孫鵬，尹海波，常成棟，賈曉晴，邵飛

（1.沈陽市第七人民醫(yī)院 藥劑科，遼寧 沈陽 110003；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica Maknio)的干燥根莖，又稱為穿地龍、穿龍骨、地龍骨、常山等[1]。被收載于2015年版中國藥典一部[2]。穿山龍中的甾體皂苷已經(jīng)成為甾體類激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的重要原料[3]，其總皂苷在改善冠脈循環(huán)、抗動脈粥樣硬化、預(yù)防心血管疾病等方面具有較強(qiáng)的藥理活性。同時多糖（polysaccharide）類成分具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、提高免疫力作用[4]。

貪婪算法（greedy method）是一種采用逐步構(gòu)造最優(yōu)解的方法。在每個階段中都要作出一個看上去最優(yōu)的決策（在一定的標(biāo)準(zhǔn)下），決策一旦作出，就不可再更改。作出貪婪決策的依據(jù)稱為貪婪準(zhǔn)則（greedy criterion）。研究發(fā)現(xiàn)該方法對藥材有效成分提取率的提高具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)應(yīng)用于穿山龍藥材提取的方式是回流提取，大量文獻(xiàn)資料顯示超聲對于中藥多糖物質(zhì)、皂苷類物質(zhì)的提取具有促進(jìn)作用。有人認(rèn)為由于穿山龍飲片較堅(jiān)硬，植物細(xì)胞不易破碎，用超聲波法只能低限度地提取其中多糖，導(dǎo)致產(chǎn)品的獲得率和純度偏低[5-8]。本文依據(jù)貪婪算法，將超聲處理引入到穿山龍活性成分的提取中，改進(jìn)現(xiàn)有的提取方法，實(shí)驗(yàn)通過不同提取方式的對比加以驗(yàn)證并結(jié)合顯微觀察和植物學(xué)中的相關(guān)知識提出低功率下超聲提取的動力模型，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探究了超聲強(qiáng)化回流提取應(yīng)用在穿山龍活性成分提取中的理論依據(jù)。

1　貪婪算法

考察時間對兩種活性成分提取率的影響，選取7個時間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1，2。權(quán)重法處理得到貪婪算法的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3。對比每個時間段的數(shù)據(jù)，依據(jù)貪婪算法思路獲得：先進(jìn)行超聲處15 min后改為回流提取的超聲強(qiáng)化回流提取法為最佳提取方式。

表1　提取時間與多糖提取率的關(guān)系(n=7)

表2　提取時間與總皂苷提取率的關(guān)系(n=7)

表3　不同提取方法的提取率的變化加權(quán)值與時間

2　材料與方法

2.1　實(shí)驗(yàn)材料

穿山龍采自吉林省撫順清原南山城鎮(zhèn)，藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷（Dioscorea nipponica Makino）的干燥根莖，標(biāo)本保存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室。

2.2　儀器試劑

儀器：紫外可見分光光度計(jì) (UV24802型)、CP225D電子天平(德國Sartorius公司)、顯微鏡、超聲儀、恒溫水浴鍋、250 mL容量瓶、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

試劑：葡萄糖、濃硫酸、苯酚、高氯酸、乙醇(95%)、無水乙醇、氯仿等皆為分析純，重蒸水。

2.3　線性關(guān)系考察

2.3.1多糖線性范圍

干燥葡萄糖粉末至恒重，精密稱取26.81 mg，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，5，10，15，20，25 mL 至 100 mL 容量瓶中稀釋，取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL分別置于試管中顯色，495 nm處測定其吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=9.391×10-3X-3.571×10-2，相關(guān)系數(shù) r=0.9994，線性范圍為 13.46～67.24μg。

2.3.2總皂苷線性范圍

精密稱取薯蕷皂苷元對照品4.14 mg，配制成0.1656 mg/mL對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL，揮干，顯色，置25℃水浴保溫25 min。以高氯酸為空白，在409 nm處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，總皂苷含量X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程Y=18.013×10-3X+1.4322×10-3，相關(guān)系數(shù) r=0.9999，線性范圍為 8.28μg～66.24μg。

2.4　供試品溶液的制備

依據(jù)貪婪算法中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，按照不同的實(shí)驗(yàn)方法對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行編號。實(shí)驗(yàn)Ⅰ：回流提取法（在90℃回流提取2 h的回流提?。?；實(shí)驗(yàn)Ⅱ：超聲提取法（室溫恒溫超聲提取30 min）；實(shí)驗(yàn)Ⅲ：超聲強(qiáng)化回流提?。ㄏ仁覝爻曁崛?5 min再90℃回流提取1 h）；實(shí)驗(yàn)Ⅳ：回流輔助超聲提?。ㄏ?0℃回流提取1 h再室溫超聲提取15 min）；實(shí)驗(yàn)Ⅴ：耦合提取（回流提取裝置于90℃超聲場中進(jìn)行提?。?。

2.4.1多糖供試品制備

精密稱取穿山龍藥材粉末3.0 g（過40目篩），20倍體積75%乙醇，于150 mL圓底燒瓶中。分別采用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ進(jìn)行提取，過濾，殘?jiān)?5%乙醇10 mL洗滌2次，合并提取液和洗液，蒸干，測得浸膏質(zhì)量。加適量體積蒸餾水加熱溶解，過濾，殘?jiān)?0 mL蒸餾水洗滌2次，濾液于250 mL量瓶中定容。

2.4.2總皂苷供試品的制備

精密稱取藥材粉末3.0 g(過40目篩)，20倍體積75%乙醇置150 mL圓底燒瓶中，分別采用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ進(jìn)行提取，分別進(jìn)行濾過，揮去溶劑，加一定量的濃度硫酸，超聲處理3 min（促進(jìn)溶解），加熱回流，放冷，置分液漏斗中，再加三氯甲烷20 mL，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，用NaOH溶液洗至中性，減壓回收溶劑至干。殘?jiān)訜o水乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5　含量與提取率的測定

2.5.1穿山龍多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法，吸取供試品溶液1.0 mL置25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。精密吸取1.0 mL至試管中，加1.0 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加5.0 mL濃硫酸，搖勻后反應(yīng) 15 min，置冷水中冷卻10 min，同時用 1.0 mL蒸餾水進(jìn)行平行操作作空白，在波長 495 nm處測定吸光度。

多糖提取率計(jì)算如下：

2.5.2穿山龍總皂苷含量測定

精密吸取0.05 mL供試品溶液于10 mL比色管中，揮干溶劑，加高氯酸5 mL，置25℃水浴中保溫25 min，取出冷卻至室溫，以高氯酸為空白對照，測定吸光度，計(jì)算供試品中總皂苷提取率。

2.6　顯微觀察

從原藥材粉末經(jīng)5種不同提取方法提取后的粉末殘?jiān)腥〕鰧?shí)驗(yàn)所用樣品，分別標(biāo)記為A，B，C，D，E，F(xiàn)；取原藥材粉末（標(biāo)記為G）進(jìn)行對照觀察。同時用5點(diǎn)取樣法分別在6類樣品中進(jìn)行取樣，每點(diǎn)精取 1.00 g， 標(biāo) 記 為 Xi（X=A，B，C，D，E，F(xiàn)，G；i=1，2，3，4，5）分別過 80 目篩，稱取所得粉末質(zhì)量。將過篩后所得粉末用水合氯醛裝片進(jìn)行顯微觀察。

3　結(jié)果與分析

3.1　化學(xué)分析結(jié)果(表4)

表4　理化試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.2　顯微實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1視覺觀察

發(fā)現(xiàn)超聲強(qiáng)化回流提取的殘?jiān)形⒓?xì)粉末最多。不同方法提取后的殘?jiān)^原粉末細(xì)微顆粒均有不同程度增加（圖1）。

3.2.2顯微觀察

觀察發(fā)現(xiàn)，幾種提取方法所得粉末殘?jiān)屑?xì)胞的破碎程度不同，以超聲強(qiáng)化回流提取的細(xì)胞破碎程度最為嚴(yán)重。低功率超聲提取的殘?jiān)谐善瑺畲嬖诘谋”诩?xì)胞團(tuán)數(shù)目與原藥材粉末無顯著差異，其它提取方法粉末殘?jiān)谐善嬖诘谋”诩?xì)胞團(tuán)數(shù)目基本多于5個，而超聲強(qiáng)化回流提取的殘?jiān)谐善瑺畲嬖诘谋”诩?xì)胞團(tuán)較少，成片狀存在的薄壁細(xì)胞團(tuán)多數(shù)情況下不足5個。說明超聲提取和回流提取的破壁效果都不太理想；超聲強(qiáng)化回流提取對粉末顆粒的破壁效果最明顯（圖2）。

圖1　幾種方法粉末殘?jiān)庇^圖A回流提取的粉末殘?jiān)?；B超聲提取的粉末殘?jiān)?；C超聲強(qiáng)化回流提取的粉末殘?jiān)?；D回流輔助超聲提取的粉末殘?jiān)?；E超聲耦合回流提取粉末；F原藥材粉末

圖2　幾種方法粉末殘?jiān)@微圖A回流提取的粉末殘?jiān)衅?；B超聲提取的粉末殘?jiān)衅?；C超聲強(qiáng)化回流提取的粉末殘?jiān)衅?；D回流輔助超聲提取的粉末殘?jiān)衅?；E超聲耦合回流提取的粉末切片；F原藥材粉末切片

3.2.3定量分析

定量分析結(jié)果顯示超聲強(qiáng)化回流提取的殘?jiān)锌蛇^80目篩的粉末重量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他提取方法，超聲強(qiáng)化回流提取的粉末殘?jiān)蓄w粒較細(xì)（圖3）。

4.提取模型建立及驗(yàn)證

圖3　不同提取方法破壁率定量示意圖

σ0為超聲前的顆粒力度，t為提取時間，為常量則低功率超聲條件下的中草藥浸提模型為：

對于確定的藥材，α，β均為常數(shù)，K為二階浸出速率常數(shù) g·(mL·min)-1。

低功率超聲提取與回流提取交叉應(yīng)用的提取模型為：

x，y為矢量，與提取條件有關(guān)，x≥y與x＜y可表示不同的提取方式：x≥y表示優(yōu)先進(jìn)行超聲處理，x＜y表示優(yōu)先進(jìn)行回流處理；z為標(biāo)量，與藥材、目標(biāo)成分等的性質(zhì)有關(guān)。

D為擴(kuò)散系數(shù)，與擴(kuò)散體系的物質(zhì)性質(zhì)、溫度以及擴(kuò)散面處的物質(zhì)濃度等因素有關(guān)。

ca為溶出飽和度，即飽和時該有效成分的濃度g·mL-1；c1為t時間溶液中該有效成分濃度g·mL-1。顆粒數(shù)目ω、溶劑的倍量M。

將表4中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入交叉提取模型中均出現(xiàn)：當(dāng)存在x＞y時可以得到函數(shù)的最優(yōu)解集。

因此對于穿山龍活性成分提取的最佳提取方式為超聲強(qiáng)化回流提取。

5　實(shí)驗(yàn)結(jié)果解析

理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在對穿山龍活性成分提取中超聲強(qiáng)化回流提取在明顯縮短了提取時間的同時，又明顯提高了活性成分提取率，超聲強(qiáng)化回流的提取效果優(yōu)于其他提取方法。

顯微實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲強(qiáng)化回流提取的破壁率明顯高于其余提取方法，為模型建立時的理論基礎(chǔ)提供了事實(shí)依據(jù)，證實(shí)了低功率超聲提取模型的理論解釋的正確性，進(jìn)一步證實(shí)了貪婪算法應(yīng)用于藥材提取優(yōu)化改良的可行性和合理性。

6　討論

加熱條件下不均勻介質(zhì)中的聲場會發(fā)生畸形變化，而畸形聲場的存在使得現(xiàn)有的超聲提取的動力學(xué)模型存在著很大的不足，對于提取方案按照NPC(non-deterministic polynomial complete)問題探究及以此建立的提取模型尚處于初級研究階段；且中藥中的植物藥材的個體差異很大，暫無法對低功率超聲強(qiáng)化回流提取的基本模型進(jìn)一步優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)以貪婪算法為指導(dǎo)以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合顯微觀察建立了新的提取模型理論，完成了低功率超聲強(qiáng)化回流提取方法的初步研究，實(shí)現(xiàn)了對傳統(tǒng)提取方式的改良優(yōu)化，證實(shí)了貪婪算法在藥材提取中應(yīng)用的合理性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與所建立的低功率超聲提取模型計(jì)算結(jié)果以及貪婪算法的預(yù)測結(jié)果一致，模型作為提取動力學(xué)機(jī)理的拓展具有實(shí)際意義。超聲強(qiáng)化回流提取，對穿山龍活性成分提取效果好于單一的回流提取，且提取時間短提取效率高，破壁率遠(yuǎn)好于單一的回流提取法。在穿山龍活性成分提取中超聲強(qiáng)化回流提取是一種新的綠色高效的提取方法。貪婪算法在藥材提取優(yōu)化改良中具有可行性。