宋瑛瑛，黃　麗，唐　明

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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不同碳源和氮源對(duì)4種深色有隔內(nèi)生真菌生長(zhǎng)的影響

宋瑛瑛a，黃麗a，唐明b

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 明確不同碳源及氮源對(duì)4種深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes，DSE)生長(zhǎng)的影響,確定4種DSE生長(zhǎng)的最適碳源和氮源，為深色有隔內(nèi)生真菌的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以沙門外瓶柄霉(Exophiala salmonis)、甘瓶霉(Phialophora mustea)、菊異莖點(diǎn)霉(Paraphoma chrysanthemicola)和枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)4種深色有隔內(nèi)生真菌為材料，在固體和液體條件下培養(yǎng)，研究不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉和山梨醇)和氮源(磷酸氫二銨、草酸銨、硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉、酸水解酪蛋白、胰蛋白胨和蛋白胨)對(duì)其菌絲平均生長(zhǎng)速度和菌絲干質(zhì)量的影響。【結(jié)果】 固體培養(yǎng)條件下，沙門外瓶柄霉、甘瓶霉和菊異莖點(diǎn)霉的最佳碳源均是葡萄糖，枝狀枝孢菌的最佳碳源是乳糖；沙門外瓶柄霉、甘瓶霉和枝狀枝孢菌的最佳氮源均是硝酸鈉，菊異莖點(diǎn)霉的最佳氮源是胰蛋白胨。液體培養(yǎng)條件下，甘瓶霉、菊異莖點(diǎn)霉和枝狀枝孢菌的最佳碳源均是可溶性淀粉，沙門外瓶柄霉的最佳碳源是葡萄糖；沙門外瓶柄霉、甘瓶霉、菊異莖點(diǎn)霉和枝狀枝孢菌的最佳氮源分別是磷酸氫二銨、草酸銨、蛋白胨和硝酸銨。【結(jié)論】 初步確定了4種深色有隔內(nèi)生真菌生長(zhǎng)的最佳碳源和氮源。

[關(guān)鍵詞]深色有隔內(nèi)生真菌；碳源；氮源

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes，DSE)指一類能定殖于植物根內(nèi)，不引起植物明顯病理學(xué)特征，不產(chǎn)孢或產(chǎn)無性孢子的一類小型真菌，屬于子囊菌或半知菌[1-2]。DSE的宿主專一性不強(qiáng)，廣泛分布于干旱、重金屬污染等逆境生態(tài)系統(tǒng)中，發(fā)揮著類似菌根真菌的生態(tài)學(xué)功能[3]。研究表明，DSE可促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收[4-5]，增強(qiáng)植物的抗旱性[3]、抗病性[6]和對(duì)重金屬的抗性[7-8]，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

相對(duì)于不可體外培養(yǎng)的叢枝菌根真菌，DSE可以在體外純培養(yǎng)。因此，深入了解DSE體外純培養(yǎng)的培養(yǎng)條件并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化尤為重要，盡管目前對(duì)DSE已有較多研究報(bào)道，但有關(guān)其純培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)條件的研究很少。本研究以分離自陜西鳳縣鉛鋅礦區(qū)的對(duì)鉛具有較高耐性的4種DSE[9]為試驗(yàn)材料，研究了不同碳源和氮源對(duì)其生長(zhǎng)的影響，以篩選其適宜的碳源和氮源，初步了解DSE的生物學(xué)特性，為DSE的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌種

供試DSE菌種為沙門外瓶柄霉(Exophialasalmonis)、甘瓶霉(Phialophoramustea)、菊異莖點(diǎn)霉(Paraphomachrysanthemicola)和枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)，均分離自陜西鳳縣鉛鋅礦區(qū)植物沙打旺(Astragalusadsurgens)根部，保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。將保存的菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)10 d后用打孔器(直徑5 mm)在菌落邊緣打取菌餅，用于固體和液體培養(yǎng)接種。

1.2不同碳源對(duì)DSE生長(zhǎng)的影響

固體培養(yǎng)：以改良MMN固體培養(yǎng)基[10]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等量的蔗糖、麥芽糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉和山梨醇代替其中的葡萄糖(對(duì)照)，得到不同碳源培養(yǎng)基。將4種真菌分別取1個(gè)菌餅接種于培養(yǎng)基中央，25 ℃暗培養(yǎng)25 d，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度；同時(shí)參照李芳等[11]的方法收獲菌絲，80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量菌絲干質(zhì)量(生物量)。每處理做4個(gè)重復(fù)。

液體培養(yǎng)：去除MMN固體培養(yǎng)基中的瓊脂進(jìn)行液體培養(yǎng)。于250 mL三角瓶中裝入100 mL液體MMN培養(yǎng)基，每瓶接種2個(gè)菌餅，25 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)7 d，參照宿紅艷等[12]的方法過濾收集菌絲并用自來水沖洗3次，80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量菌絲干質(zhì)量(生物量)。每處理做4個(gè)重復(fù)。

1.3不同氮源對(duì)DSE生長(zhǎng)的影響

用等量的無機(jī)氮(草酸銨、硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉)和有機(jī)氮(酸水解酪蛋白、胰蛋白胨和蛋白胨)代替MMN培養(yǎng)基中的磷酸氫二銨(對(duì)照)，得到不同氮源培養(yǎng)基。按照1.2的方法進(jìn)行DSE固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，測(cè)定菌絲平均生長(zhǎng)速度和生物量。每處理做4個(gè)重復(fù)。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用Sigmaplot 10.0繪圖。所有數(shù)據(jù)為4次重復(fù)的平均值。

2結(jié)果與分析

2.1不同碳源對(duì)4種DSE生長(zhǎng)的影響

4種DSE均能利用供試的8種碳源，說明它們可利用的碳源范圍較廣。

2.1.1對(duì)沙門外瓶柄霉生長(zhǎng)的影響由圖1可知，固體培養(yǎng)條件下，以乳糖為碳源時(shí)沙門外瓶柄霉平均生長(zhǎng)速度較快，其次是可溶性淀粉，分別比對(duì)照(葡萄糖)顯著提高了13.2%和9.9%(P<0.05)；以葡萄糖為碳源時(shí)沙門外瓶柄霉生物量較大，其次是麥芽糖，二者與其他碳源差異顯著(P<0.05)。由表1可知，液體培養(yǎng)條件下，以葡萄糖和麥芽糖為碳源時(shí)沙門外瓶柄霉的生物量較大，且二者沒有顯著差異，但明顯優(yōu)于其他碳源。據(jù)此確定，固體和液體培養(yǎng)時(shí)沙門外瓶柄霉適宜的碳源均是葡萄糖和麥芽糖。

2.1.2對(duì)甘瓶霉生長(zhǎng)的影響由圖1可知，固體培養(yǎng)條件下，以可溶性淀粉為碳源時(shí)甘瓶霉平均生長(zhǎng)速度最快，其次是乳糖，兩者比對(duì)照(葡萄糖)分別顯著提高了22.3%和13.7%(P<0.05)；以葡萄糖和麥芽糖為碳源時(shí)甘瓶霉生物量較大，其次是乳糖和果糖，與其他碳源差異顯著(P<0.05)。由表1可知，液體培養(yǎng)條件下，以可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)甘瓶霉生物量較大，其次是麥芽糖和甘露醇，與其他碳源差異顯著(P<0.05)。據(jù)此確定，固體培養(yǎng)時(shí)，甘瓶霉生長(zhǎng)適宜的碳源是葡萄糖和麥芽糖，液體培養(yǎng)時(shí)適宜的碳源是可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖。

2.1.3對(duì)菊異莖點(diǎn)霉生長(zhǎng)的影響由圖1知，固體培養(yǎng)條件下，以葡萄糖和甘露醇為碳源時(shí)菊異莖點(diǎn)霉平均生長(zhǎng)速度較快，其次是乳糖，三者與其他碳源差異顯著(P<0.05)；以葡萄糖和乳糖為碳源時(shí)菊異莖點(diǎn)霉生物量較大，其次是可溶性淀粉。由表1可知，液體培養(yǎng)條件下，以可溶性淀粉為碳源時(shí)菊異莖點(diǎn)霉生物量較大且比對(duì)照顯著提高89.7%(P<0.05)，其次是葡萄糖和蔗糖。所以菊異莖點(diǎn)霉固體培養(yǎng)時(shí)適宜的碳源是葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉，液體培養(yǎng)時(shí)適宜的碳源是可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖。

2.1.4對(duì)枝狀枝孢菌生長(zhǎng)的影響由圖1知，固體培養(yǎng)條件下以可溶性淀粉為碳源時(shí)枝狀枝孢菌平均生長(zhǎng)速度較快，比對(duì)照顯著提高13.6%(P<0.05)，其次是乳糖和葡萄糖；以乳糖、山梨醇、葡萄糖和甘露醇為碳源時(shí)枝狀枝孢菌生物量較大且與其他碳源差異顯著(P<0.05)。由表1可知，液體培養(yǎng)條件下，以可溶性淀粉為碳源時(shí)枝狀枝孢菌生物量較大，其次是乳糖，分別比對(duì)照顯著提高41.1%和18.3%(P<0.05)。所以枝狀枝孢菌固體培養(yǎng)時(shí)適宜的碳源是乳糖、山梨醇、葡萄糖和甘露醇，液體培養(yǎng)時(shí)適宜的碳源是可溶性淀粉和乳糖。

圖 1　固體培養(yǎng)時(shí)不同碳源對(duì)4種DSE生長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示各碳源處理間差異顯著(P<0.05)，表2同。

Note:Different letters in each column indicate significant difference (P<0.05).The same for Table 2.

2.2不同氮源對(duì)4種DSE生長(zhǎng)的影響

4種DSE都能利用供試的10種氮源，說明它們可利用的氮源范圍比較廣。10種氮源對(duì)4種DSE生長(zhǎng)的影響結(jié)果見圖2和表2。

圖 2　固體培養(yǎng)時(shí)不同氮源對(duì)4種DSE生長(zhǎng)的影響

2.2.1對(duì)沙門外瓶柄霉生長(zhǎng)的影響由圖2知，固體培養(yǎng)條件下，以硝酸鈉為氮源時(shí)沙門外瓶柄霉平均生長(zhǎng)速度較快，其次是尿素和蛋白胨，三者分別比對(duì)照顯著提高26.1%，13.0%和12.3%(P<0.05)；以硝酸鈉為氮源時(shí)沙門外瓶柄霉生物量較大，其次是蛋白胨、尿素和胰蛋白胨，其分別比對(duì)照顯著提高76.4%，59.1%，42.3%和41.2%(P<0.05)。由表2可知，液體培養(yǎng)條件下，以磷酸氫二銨、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)沙門外瓶柄霉生物量較大且與其他氮源差異顯著(P<0.05)，說明沙門外瓶柄霉對(duì)它們的利用較其他氮源好。所以沙門外瓶柄霉固體培養(yǎng)時(shí)適宜的氮源是硝酸鈉、蛋白胨、尿素和胰蛋白胨，液體培養(yǎng)時(shí)適宜的氮源是磷酸氫二銨、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨和硝酸鈉。

2.2.2對(duì)甘瓶霉生長(zhǎng)的影響由圖2知，固體培養(yǎng)條件下，以硝酸鈉為氮源時(shí)甘瓶霉平均生長(zhǎng)速度較快，其次是蛋白胨，分別比對(duì)照顯著提高61.3%和41.9%(P<0.05)；以硝酸鈉為氮源時(shí)甘瓶霉生物量較大，其次是硝酸銨、胰蛋白胨和蛋白胨，分別比對(duì)照顯著提高76.9%，65.4%，60.7%和56.3%(P<0.05)。由表2可知，液體培養(yǎng)條件下，以草酸銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨和氯化銨為氮源時(shí)甘瓶霉生物量顯著高于其他氮源，分別比對(duì)照顯著提高118.8%，109.7%，96.6%，93.4%和83.9%(P<0.05)。所以固體培養(yǎng)時(shí)甘瓶霉適宜的氮源是硝酸鈉、硝酸銨、胰蛋白胨和蛋白胨，液體培養(yǎng)時(shí)適宜的氮源是草酸銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨和氯化銨。

2.2.3對(duì)菊異莖點(diǎn)霉生長(zhǎng)的影響由圖2知，固體培養(yǎng)條件下，以硝酸鈉為氮源時(shí)菊異莖點(diǎn)霉平均生長(zhǎng)速度較快，其次是胰蛋白胨和蛋白胨，分別比對(duì)照顯著提高124.3%，77.1%和74.3%(P<0.05)；以胰蛋白胨為氮源時(shí)菊異莖點(diǎn)霉生物量較大，其次是蛋白胨，分別比對(duì)照顯著提高86.0%和75.6%(P<0.05)。由表2可知，液體培養(yǎng)條件下，以蛋白胨和胰蛋白胨為氮源時(shí)菊異莖點(diǎn)霉生物量較大，分別比對(duì)照顯著提高41.7%和24.1%(P<0.05)。所以菊異莖點(diǎn)霉固體和液體培養(yǎng)時(shí)適宜的氮源均是蛋白胨和胰蛋白胨。

2.2.4對(duì)枝狀枝孢菌生長(zhǎng)的影響由圖2知，固體培養(yǎng)條件下，以硝酸鈉為氮源時(shí)枝狀枝孢菌平均生長(zhǎng)速度較快，其次是胰蛋白胨和蛋白胨，分別比對(duì)照顯著提高130.8%，117.9%和113.8%(P<0.05)；以硝酸鈉為氮源時(shí)枝狀枝孢菌生物量較大，其次是胰蛋白胨，分別比對(duì)照顯著提高83.8%和60.6%(P<0.05)。由表2可知，液體培養(yǎng)條件下，以硝酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)枝狀枝孢菌生物量較大，分別比對(duì)照顯著提高52.0%和50.3%(P<0.05)。所以枝狀枝孢菌固體培養(yǎng)時(shí)適宜的氮源是硝酸鈉和胰蛋白胨，液體培養(yǎng)時(shí)適宜的氮源是硝酸銨和硝酸鈉。

3討論

碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)繁殖、維持正常代謝必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。碳源是微生物細(xì)胞骨架構(gòu)建的主要物質(zhì)和生命活動(dòng)所需能源的提供者，而氮源則是微生物用來進(jìn)行核酸、蛋白質(zhì)、酶類以及含氮代謝產(chǎn)物合成的物質(zhì)[13]。由于不同菌種產(chǎn)生的酶的種類、活性存在差異，導(dǎo)致其代謝能力不同，因此對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用存在差異，如Xylariasp.Strain R006[14]和Paecilomycesjaponic[15]的最佳碳氮源均是葡萄糖與酵母浸膏，Lignosusrhinocerus[16]和Agaricusblazei[17]的最佳碳氮源分別是葡萄糖與硝酸鉀、淀粉與酵母浸膏。本研究中4種DSE的最適碳氮源也不同。

氮源可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮，本研究中菊異莖點(diǎn)霉對(duì)有機(jī)氮的利用相對(duì)無機(jī)氮好，與Ramesh等[14]對(duì)Xylariasp. Strain R006和Lee等[15]對(duì)Paecilomycesjaponic的研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮營(yíng)養(yǎng)豐富且成分復(fù)雜，除含有氮素外還含有其他生長(zhǎng)因子，更有利于微生物的生長(zhǎng)。然而，沙門外瓶柄霉、甘瓶霉和枝狀枝孢菌對(duì)無機(jī)氮的利用相對(duì)優(yōu)于有機(jī)氮，這與Adour等[18]的研究結(jié)果一致，原因可能是無機(jī)氮比有機(jī)態(tài)氮更能促使微生物產(chǎn)生并積累一些代謝產(chǎn)物。

同一菌種在不同培養(yǎng)條件下的最佳碳氮源可能不同，如王美琴等[19]發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)條件下，曲霉菌和白僵菌的最佳氮源分別是生物素和谷氨酸，而液體培養(yǎng)時(shí)它們的最佳氮源分別是天門冬氨酸和生物素。本研究結(jié)果表明，同種DSE菌種在不同培養(yǎng)條件下的最佳碳氮源不同。這可能由多種因素造成，如固體和液體培養(yǎng)基成分的最大不同就是瓊脂，而瓊脂作為最常用的微生物培養(yǎng)基固化劑，具有凝固性和穩(wěn)定性，可與一些物質(zhì)形成絡(luò)合物，可能會(huì)改變固體培養(yǎng)基中碳源和氮源的存在形態(tài)，從而影響微生物對(duì)碳源和氮源的利用。此外，固體和液體培養(yǎng)條件下，微生物的代謝狀態(tài)、水分、氧氣、pH等都有所不同，這些也有可能使DSE對(duì)養(yǎng)分的利用情況發(fā)生變化。

4結(jié)論

不同DSE菌種在固體和液體培養(yǎng)條件下的最適碳源、氮源有異同。固體培養(yǎng)時(shí)，4種DSE都能很好地利用葡萄糖，沙門外瓶柄霉和甘瓶霉還能較好地利用麥芽糖，菊異莖點(diǎn)霉和枝狀枝孢菌還能較好地利用乳糖；可溶性淀粉不適宜作為沙門外瓶柄霉的碳源，蔗糖和山梨醇不適宜作為甘瓶霉的碳源，果糖不適宜作為菊異莖點(diǎn)霉和枝狀枝孢菌的碳源。沙門外瓶柄霉和甘瓶霉都能很好地利用硝酸鈉，而菊異莖點(diǎn)霉對(duì)胰蛋白胨的利用最好，草酸銨、硫酸銨和氯化銨不適宜作為4種DSE的氮源。

液體培養(yǎng)時(shí)，沙門外瓶柄霉對(duì)葡萄糖的利用優(yōu)于其他碳源，而甘瓶霉和菊異莖點(diǎn)霉都能很好地利用可溶性淀粉，乳糖和可溶性淀粉不適宜作沙門外瓶柄霉的碳源，山梨醇不適宜作甘瓶霉的碳源，果糖不適宜作菊異莖點(diǎn)霉和枝狀枝孢菌的碳源；除菊異莖點(diǎn)霉對(duì)有機(jī)氮的利用優(yōu)于無機(jī)氮外，其他3種DSE對(duì)無機(jī)氮源銨鹽的利用比有機(jī)氮好，蛋白胨和胰蛋白胨不宜作沙門外瓶柄霉和甘瓶霉的氮源，硫酸銨、氯化銨、草酸銨、尿素不宜作菊異莖點(diǎn)霉和枝狀枝孢菌的氮源。

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Effects of different carbon and nitrogen sources on growth of 4 dark septate endophytes

SONG Ying-yinga,HUANG Lia,TANG Mingb

(aCollegeofLifeSciences,bCollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The objective of this research was to understand the effect of different carbon and nitrogen sources on the growth of 4 dark septate endophytes,and find the optimum carbon and nitrogen sources.The results will provide basis for further study and application of dark septate endophytes.【Method】 Exophiala salmonis,Phialophora mustea,Paraphoma chrysanthemicola and Cladosporium cladosporioides were cultured in both solid and liquid medium to study the effects of different carbon (glucose,sucrose,maltose,mannitol,fructose,lactose,soluble starch,and sorbitol) and nitrogen (diammonium phosphate,ammonium oxalate,ammonium sulfate,ammonium chloride,urea,ammonium nitrate,sodium nitrate,acid hydrolyzed casein,tryptone,and peptone) sources on average growth rate and biomass.【Result】 Under solid culture condition,the optimum carbon source was glucose for all endophytes except C.cladosporioides,which showed the highest growth on lactose.The optimum nitrogen source of P.chrysanthemicola was tryptone,while the optimum nitrogen source of all others was sodium nitrate.Under submerged culture condition,the optimum carbon source of E.salmonis was glucose,while the optimum carbon source of all others was soluble starch.The optimum nitrogen source of E.salmonis,P.mustea,P.chrysanthemicola and C.cladosporioides was diammonium phosphate,ammonium oxalate,peptone,and ammonium nitrate,respectively.【Conclusion】 The nutritional cultivating conditions of 4 dark septate endophytes were determined.

Key words:dark septate endophytes;carbon source;nitrogen source

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.025

[收稿日期]2014-07-16

[基金項(xiàng)目]林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404217)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170567，31270639)；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT1035)

[作者簡(jiǎn)介]宋瑛瑛(1988-)，女，甘肅天水人，在讀碩士，主要從事微生物研究。E-mail：songyingying1988@126.com[通信作者]唐明(1962-)，女，安徽渦陽(yáng)人，教授，主要從事微生物學(xué)和森林保護(hù)學(xué)研究。E-mail：tangmingyl@163.com

[中圖分類號(hào)]Q938.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)03-0181-07