焦培培，郭艷麗，牛愛華，亢曉峰

西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點實驗室，西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710127

人血清白蛋白微/納米管的制備及影響因素

焦培培，郭艷麗*，牛愛華，亢曉峰*

西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點實驗室，西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710127

以聚碳酸酯(polycarbonate，PC)為模板，聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)為連接劑，采用靜電層層自組裝技術(shù)制備了人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)微米管和納米管，討論了溶液pH、離子強度、組裝層數(shù)、沉淀清洗次數(shù)和模板孔徑對組裝效果的影響。利用掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)和X射線能譜儀(EDS)對蛋白質(zhì)微/納米管的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，溶液pH和離子強度是影響組裝效果的關(guān)鍵因素，在HSA和PEI溶液pH分別為7.4和10.3，且PEI溶液不含NaCl的條件下組裝得到的微/納米管具有良好的中空開口管狀結(jié)構(gòu)；微/納米管的外徑由模板孔徑?jīng)Q定；調(diào)節(jié)組裝層數(shù)可控制管壁厚度，且組裝層數(shù)越多，管壁越厚，由此可實現(xiàn)對微/納米管內(nèi)徑大小的調(diào)控；為保證管狀結(jié)構(gòu)的完整性，避免較薄的管壁在模板溶解和真空干燥過程中造成破壞，PEI/HSA雙分子層數(shù)應(yīng)不少于3；采用極性胺基溶劑N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide, DMF)可較好地溶解PC模板從而釋放管狀物。

蛋白質(zhì)微/納米管；層層自組裝；模板

引 言

蛋白質(zhì)納米管是以蛋白質(zhì)為主要材質(zhì)的納米材料。與蛋白質(zhì)修飾的無機納米管如碳納米管[1]、二氧化硅納米管[2]和磁性納米管[3]相比，蛋白質(zhì)納米管具有良好的生物活性、生物相容性、易于降解、易于改性和修飾等特點，在生物分離[4-5]、生物催化[6-7]和藥物傳遞[8]等領(lǐng)域有著獨特優(yōu)勢。目前制備方法主要是將納米多孔模板與層層自組裝技術(shù)相結(jié)合，制得的管狀物外徑在200 ～800 nm之間[9]，而外徑在微米級的蛋白質(zhì)微米管還未見文獻(xiàn)報道。微米管通常比納米管具有更好的力學(xué)性能和單分散性，可借助于目前的微米操作技術(shù)對其進(jìn)行單個操作。蛋白質(zhì)微米管在生物組織的穿刺、細(xì)胞的提取、分離和生物芯片輸運等方面有著潛在的應(yīng)用前景[10]。

人血清白蛋白(HSA，pI=4.7)是人體血漿中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，具有運輸內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)的作用和維持細(xì)胞外pH、滲透壓的功能。由于水溶性好、穩(wěn)定性強、制備產(chǎn)量大和純度高，它是理想的蛋白質(zhì)模型分子。聚乙烯亞胺是一種聚陽離子電解質(zhì)，在靜電層層自組裝中常被用作分子層間的連接劑[11]。在蛋白質(zhì)納米管制備技術(shù)基礎(chǔ)上，對組裝條件如溶液pH、離子強度、組裝層數(shù)、沉淀清洗次數(shù)和模板孔徑進(jìn)行詳細(xì)討論和優(yōu)化，制得具有良好管狀結(jié)構(gòu)的PEI/HSA微米管和納米管，并利用SEM，TEM，F(xiàn)TIR和EDS對產(chǎn)物形態(tài)和組成進(jìn)行表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ZetaPALS型Zeta電位與粒徑分析儀(BIC公司，美國)；E1010型離子濺射儀(Hitachi公司，日本)；JSM-6390A型掃描電子顯微鏡(JEOL公司，日本)；H-600投射式電子顯微鏡(Hitachi公司，日本)；LSP02-1B型注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；FD-1C-50型冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；聚乙烯亞胺PEI(Mw=750 000，50%(w/vin water)，Sigma公司)；人血清白蛋白HSA(96%～99%，sigma公司)；聚碳酸酯膜PC(周長25 mm，孔徑0.4和3 μm，Whatman公司)；N,N-二甲基甲酰胺DMF(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；PB緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH 7.4)；實驗用水均為18.2 MΩ·cm-1的超純水。

1.2 人血清白蛋白微/納米管的制備

采用層層自組裝技術(shù)制備PEI/HSA微/納米管[5]，并做了部分修改。首先將PC膜放置在過濾頭內(nèi)固定好。利用注射泵將12 mL 1 mg·mL-1PEI溶液以0.25 mL·min-1的速度流過PC膜，然后用12 mL 超純水以1 mL·min-1的流速沖洗，氮氣吹干；再將12 mL 2 mg·mL-1的HSA溶液以0.5 mL·min-1的速度流過已組裝PEI層的PC膜，用12 mL 超純水以1 mL·min-1的流速沖洗，氮氣吹干。每完成一層組裝，用蘸濕的棉簽輕輕擦拭膜表面以除去吸附的PEI和HSA。根據(jù)需要選擇重復(fù)組裝PEI和HSA的次數(shù)。將組裝好的PC膜真空干燥12 h(0.09 MPa)后，浸入DMF以除去模板，所得沉淀物用DMF清洗，冷凍干燥(-60 ℃，<20 Pa)后得到粉末狀固體。

1.3 PEI/HSA微/納米管的表征

用3%磷鎢酸對樣品分散液負(fù)染后進(jìn)行TEM分析；冷凍干燥樣品用離子濺射儀鍍金膜后用于SEM和EDS分析；使用KBr壓片進(jìn)行FTIR分析(其中PEI預(yù)先真空干燥24 h)。

2 結(jié)果與討論

2.1 組裝溶液pH的選擇

PEI/HSA微/納米管的制備是利用靜電層層自組裝技術(shù)將帶正電的PEI和帶負(fù)電的HSA依次交替沉積至PC膜的微/納米孔洞內(nèi)壁。在此過程中，帶負(fù)電的HSA吸附至已組裝顯正電的PEI層，使得形成的PEI/HSA復(fù)合膜電性反轉(zhuǎn)而帶負(fù)電，從而利于后續(xù)正電PEI的吸附，因此要求PEI和HSA電量相互匹配。Dobrynin等[12]對納米孔洞內(nèi)的LbL組裝進(jìn)行了計算機動態(tài)模擬，認(rèn)為對于聚電解質(zhì)-納米顆粒(N-P)體系，過電荷分?jǐn)?shù)約為0.5，即被吸附物一半的電荷用于中和上一層膜的過電荷，另一半則用于形成新組裝膜的過電荷，這對于實驗選擇電荷量匹配的聚電解質(zhì)起到了借鑒作用。

實驗中，HSA和PEI的電荷量可用zeta電位表示。如圖1(a)所示，HSA的zeta電位受溶液pH影響，當(dāng)溶液pH<4.7時，HSA分子帶正電；當(dāng)溶液pH>4.7時，HSA分子帶負(fù)電。實驗中選擇HSA溶液的pH為7.4，此時zeta電位為(-15.0±2.8) mV。

弱聚電解質(zhì)PEI的離子化程度可通過溶液pH調(diào)節(jié)[13]。如圖1(b)所示，在pH<11時其分子帶正電，隨著pH減小，PEI鏈上的胺基基團質(zhì)子化程度增加，zeta電位增大；當(dāng)質(zhì)子化完全時(pH～8)，隨著pH繼續(xù)減小，引起溶液的離子強度增大，導(dǎo)致相鄰帶電基團間的屏蔽作用增強，測得的zeta電位值反而減小。為與HSA的電荷量相匹配，實驗中選擇PEI的zeta電位為(17.6±3.3)mV，溶液pH為10.3。

2.2 離子強度的影響

弱聚電解質(zhì)構(gòu)型受溶液pH和離子強度的影響，從而影響其在模板的吸附情況。當(dāng)溶液中不含NaCl時，PEI的離子化程度僅由pH控制，此時，由于鏈上相鄰帶電基團的排斥作用，呈伸展鏈狀構(gòu)型；當(dāng)溶液離子強度增加，電荷屏蔽作用增強，相鄰帶電基團間的靜電排斥作用減弱，呈緊密線團構(gòu)型[13]。實驗中發(fā)現(xiàn)，PEI溶液中不含NaCl時的組裝效果好于加入時的組裝效果，推測可能是由于呈伸展鏈狀的枝狀(branched)PEI能更有效地連接球狀HSA分子。

Fig.1 pH dependent zeta potential of 2 mg·mL-1HSA (a) and 1 mg·mL-1 PEI (b)

2.3 組裝層數(shù)的影響

圖2為不同組裝層數(shù)HSA微米管的SEM圖?？梢钥吹?PEI/HSA)3微米管的管壁較薄、表面粗糙且管狀結(jié)構(gòu)不完整[圖2(a)]。相比較而言，(PEI/HSA)5PEI微米管的管壁較厚、表面光滑且管狀結(jié)構(gòu)完整[圖2(b)]。因此，通過改變組裝層數(shù)可以控制管壁的厚度，且隨著組裝層數(shù)增加，壁厚增加。為保證管狀結(jié)構(gòu)的完整性，避免較薄的管壁在模板溶解和真空干燥條件下造成破壞，PEI/HSA雙分子層數(shù)應(yīng)不少于3。

2.4 沉淀清洗次數(shù)的影響

在微/納米管的制備過程中，組裝好的(PEI/HSA)5PEI聚電解質(zhì)多層膜最初以吸附在PC膜微/納米孔洞內(nèi)壁的形式存在，因此選擇合適的手段除去模板釋放(PEI/HSA)5PEI十分重要。實驗中利用極性胺基溶劑DMF溶解PC模板。如圖3所示，DMF清洗沉淀物的次數(shù)影響管狀物的釋放效果。當(dāng)清洗3次時，(PEI/HSA)5PEI仍嵌入在PC模板并未完全釋放[(圖3(a)]；當(dāng)增至5次，(PEI/HSA)5PEI已基本釋放完全[圖3(b)]。因此，DMF清洗沉淀的次數(shù)應(yīng)在5次以上。

Fig.2 SEM images of (PEI/HSA)3micronotubes (a) and (PEI/HSA)5PEI microtubes (b) prepared by depositing PEI and HSA for 3 and 5.5 cycles into 3 μm PC template, respectively)

Fig.3 SEM images of partially released (a) and fully released (b)(PEI/HSA)5PEI microtubes (PC template pore diameter, 3 μm)

2.5 模板孔徑的影響

圖4所示為(PEI/HSA)5PEI微米管和納米管的SEM圖，均可以看到結(jié)構(gòu)良好的中空管狀結(jié)構(gòu)。測得微米管[圖4(a)]的外徑和管長分別為(3.08±0.15)和(8.48±0.83)μm，與3 μm PC模板的孔徑(3.02±0.44)μm和厚度(6～11 μm)相符；納米管[圖4(b)]的外徑、內(nèi)徑和壁厚分別為(455±13), (234±10)和(151±7)nm，其中外徑與400 nm PC模板的孔徑(458±18)nm相吻合。(PEI/HSA)5PEI的管壁可被認(rèn)為是由11個分子層組成的空心圓柱模型，其中HSA層為單個HSA分子的厚度。根據(jù)單晶結(jié)構(gòu)[14]和小角度X射線衍射[15]分析得到的HSA分子大小為8.0 nm。由納米管的壁厚和HSA的大小可計算得到PEI層的厚度為18.5 nm，該值與納米多孔模板內(nèi)LbL組裝的聚電解質(zhì)膜的厚度相吻合[5]。

Fig.4 SEM images of (PEI/HSA)5PEI microtubes (a) and (PEI/HSA)5PEI nanotubes (b) prepared by using PC template with 3 μm and 400 nm pore diameter, respectively

2.6 TEM，F(xiàn)TIR和EDS表征結(jié)果

圖5(a)所示為(PEI/HSA)5PEI納米管的TEM圖，可以看到單個的管狀結(jié)構(gòu)，測得管長約(5.6±0.9)μm，和PC模板的厚度6 μm相近。

元素分析結(jié)果進(jìn)一步說明了納米管的成分。如圖5(c)所示，構(gòu)成(PEI/HSA)5PEI納米管的主要元素有C，N，O和S，說明HSA和PEI被組裝在納米管管壁。

3 結(jié) 論

利用模板與層層自組裝技術(shù)相結(jié)合成功地制備了人血清白蛋白微米管和納米管，討論了溶液pH、離子強度、組裝層數(shù)、沉淀清洗次數(shù)和模板孔徑對管狀結(jié)構(gòu)的影響，并通過SEM，TEM，F(xiàn)TIR和EDS手段表征了其形態(tài)和組成。結(jié)果表明，在HSA和PEI溶液pH分別為7.4和10.3，且PEI溶液不含NaCl的條件下組裝得到的微/納米管具有良好的管狀結(jié)構(gòu)；調(diào)節(jié)組裝層數(shù)可控制管壁厚度，且組裝層數(shù)越多，管壁越厚，由此可實現(xiàn)對微/納米管內(nèi)徑大小的調(diào)控；模板孔徑?jīng)Q定了微/納米管的外徑。

Fig.5 (a) TEM image of (PEI/HSA)5PEI nanotube (PC template pore diameter, 400 nm) (b) FTIR spectra of (PEI/HSA)5PEI nanotubes, PEI and HSA (c) EDS spectra of (PEI/HSA)5PEI nanotubes. The inset is the elemental percentage

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*Corresponding authors

Preparation of Human Serum Albumin Micro/Nanotubes

JIAO Pei-pei, GUO Yan-li*, NIU Ai-hua, KANG Xiao-feng*

Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecular Chemistry, College of Chemistry & Materials Science, Northwest University, Xi’an 710127，China

In this research, protein micro/nanotubes were fabricated by alternate layer-by-layer (LbL) assembly of human serum albumin (HSA) and polyethyleneimine (PEI) into polycarbonate (PC) membranes. The experimental conditions of pH values, ionic strength, the depositions cycles and the diameter of porous membrane were discussed. The morphology and composition of tubes were characterized by scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM), fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and energy dispersive spectroscopy (EDS). The results show that pH and ionic strength of the solution are the key factors that influence the effect of assembly. Micro/nanotubes with good opening hollow tubular structure were obtained when pH 7.4 HSA solution and pH 10.3 PEI solution without NaCl were used in synthesis procedure. The outer diameter of tube was dependent on the PC template, thus the micro/nanotubes size was controlled by the wall thickness, which can be adjusted by the number of layers of the HSA and PEI deposited along the pore walls. To avoid the thin wall being damaged in dissolving the template and vacuum drying, the PEI/HSA bilayer number should not be less than 3. The polar solvent N,N-dimethylformamide (DMF) can dissolve PC template to release the micro/nanotubes.

Protein micro/nanotubes; Layer-by-layer assembly; Template

Mar. 22, 2015; accepted Jul. 16, 2015)

2015-03-22，

2015-07-16

國家自然科學(xué)基金項目(21175105, 21375104，21327806)，陜西省自然科學(xué)基金項目(2014JM2050)，陜西省教育廳專項基金項目(12JK0634)和高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20126101110015)資助

焦培培，女，1989年生，西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院碩士研究生 e-mail：jppme23@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：guoyl@nwu.edu.cn; kangxf@nwu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0191-05