蔣鴻琳，李　靜，于　斐，巴　月，王重建，玉崧成，王　艷，趙林遠(yuǎn)，李文杰#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001　2)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科 洛陽 471000　3)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001　4)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

河南農(nóng)村地區(qū)漢族2型糖尿病人群VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測>*

蔣鴻琳1)，李靜2)，于斐1)，巴月3)，王重建4)，玉崧成1)，王艷1)，趙林遠(yuǎn)1)，李文杰1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 4500012)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科 洛陽 4710003)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 4500014)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

關(guān)鍵詞2型糖尿??；維生素D受體；單核苷酸多態(tài)性；河南；農(nóng)村

摘要目的：探討河南農(nóng)村地區(qū)漢族人群維生素D受體(VDR)基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)基因多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)的關(guān)系。方法：采用RCR-RFLP技術(shù)檢測河南省漢族人群中286例T2DM患者、286例健康對照VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)的多態(tài)性。分析2組間Apa Ⅰ和Taq Ⅰ等位基因、基因型和單倍體型分布與T2DM的關(guān)系。結(jié)果：2組間Apa Ⅰ等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)，T等位基因攜帶者患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者的1.328倍(95%CI=1.018～1.733)。2組間Taq Ⅰ等位基因和基因型分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Apa Ⅰ和Taq Ⅰ之間存在連鎖不平衡(D′=0.744)，其中，單倍體型Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT在病例組的分布頻率高于對照組[χ2=7.313，OR(95%CI)=1.485(1.114～1.981),P<0.05]。結(jié)論：在河南農(nóng)村漢族人群中，VDR基因Apa Ⅰ位點(diǎn)的等位基因T和單倍體型TT可能是T2DM的遺傳易感因素。

糖尿病是全球性的公共衛(wèi)生問題，預(yù)計(jì)到2030年全球糖尿病的患病人數(shù)將達(dá)4.39億[1]。據(jù)2010年一項(xiàng)全國糖尿病患病率現(xiàn)況抽樣調(diào)查結(jié)果[2]估計(jì)，中國成人糖尿病總數(shù)已達(dá)1.13億，患病率高達(dá)11.6%。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是公認(rèn)的由遺傳與環(huán)境因素共同作用的代謝紊亂性疾病，遺傳易感性對T2DM的發(fā)病機(jī)制十分重要[3-4]，目前已發(fā)現(xiàn)至少200多種基因與T2DM存在相關(guān)性。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)維生素D是維持正常的胰島素分泌和糖耐量所必需的物質(zhì)，能影響胰島β細(xì)胞的功能，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其生物活性通過與維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。VDR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，與1,25-(OH)2D3結(jié)合后形成的復(fù)合物可特異性識別并結(jié)合靶基因上游調(diào)控區(qū)的DNA序列，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一系列諸如調(diào)節(jié)鈣磷代謝、促進(jìn)細(xì)胞分化凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。近年來國內(nèi)外多項(xiàng)研究[8-9]報(bào)道VDR基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與維生素D代謝水平、胰島素敏感性和T2DM存在一定的關(guān)聯(lián)。該研究選取VDR基因上常見的兩個(gè)SNP位點(diǎn)Apa Ⅰ(rs7975232,G>T)和Taq Ⅰ(rs731236,T>C)，從基因水平進(jìn)一步探討VDR變異與河南農(nóng)村地區(qū)漢族人群T2DM易感性的關(guān)系。

1對象與方法

1.1研究對象以村為單位，采用整群抽樣的方法從河南省鄭州市二七區(qū)侯寨鄉(xiāng)、焦作市武陟縣選取18～87歲漢族T2DM患者286人，相互間無親緣關(guān)系，無其他自身免疫性疾病史，納入病例組;依據(jù)WHO(1999年)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，既往有T2DM史且正在進(jìn)行降糖治療，或2次空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，并排除1型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類型糖尿病者[10]；研究同時(shí)排除此次調(diào)查中60歲以上新診T2DM患者。對照人群選自和病例同一村民組、年齡±5歲、同性別、無相關(guān)慢性疾病或自身免疫性疾病者。相關(guān)研究設(shè)計(jì)經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會審核通過，所有研究對象均知情同意。

1.2血樣的采集與處理抽取研究對象空腹靜脈血約10 mL，其中5 mL分離、分裝血漿，采用全自動生化分析儀測定血漿葡萄糖水平； 5 mL抗凝血采用百泰克公司提供的DNA提取試劑盒提取人白細(xì)胞基因組DNA。

1.3VDR基因分型方法采用RCR-RFLP法。由于VDR兩個(gè)SNP位點(diǎn)Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位于同一擴(kuò)增片段上，因此二者共用一對引物。上游引物序列為5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’，下游引物序列為5’-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC-3’。取DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Mix 7.5 μL，超純水4.5 μL，總反應(yīng)體系15 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)31次。擴(kuò)增完成后，向反應(yīng)體系中加入內(nèi)切酶0.5 μL、Buffer 1 μL，混勻后Apa Ⅰ位點(diǎn)酶切體系于37 ℃水浴，Taq Ⅰ位點(diǎn)酶切體系于65 ℃水浴，反應(yīng)3 h后，點(diǎn)樣電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果，分析Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)基因型。

1.4數(shù)據(jù)處理運(yùn)用EpiData 3.0進(jìn)行雙人雙錄并核查。采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，對對照人群的基因型頻數(shù)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，采用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對照組基因型分布，SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)進(jìn)行等位基因關(guān)聯(lián)度分析[以Lewontin′sD′值(D′)>0.7為有意義]和單倍體型分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)在對照人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.347和5.594，P均>0.05)。

2.2VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)基因型分析

Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)的PCR-RFLP電泳結(jié)果見圖1、2。Apa Ⅰ位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后有3種基因型，野生純合型GG(528、217 bp)，突變雜合型GT(745、528、217 bp)，突變純合型TT(745 bp)。Taq Ⅰ位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后有3種基因型，野生純合型TT(494、251 bp)，突變雜合型TC(494、293、251、201 bp)，突變純合型CC(293、251、201 bp)。

1：TT;2、6、7：GG;3～5、8：GT;9：Marker。圖1　VDR基因Apa Ⅰ位點(diǎn)電泳結(jié)果圖

1：TC;2：CC;3：TT;4：Marker。圖2　VDR基因Taq Ⅰ位點(diǎn)電泳結(jié)果圖

2.3VDR基因多態(tài)性與T2DM的關(guān)系結(jié)果見表1、2。由表1、2可知，兩組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Apa Ⅰ位點(diǎn)突變型等位基因T攜帶者患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者的1.328倍[OR(95%CI)=1.328(1.018～1.733)]。

表1　2組VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)基因型的分布

表2　2組VDR基因

2.4等位基因關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果顯示Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)間D′值為0.744，可以認(rèn)為Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡，且構(gòu)成一個(gè)單倍體域。

2.5VDR基因單倍體型與T2DM的關(guān)系應(yīng)用SHEsis在線軟件對Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)可構(gòu)建4種單倍體型(Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GC、GT、TC、TT)，系統(tǒng)默認(rèn)頻率3%以上為有意義的單倍體型，最終結(jié)果顯示3種單倍體型有意義，即Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT、TC和TT。以Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GC作為參照進(jìn)行比較，病例組中Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT的頻率低于對照組，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT的頻率在病例組中較高，提示Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT可能對T2DM具有保護(hù)性作用，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的升高存在關(guān)聯(lián)性。見表3。

表3　病例組與對照組

3討論

不同研究結(jié)果表明，VDR基因多態(tài)性存在種族和地區(qū)的差異。對于Apa Ⅰ位點(diǎn)，國內(nèi)外多項(xiàng)研究[11-13]證實(shí)其多態(tài)性與葡萄糖耐量相關(guān)，而與T2DM的關(guān)系存在爭議。APa Ⅰ位于第8內(nèi)含子，其多態(tài)性不直接影響編碼蛋白的氨基酸序列，但可能通過影響mRNA穩(wěn)定性而影響VDR蛋白的合成[11]。該研究中ApaⅠ的基因型分布在病例組和對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與安徽地區(qū)的研究結(jié)果[14]相同，但等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其等位基因T可能是河南漢族群體T2DM的易感基因，其多態(tài)性或與T2DM其他相關(guān)基因存在連鎖不平衡。該研究結(jié)果還顯示，在河南農(nóng)村地區(qū)的漢族人群中，Taq Ⅰ位點(diǎn)不同基因型和等位基因頻率在病例組和對照組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與寧夏地區(qū)的研究[15]結(jié)果相似。Taq Ⅰ位點(diǎn)位于第9外顯子上，由于Taq Ⅰ多態(tài)性導(dǎo)致的是同義突變，編碼的蛋白質(zhì)并未產(chǎn)生變化，故可能并未影響合成的VDR蛋白與配體結(jié)合的功能。此外，對Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點(diǎn)等位基因的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，二者間存在顯著的連鎖不平衡，構(gòu)成的單倍體型Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT在對照組的頻率分布高于病例組，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT在病例組的分布頻率則更高，提示這兩種單倍體型與T2DM密切相關(guān)，Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT可能是河南農(nóng)村地區(qū)漢族人群T2DM的遺傳易感因素。而單獨(dú)分析時(shí)兩者的基因型分布與T2DM均不存在相關(guān)性，說明Apa Ⅰ和TaqⅠ位點(diǎn)多態(tài)性對T2DM獨(dú)立影響的作用較小，但可能通過基因間相互作用影響T2DM。單倍體型分析可能較單個(gè)SNP位點(diǎn)的分析更具說服力。

綜上所述，河南農(nóng)村地區(qū)漢族T2DM人群中VDR基因多態(tài)性和T2DM發(fā)病存在相關(guān)性；VDR基因Apa Ⅰ位點(diǎn)的等位基因T和Apa Ⅰ-TaqⅠ單倍體型TT可能是T2DM的遺傳易感因素。在基因水平上的研究應(yīng)更重視基因與基因間的聯(lián)合作用。T2DM同時(shí)受到環(huán)境因素的影響，因此該研究為后續(xù)進(jìn)一步探討基因與環(huán)境的交互作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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(2016-01-11收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Detection of VDR gene Apa Ⅰ and Taq Ⅰ polymorphism in Han type 2 diabetes patients in Henan rural area

JIANGHonglin1),LIJing2),YUFei1),BAYue3),WANGChongjian4),YUSongcheng1),WANGYan1),ZHAOLinyuan1),LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofClinicalNutrition,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofScience&Technology,Luoyang4710003)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordstype 2 diabetes mellitus;vitamin D receptor;single nucleotide polymorphism;Henan Province;rural area

AbstractAim: To investigate the correlation of vitamin D receptor(VDR) gene at Apa Ⅰ and Taq Ⅰ with type 2 diabetes mellitus(T2DM) in Han population of rural area in Henan Province.Methods: PCR-RFLP method was carried out to examine the SNPs at Apa Ⅰ and Taq Ⅰ of VDR gene in 286 T2DM patients and 286 healthy controls in the Han population of Henan Province, then the distribution of allele, genotype and haplotypes between the two groups were compared.Results: The allelic frequencies of Apa Ⅰ had significant differences between the two groups(P=0.036). Individuals with allele T had a risk of 1.328 times as high as those without it(95%CI=1.018-1.733). However, the allelic frequencies and genotypic frequencies of Taq Ⅰ had no significant differences between the two groups(P>0.05). There was significant linkage disequilibrium between Apa Ⅰ and Taq Ⅰ(D′=0.744). The frequency of haplotype Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT was higher in the T2DM group than control group[χ2=7.313，OR(95%CI)=1.485(1.114-1.981),P<0.05].Conclusion: The allele T of Apa Ⅰ and the haplotype TT of Apa Ⅰ-Taq Ⅰ of VDR gene may be associated with higher T2DM susceptibility in Henan rural Han population.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.005

#通信作者，男，1958 年11月生，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)相關(guān)慢性病，E-mail:lwj@zzu.edu.cn

中圖分類號R587.1

*“973”計(jì)劃前期研究專項(xiàng)2012CB526709；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81573151，U1204823；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目154200510010