羅 潔，王紫薇，宋君紅，龐瑞鵬，任發(fā)政*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部功能乳品重點實驗室，北京 100083 2. 畜產(chǎn)品北京高等學(xué)校工程研究中心，北京 100083 3. 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100083 4. 秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北 秦皇島 066000

不同品種牛乳脂質(zhì)的共聚焦拉曼光譜指紋圖譜

羅 潔1，王紫薇2，宋君紅3，龐瑞鵬4，任發(fā)政1*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部功能乳品重點實驗室，北京 100083 2. 畜產(chǎn)品北京高等學(xué)校工程研究中心，北京 100083 3. 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100083 4. 秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北 秦皇島 066000

不同品種的乳脂肪球的組成成分不同，從而導(dǎo)致脂肪在乳中的存在形式和最終的乳品品質(zhì)存在差異。利用拉曼光譜測定黑白花牛乳、水牛乳及牦牛乳中脂質(zhì)球的脂質(zhì)和脂肪酸成分，比較不同品種牛乳的脂質(zhì)組成差異。結(jié)果顯示，牦牛乳的2 885/2 850 cm-1比值較高，表明牦牛乳脂質(zhì)球趨于形成結(jié)晶態(tài)脂肪球膜包裹流動態(tài)內(nèi)核的結(jié)構(gòu)。與黑白花牛乳相比，牦牛和水牛乳的1 655/1 443 cm-1比值較高，表明黑白花牛乳的脂肪酸不飽和程度低于其他兩種牛乳；水牛乳小脂肪球的脂肪酸不飽和度高于牦牛乳，大脂肪球的則低于牦牛乳。綜上可知，用牦牛乳分離而得的稀奶油較其他牛乳難熔化，攪拌耗時更長，但形成的黃油更柔軟；而水牛乳由于脂肪球較大，適用于奶油的加工和脂肪球膜的分離。

乳脂肪；品種；共聚焦拉曼光譜；脂質(zhì)成分

引 言

乳脂肪是構(gòu)成牛奶營養(yǎng)、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味特性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對乳品品質(zhì)有著至關(guān)重要的影響。乳中約含有3%～5%的脂肪，以粒徑為0.2～15 μm不等的液滴狀或球狀形式分布于乳中[1]。乳脂肪中含有70%為飽和脂肪酸，25%單不飽和脂肪酸以及5%多不飽和脂肪酸[2]。不同脂肪酸的種類和比例影響乳的理化性質(zhì)及加工特性，進而影響乳制品的品質(zhì)。在干酪制作中，乳脂肪酸的組成影響牛乳的凝固特性[3]。此外，在酸乳等乳制品中，游離脂肪酸是乳風(fēng)味物質(zhì)如甲基酮、醇類、內(nèi)酯等的前體物質(zhì)，因此是產(chǎn)品風(fēng)味的重要貢獻者[4]。

乳脂肪酸的組成及其含量受多種因素影響，其中奶牛品種的影響尤為顯著[5]。研究表明，不同品種牛乳脂肪酸含量差異顯著，單(多)不飽和脂肪酸的種類和比例也存在明顯差異，其中短鏈脂肪酸含量差異不大，中長鏈脂肪酸含量變化差異顯著，而長鏈脂肪酸含量差異極為顯著[6]。黑白花牛乳的總產(chǎn)量位居世界第一，是消費量最大的牛乳。我國的水牛頭數(shù)占世界第二位，同時南方的濕熱氣候也適于水牛業(yè)生產(chǎn)，因此對水牛乳的加工利用具有廣闊的開發(fā)前景；而在高寒缺氧地區(qū)，人類的飲奶、肉、運輸又大部分依賴于牦牛。因此，近年來，水牛乳和牦牛乳的成分組成成為研究熱點。有研究表明，牦牛乳中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比值較低，且共軛亞油酸等功能性脂肪酸含量尤其豐富，因此牦牛乳的營養(yǎng)價值相對其他牛乳更高。水牛乳的乳脂含量高、脂肪球粒徑大，因此特別適合用于制作黃油、奶油和優(yōu)質(zhì)干酪的生產(chǎn)，具有特殊的加工價值[6]。然而，針對牦牛乳和水牛乳脂質(zhì)組成的系統(tǒng)研究尚未闡明。

目前用于測定乳脂質(zhì)組成的方法有很多[7]，包括色譜技術(shù)，如氣相色譜和液相色譜[8]。這些方法包含提取和分離步驟，非常的耗時耗材，不適合大量樣品的同步實時觀測。近年來，拉曼光譜被應(yīng)用至食品分析中，并已成功應(yīng)用于測定無水乳脂肪的固體脂肪含量和牛乳脂肪的共軛亞油酸測定中[9]。拉曼光譜的優(yōu)越性在于不需要任何化學(xué)標(biāo)記手段就可以實現(xiàn)對靜態(tài)樣品的快速檢測。單個脂肪球分子能在天然狀態(tài)下被固定，保持其天然構(gòu)型，同時獲得單個分子的拉曼光譜信號。然而，現(xiàn)有應(yīng)用拉曼光譜分析不同品種牛乳脂肪球成分差異的研究較為缺乏。

利用共聚焦拉曼光譜對黑白花牛乳、水牛乳和牦牛乳中天然脂肪球的脂質(zhì)化學(xué)成分進行測定。通過了解不同品種奶牛的牛乳脂肪球的物化特性，能在制作對產(chǎn)品品質(zhì)及加工性能有特殊需求的乳制品時，為原料乳的選擇提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 樣品制備

新鮮牛乳取自北京三元食品股份有限公司專用原料乳(春山農(nóng)場)，水牛乳取自云南大理州云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司；牦牛乳取自甘南藏族自治州合作市卡加道鄉(xiāng)牧場。所有牛乳取后存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動態(tài)光散射測定

貝克曼Coulter LS230激光衍射粒度分析儀(貝克曼庫爾特，美國)配有4 mW氦/氖激光器在波長633 nm輸出，應(yīng)用動態(tài)光散射的原理測定牛奶樣品中脂肪球的平均粒徑。通過實驗可得到散射光強(I)的自相關(guān)函數(shù)g2(τ,q)

從表2中可以看出，每組數(shù)據(jù)中所包含的粗差數(shù)量并不多，對平均值的影響比較微弱，各組數(shù)據(jù)的數(shù)量不同是因為實際觀測時間長短不同，同一距離處的一組數(shù)據(jù)可以看作重復(fù)性觀測。

g2(τ,q)≡〈I(τ,q)I(0,q)〉/〈I(0,q)〉

式中Γ為反映散射光頻移程度的線寬，由線寬可得到平移擴散系數(shù)D

D=Γ/q2

依據(jù)Stokes-Einstein公式，即可得到溶液中高分子的流體力學(xué)半徑Rh

Rh=kBT/(6πη0D)

式中，kB為波爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，η0為溶劑粘度，D為平移擴散系數(shù)。在25 ℃時，水的折射率為1.333，粘度為1.002 MPa·s。樣品在含100 mL水的測定裝置中稀釋，當(dāng)濃度達到8%時開始測定。在粒度分布中平均容量直徑

其中ni為脂肪球在一個直徑數(shù)量級di的個數(shù)。多分散指數(shù)

1.3 共聚焦拉曼光譜

不同品種的天然脂肪球的脂質(zhì)成分根據(jù)Gallier等的方法進行改進后用共聚焦拉曼光譜測定[10]。

原料乳在3 000 g下離心5 min，收集頂層脂肪層在模擬乳超濾液中分散使其含20%的脂肪含量，再稀釋十倍。在共聚焦拉曼光譜的測定和光譜信號的收集中，樣品必須保持靜止?fàn)顟B(tài)。稀釋的脂肪樣品(25 μL)置于凹形載玻片中，加入50 μL的低熔點瓊脂糖(0.5%,w/v)以固定樣品，后迅速輕緩地蓋上一片蓋玻片。

JY-T64000拉曼散射儀(JY公司, 法國)用來收集拉曼光譜信號。二極管激光器的激發(fā)波長為532 nm，物鏡處功率5 mW，每毫米1 200槽光柵。測定時采用較低的激光功率以避免樣品過熱從而改變液態(tài)/結(jié)晶態(tài)脂肪的比例。光譜區(qū)域記錄為500～3 500 cm-1，各頻譜每10 s曝光一次，室溫下測定。各峰的強度測定信號均為相同大小的3個脂肪球的平均強度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有分析測量均重復(fù)兩次。單因素方差分析采用Duncan新復(fù)極差法(p<0.05)，用SPSS軟件(版本16.0，SPSS公司)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種牛乳天然乳脂肪球的粒徑分布

不同品種的牛乳脂肪球粒徑分布圖如圖1所示。在黑白花牛乳和牦牛乳中，10 μm以下的脂肪球占脂肪總體積的絕大部分，且牦牛乳脂肪球粒徑分布較為集中(3.5～4.6 μm)，而水牛乳的脂肪球直徑則較為分散，從1～18 μm不等，這個結(jié)果也可以從表1中多分散指數(shù)中看出。

Fig.1 Size distribution of native milk fat globules of varions breeds

Table 1 Volume mean diameter (d43), polydispersity indices (PDI) and specific surface area (S) of bovine, buffalo and yak native milk fat globule

d43/μmPDIS/(m2·g-1)黑白花牛乳3.87±0.07a1.124±0.15b1.818±0.017a水牛乳4.89±0.12b1.423±0.26c1.600±0.021b牦牛乳4.39±0.05c0.865±0.08a1.670±0.012c

注：采用Duncan分析法，同行數(shù)據(jù)標(biāo)注有不同上標(biāo)字母者表示有顯著差異(p<0.05)

如表1所示，水牛乳的粒徑大于牦牛乳也大于黑白花牛乳，脂肪球的比表面積則成相反趨勢。因為較小的比表面積有利于脂肪的消化[11]。由此可以推斷，黑白花牛乳的脂肪球最易于消化。

2.2 不同品種的天然脂肪球化學(xué)指紋圖譜比較

主要的拉曼峰和信息根據(jù)Gallier等的研究結(jié)果識別[10]。為保證所觀測不同品種牛乳的脂肪球粒徑保持一致，研究分別選取4和9 μm的脂肪球進行觀測比較。如圖2和圖3所示，不同品種乳脂肪球之間脂質(zhì)含量的差異顯著。

Fig.2 Raman spectra of bovine, buffalo and yak native milk fat globules with a diameter of 4M(a.u., arbitrary unit)

Fig.3 Raman spectra of bovine, buffalo and yak native milk fat globules with a diameter of 9 μm(a.u., arbitrary unit)

乳脂肪在40 ℃以上是液體狀態(tài)，而在-40 ℃下處于絕對的固體狀態(tài)[14]。因此，在實驗溫度(20 ℃)下，乳脂肪是一種液態(tài)和晶態(tài)共同存在的混合狀態(tài)。1 064和1 081 cm-1的信號條帶(圖3)和在2 850和2 885 cm-1的信號條帶(圖2和圖3)分別代表了C—C和C—H基團的移動性[15]。拉伸區(qū)域的非對稱性伸展振動與結(jié)晶相對應(yīng)，而對稱拉伸振動控制其液晶相[16]。2 885/2 850 cm-1的比例越高，表明脂肪球膜更多的處于結(jié)晶態(tài)并緊密排布，而脂內(nèi)核更多的處于液態(tài)[17]。不同品種脂肪球在2 885/2 850 cm-1條帶的信號比值如圖4所示，顯現(xiàn)出該比值隨黑白花牛乳、水牛乳、牦牛乳依次增大的趨勢。因此可以推斷，牦牛乳的脂肪球膜流動性比水牛乳和黑白花牛乳低，而甘油三酯內(nèi)核的流動性則高于后兩者，即牦牛乳的脂肪球趨于形成結(jié)晶態(tài)脂肪球膜包裹流動態(tài)甘油三酯內(nèi)核的結(jié)構(gòu)，而黑白花牛乳更易于形成一個流動態(tài)脂肪球膜包裹著結(jié)晶態(tài)甘油三酯內(nèi)核的結(jié)構(gòu)，水牛乳的結(jié)構(gòu)變化趨勢介于兩者之間。根據(jù)這一特性可知，用牦牛乳分離而得的稀奶油在熔化時較其他牛乳脂肪球難熔化，攪拌耗時更多，但形成的黃油更加柔軟。

Fig.4 Quantitative evaluation of the fluid state of native milk fat globules of various breeds and sizes

注：采用Duncan分析法，在同一系列數(shù)據(jù)中，a—c，a′—c′相同則表示差異不顯著，不同則表示差異顯著(p<0.05)

Fig.5 Quantitative evaluation of the unsaturation level of native milk fat globules of various breeds and sizes

注：采用Duncan分析法，在同一系列數(shù)據(jù)中，a—c，a′—c′相同則表示差異不顯著，不同則表示差異顯著(p<0.05)

此外，乳脂肪球中的脂肪酸鏈長可以用I1 440/I1 746或I1 460/I1 746來判斷，這兩個比值和鏈中CH2的數(shù)量成正比[18]。I1 440∶I1 746定量分析結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯? μm粒徑的黑白花牛乳的該比值大于牦牛乳，水牛乳的鏈長最?。欢? μm的大脂肪球中，水牛乳的脂肪酸鏈長則大于其他兩種牛乳，黑白花牛乳仍高于牦牛乳。該比值還會隨脂肪球大小的變化而不同。三種牛乳的1 440和1 746 cm-1信號峰比值都隨著脂肪球粒徑的增加而增加，這表明長鏈脂肪酸在較大脂肪球中所占比例更高。這一結(jié)果也和此前學(xué)者用氣相色譜法得到的結(jié)果相同，即與大脂肪球相比，小脂肪球脂質(zhì)內(nèi)核中的月桂酸等中鏈脂肪酸更多，而硬脂酸等長鏈脂肪酸則明顯較少[19-20]?？傊?，黑白花牛乳中的長鏈脂肪酸比例高于牦牛乳，而水牛乳的脂肪酸鏈長受粒徑影響較大。

Fig.6 Quantitative evaluation of the chain length of native milk fat globules of various breeds and sizes

注：采用Duncan分析法，在同一系列數(shù)據(jù)中，a—c，a′—c′相同則表示差異不顯著，不同則表示差異顯著(p<0.05)

3 結(jié) 論

盡管乳脂肪球具有非常重要的意義，但關(guān)于其各組分的具體組成和功能特性仍知之甚少。乳品種不同影響著脂肪球的物理化學(xué)性質(zhì)，進而對乳制品特性有著至關(guān)重要的作用，尤其是黃油、奶油和干酪等高脂乳制品。本研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的天然脂肪球，其脂質(zhì)組分存在差異。牦牛乳脂肪球趨于形成結(jié)晶態(tài)脂肪球膜包裹流動態(tài)甘油三酯內(nèi)核的結(jié)構(gòu)，飽和程度也比黑白花牛乳要低。而水牛乳由于高脂、脂肪球粒徑大的特點，因此特別適用于奶油的加工。通過了解不同品種脂肪球的特性差異，能夠在制作對產(chǎn)品品質(zhì)及加工性能有特殊需求的乳制品時，為原料選擇提供理論依據(jù)，同時有助于對工藝流程的控制。

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*Corresponding author

Lipid Composition of Different Breeds of Milk Fat Globules by Confocal Raman Microscopy

LUO Jie1, WANG Zi-wei2, SONG Jun-hong3, PANG Rui-peng4，REN Fa-zheng1*

1. Key Laboratory of Functional Dairy, China Agricultural University, Beijing 100083, China

2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product, Beijing 100083, China

3. Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 100083, China

4. Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao 066000, China

Different breeds of cows affect the form of fat exist in dairy products and the final functionality, which depended mainly on the composition of the milk fat globules(MFG). However, the relationship between the composition and breeds has not been illuminated. In our study, differences in the lipid content and fatty acid composition of native bovine, buffalo and yak MFG were investigated by confocal Raman spectroscopy. The research offers the possibility of acquisition and analysis of the Raman signal without disruption of the structure of fat globule. The results showed that yak MFG had a higher ratio of band intensities at 2 885/2 850 cm-1, indicating yak MFG tend to have a triglyceride core in a fluid state with a milk fat globule membrane in a crystalline state. The buffalo and yak MFG had a higher level of unsaturation compared to bovine MFG, shown by a higher ratio of band intensities at 1 655/1 744 cm-1. The results indicate that small MFG of buffalo is more unsaturated than yak, while the large MFG of buffalo is less unsaturated than the yak. Thus, selective use of cream with yak MFG would allow a harder and more costly churning process but lead to a softer butter. Buffalo milk which contains larger MFG is more suitable for cream and MFG membrane separation.

Milk fat；Breed；Confocal Raman spectroscopy；Lipid composition

Sep. 1, 2014; accepted Jan. 20, 2015)

2014-09-01，

2015-01-20

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(2015SP001)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD12B08)資助

羅 潔，女，1987年生，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部功能乳品重點實驗室博士研究生 e-mail：lizzyj925@hotmail.com 通訊聯(lián)系人 e-mail：renfazheng@263.net

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0125-05