù),N2為經(jīng)抑菌劑處理后培養(yǎng)基上菌落數(shù)。

1.6.3 掃描電子顯微鏡分析

將25 mL 1000 mg/L殼聚糖季銨鹽配制成一定濃度的溶液加入到裝有25 mL一定稀釋度菌液的試管中,設置空白組,搖床上38℃振蕩處理4 h,然后吸取適量液體滴加到鋁箔上,自然風干。最后對鋁箔表面進行噴金處理,置于EVO 18型掃描電鏡下,放大不同倍數(shù)進行觀察。

1.7 與異噻唑啉酮復配進行抑菌效果檢測

在一定量的異噻唑啉酮中分別加入0、10%、20%、30%、40%殼聚糖季銨鹽進行復配,再把復配抑菌劑配成100、250、500、750、1000 mg/L共5個濃度,按1.6.2步驟對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌做抑菌實驗。

2 結果與討論

2.1 置換脫水劑對反應的影響

采用等量異丙醇和乙醇對經(jīng)過預處理的殼聚糖置換脫水,然后與ETA在一定反應溫度和時間下進行反應,最后得到的產(chǎn)物呈淡黃色,產(chǎn)物得率、取代度如表2所示。由表2可知,殼聚糖未經(jīng)脫水時,產(chǎn)物得率為46.0%,取代度為0.62,而經(jīng)異丙醇處理后,產(chǎn)物得率能達到60.3%,取代度達到0.86,得率提高14.3個百分點,取代度提高0.24。故對殼聚糖進行置換脫水能明顯提高產(chǎn)物的得率和取代度。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是由于反應體系的水會使醚化劑水解且產(chǎn)物溶于水后體系黏度會增大,顆粒會聚集在一起,阻礙傳熱傳質,不利于親和取代反應,降低反應效率,從而降低產(chǎn)物得率和取代度。另外,在實驗過程中發(fā)現(xiàn),當殼聚糖在反應前未經(jīng)脫水處理時,最后所得的殼聚糖季銨鹽呈淡黃色黏稠狀,產(chǎn)物黏度很大,不易從反應釜中取出,而殼聚糖經(jīng)脫水處理后再與ETA反應,所得產(chǎn)物呈淡黃色顆粒狀,黏度很小,易從反應釜中取出。故對殼聚糖進行脫水處理,一方面能提高產(chǎn)物得率,另一方面也使產(chǎn)物方便取出,可提高生產(chǎn)效率。

表2 置換脫水劑對產(chǎn)物得率和取代度的影響

從表2可以看出,采用乙醇和異丙醇對殼聚糖進行脫水處理都能顯著提高產(chǎn)物得率和取代度,且采用乙醇脫水和異丙醇脫水的產(chǎn)物得率、取代度都相當。但采用乙醇脫水時,脫水后的殼聚糖里殘留有大量乙醇,而乙醇的沸點為78.3℃,當反應溫度高于78.3℃時,在反應過程中乙醇會揮發(fā)出來,存在安全隱患,故反應溫度應低于78.3℃。異丙醇的沸點為82.5℃,當反應溫度高于78.3℃而低于82.5℃時,異丙醇不會揮發(fā)出來,故反應溫度可高于78.3℃。在一定溫度范圍內,由于產(chǎn)物的得率、取代度會隨著溫度的升高而提高[12],因此反應溫度越接近82.5℃,產(chǎn)物的得率、取代度就會越高,故采用異丙醇比采用乙醇的效果好。另一方面,由于反應物是在異丙醇作為溶劑下進行反應的,為了方便溶劑的蒸餾回用,采用異丙醇作為置換脫水劑。

2.2 反應物摩爾比對抑菌效果的影響

圖1和圖2分別為反應物摩爾比[n(殼聚糖)∶n(ETA)]對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌率的影響。從圖1、圖2可以看出,殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌率隨反應物摩爾比的增加而增加,而當ETA用量達到殼聚糖的6倍以后,抑菌率增加不再明顯。這是由于殼聚糖季銨鹽的抑菌效果與殼聚糖季銨鹽的取代度有關,取代度越高,單位質量的殼聚糖季銨鹽含有越多的正電荷,可能就越容易吸附在帶負電的細胞壁上,破壞細胞的正常生理活動,使細菌死亡。表3為反應物摩爾比對殼聚糖季銨鹽取代度的影響。由表3可知,殼聚糖季銨鹽的取代度隨反應物摩爾比的增加而增加,這是因為殼聚糖不溶于異丙醇,殼聚糖與ETA接觸幾率隨ETA用量的增加而增加,有利于親核反應[12]；但當ETA用量達到殼聚糖的6倍時,殼聚糖上可供取代的基團有限,且隨著反應的進行,空間位阻也會增加,取代反應不易進行,故繼續(xù)增加ETA用量,產(chǎn)物的取代度變化不大；另外,從表3中也可看出采用有機溶劑對殼聚糖進行置換脫水,與空白樣相比取代度提高的相當明顯,其中采用異丙醇對殼聚糖置換脫水,取代度提高最明顯。當n(殼聚糖)∶n(ETA)=1∶6,且采用異丙醇對殼聚糖脫水時,從實際抑菌效果及生產(chǎn)成本考慮,可使企業(yè)獲得最大效益。

圖1 反應物摩爾比對大腸桿菌抑菌率的影響

圖2 反應物摩爾比對金黃色葡萄球菌抑菌率的影響

置換脫水劑取代度n(殼聚糖)∶n(ETA)1∶21∶41∶61∶81∶10空白 0.340.500.620.630.64乙醇 0.380.680.790.810.82異丙醇0.410.710.860.860.88

另外,從圖1、圖2也可以發(fā)現(xiàn)，殼聚糖季銨鹽對兩種菌的抑菌效果隨濃度的增加而提高,但殼聚糖季銨鹽在各濃度下對金黃色葡萄球菌的抑菌效果要比對大腸桿菌的效果差,這主要是由于金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽性菌,細胞壁較厚,約20～80 nm,肽聚糖含量豐富,有15～50層。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌,細胞壁厚度約10 nm,僅2～3層肽聚糖[13]。帶正電的殼聚糖季銨鹽吸附在帶負電的細胞壁上[14],而細胞壁越薄,殼聚糖季銨鹽可能越易進入細胞內部,其生長所需的平衡也越易遭到破壞,最后細胞可能會發(fā)生凹陷而死亡。因此殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌的抑菌效果要比對金黃色葡萄糖球菌的好。

2.3 殼聚糖季銨鹽的抑菌機理分析

圖3 殼聚糖季銨鹽處理大腸桿菌前后的SEM照片

利用殼聚糖季銨鹽對白水中常見的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行處理,在SEM下進行觀察,結果如圖3、圖4所示。從圖3可以看出大腸桿菌呈桿狀,在未經(jīng)處理時,細胞表面光滑,而經(jīng)處理后,細胞表面發(fā)生凹陷。從圖4可以看出金黃色葡萄球菌呈球狀,未經(jīng)處理時,細胞表面光滑,而經(jīng)處理后細胞也發(fā)生凹陷。這主要是由于殼聚糖季銨鹽帶正電,吸附帶負電的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞壁[14],在菌體細胞壁表面形成一層膜,菌體細胞膜的通透性會發(fā)生改變,使細胞膜喪失選擇透過性。這樣細胞內部一些重要的離子如鈉離子、鉀離子會泄漏出去,離子的流失會影響細胞內外滲透壓,這破壞了原有的平衡,細胞發(fā)生破裂,使得細胞的原生質如蛋白質、水等滲出,菌體表面發(fā)生凹陷,最后死亡。另外,小分子的殼聚糖季銨鹽可能會通過細胞膜進入細胞體內,吸附帶有陰離子的細胞質,并與其發(fā)生絮凝作用擾亂細胞正常生理活動,細胞發(fā)生破裂,菌體凹陷而死去。

圖4 殼聚糖季銨鹽處理金黃色葡萄球菌前后的SEM照片

2.4 殼聚糖季銨鹽與常見抑菌劑的對比

圖5 不同抑菌劑對大腸桿菌的抑菌率

圖6 不同抑菌劑對金黃色葡萄球菌的抑菌率

將殼聚糖季銨鹽與造紙行業(yè)常用的異噻唑啉酮、吡啶硫酮鋅、十六烷基三甲基氯化銨3種抑菌劑進行抑菌性能對比,結果如圖5和圖6所示。通過對比分析可知，殼聚糖季銨鹽的抑菌效果與異噻唑啉酮的抑菌效果相差較大,但其與吡啶硫酮鋅相比,具有很大的優(yōu)勢。從圖5、圖6也可以發(fā)現(xiàn),隨著抑菌劑濃度的增加,殼聚糖季銨鹽對兩種菌的抑菌曲線與十六烷基三甲基氯化銨的抑菌曲線分別在一定濃度出現(xiàn)交點,且兩條曲線間的距離相差不大,抑菌率最大差值不到5%,可以認為兩種抑菌劑的抑菌效果基本相當。但是,十六烷基三甲基氯化銨對水生生物有極高毒性,長期使用會對水體環(huán)境產(chǎn)生不良影響[15],故不適宜用于處理造紙白水。而殼聚糖季銨鹽是一種環(huán)保抑菌劑,其對微生物有良好的抑菌效果,可用于處理造紙白水中的微生物。

2.5 殼聚糖季銨鹽的廣譜性分析

造紙白水中常見的微生物除大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以外,主要還有黑曲霉菌、綠膿桿菌、枯草桿菌等[16],因此檢測殼聚糖季銨鹽對黑曲霉菌、綠膿桿菌、枯草桿菌的抑菌效果結果見圖7。從圖7可知,殼聚糖季銨鹽對黑曲霉菌、枯草桿菌、綠膿桿菌均有顯著的抑菌效果,且抑菌效果隨濃度的增加而提高。再結合圖5、圖6可知殼聚糖季銨鹽對白水中常見的5種微生物均有顯著的抑菌效果,可以認為殼聚糖季銨鹽是一種廣譜抑菌劑。

圖7 殼聚糖季銨鹽對綠膿桿菌、黑曲霉菌、枯草桿菌的抑菌率

2.6 殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮復配的抑菌效果

異噻唑啉酮是造紙企業(yè)處理白水微生物常用的抑菌劑,異噻唑啉酮抑菌是依靠雜環(huán)上的S—N鍵活性部位與蛋白質的半胱氨酸上的巰基形成二硫鍵,從而使蛋白質失活,達到抑菌的目的[17]。而殼聚糖季銨鹽的抑菌作用主要是改變細胞膜的通透性,最后使細胞發(fā)生凹陷達到抑菌的目的。由于兩種抑菌劑的抑菌機理不同,實驗對其進行復配,以期在抑菌效果上相互補充。

把殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮進行復配,然后處理大腸桿菌與金黃色葡萄球菌,抑菌效果如表4、表5所示。從表4和表5可知，在相同用量時，兩種抑菌劑復配后的抑菌效果明顯好于異噻唑啉酮單一使用時的效果。當抑菌劑濃度為100、250、500 mg/L時,隨著殼聚糖季銨鹽用量的增加,復配抑菌劑對兩種菌的抑菌效果提高,但是當殼聚糖季銨鹽用量大于20%時,抑菌率下降,因此從實際抑菌效果考慮可選取在異噻唑啉酮中加入用量20%殼聚糖季銨鹽。另外,在工業(yè)上如果長期使用單一抑菌劑也會使微生物產(chǎn)生抗藥性,將兩種抑菌劑復配使用,能有效避免這一問題[18]。

因此,把殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮進行復配,不僅能提高抑菌效果,同時也能有效緩解白水微生物對單一抑菌劑產(chǎn)生耐藥性的問題。

表4 復配抑菌劑對大腸桿菌的抑菌率

注 殼聚糖季銨鹽用量均相對于異噻唑啉酮，以下同。

表5 復配抑菌劑對金黃色葡萄球菌的抑菌率

3 結 論

(1)采用異丙醇和乙醇對殼聚糖置換脫水都能顯著提高殼聚糖季銨鹽得率和取代度,但使用異丙醇時的取代度和得率更高,得率能達到60.3%、取代度達到0.86,與空白樣相比得率提高14.3個百分點、取代度提高0.24。

(2)殼聚糖季銨鹽的抑菌機理是帶正電的殼聚糖季銨鹽吸附在帶負電的細胞壁表面,改變細胞膜的通透性,同時相對分子質量小的殼聚糖季銨鹽也會進入細胞內部,破壞細胞正常生長所需的各種平衡,細胞發(fā)生凹陷,菌體死亡。

(3)不同反應物摩爾比生產(chǎn)的殼聚糖季銨鹽產(chǎn)品對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌效果。從實際抑菌效果及生產(chǎn)成本考慮,最佳n(殼聚糖)∶n(ETA)=1∶6,此條件下生產(chǎn)的殼聚糖季銨鹽對黑曲霉菌、綠膿桿菌、枯草桿菌也都具有很好的抑菌效果,是一種廣譜抑菌劑,可用于處理造紙白水中的微生物；其抑菌效果比異噻唑啉酮的低,但比吡啶硫酮鋅的高,與十六烷基三甲基氯化銨的效果相當。

(4)殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮復配后,能提高處理白水微生物的效果,從實際抑菌效果考慮,在異噻唑啉酮中加入用量20%殼聚糖季銨鹽最好,同時也能有效緩解白水微生物對單一抑菌劑產(chǎn)生耐藥性的問題。

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(責任編輯：常 青)

Application of Modified Chitosan as Bacteriostatic Agent in White Water

ZHANG Ming*YANG Ren-dang LI Zhi-han YANG Fei

(StateKeyLabofPulpandPaperEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,GuangdongProvince， 510640)

Natural chitosan (CTS) was first dissolved in acetic acid and fully swelled up with sodium hydroxide, then dehydrated by organic solvents. Subsequently the quatemary ammonium chitosan (QCS) with different substitution degrees were synthesized by the reaction of chitosan 2,3-epoxypropyl trimethyl ammonium chloride(ETA) in different ratio. Two strains including Gram negativeE.coliand Gram positiveS.aureuswere selected for antibacterial tests because they are commonly found in papermaking white water. The antibacterial activities of QCS， isothiazolinone and their mixture were also investigated. Result indicated that isopropyl alcohol was better than ethyl alcohol using for dehydration, the yield of dehydrating chitosan with isopropyl alcohol reached to 60.3%, and 14.3 percentage points higher than the control sample. From the point of view of actual bacteriostatic effect and the production costs, the bestn(CTS)∶n(ETA)was 1∶6. Chitosan quaternary ammonium salt was a broad-spectrum antibacterial agent, the best bacteriostatic performance was achieved by adding 20% quaternary ammonium salt of chitosan to isothiazolinone.

quaternary ammonium salt of chitosan; isopropyl alcohol; papermaking white water; bacteriostatic effect; compounding

張 明先生,在讀碩士研究生；研究方向：植物資源綜合利用新技術。

2015-10-20(修改稿)

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAC01B03)。

TS727+.2

A DOI：10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.04.004